張海航，曾江正，朱 旭，孫華茂，楊 璐，付 裕，盧彥達(dá)

（1.海南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科，海南 ?？?570102；2.海南醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)學(xué)信息與工程學(xué)院，海南 海口 571199）

肝細(xì)胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界上最常見的惡性腫瘤之一，也是主要的癌癥致死原因［1，2］。在中國(guó)，由于乙型肝炎病毒（hepatitis B vi?rus，HBV）或 丙 型 肝 炎 病 毒（hepatitis C virus，HCV）感染引起慢性肝炎及肝硬化是HCC 的主要危險(xiǎn)因素［3，4］。盡管各種臨床治療手段不斷用于肝癌的治療，但是大多數(shù)HCC 患者的復(fù)發(fā)率高且預(yù)后不佳，總體生存期（overall survival，OS）僅有3%～5%［5］。一方面是由于肝癌的高度異質(zhì)性，另一方面是由于HCC 發(fā)生、發(fā)展的生物學(xué)過程十分復(fù)雜。目前為止，甲胎蛋白是肝癌最廣泛使用的生物標(biāo)志物，由于甲胎蛋白可靠性差，因此需尋找新的HCC預(yù)后相關(guān)分子標(biāo)志物，對(duì)肝癌的診斷、預(yù)后和治療具有重要意義［6，7］。

HCC 的發(fā)生和發(fā)展不僅涉及DNA 編碼的遺傳基因突變，還與表觀遺傳調(diào)控基因的異常積累、腫瘤基因的激活及抑癌基因的失活與丟失有關(guān)［8］。與基因改變相反，表觀遺傳調(diào)控是一種不涉及DNA序列改變的基因表達(dá)和調(diào)控。例如通過miRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控、共價(jià)組蛋白修飾和DNA 甲基化來影響基因的染色質(zhì)結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄［9，10］。雖然無法逆轉(zhuǎn)基因改變，但表觀遺傳修飾是一個(gè)動(dòng)態(tài)和可逆的過程［11］。目前HCC 研究所要解決的問題是這些DNA編碼的遺傳基因和表觀遺傳變化的異質(zhì)性和復(fù)雜性之間的機(jī)理及對(duì)患者預(yù)后的影響。分析復(fù)雜的遺傳和表觀遺傳變化與HCC 發(fā)展的機(jī)制有助于尋找有效的治療方法。

雖然，近年來表觀遺傳的研究取得了很大進(jìn)展，已經(jīng)開發(fā)出了針對(duì)表觀遺傳調(diào)節(jié)蛋白的各種藥物，這些蛋白能夠?qū)盒园┘?xì)胞恢復(fù)正常狀態(tài)［12］。然而，大多數(shù)研究多集中于單一的表觀遺傳方面，仍然缺乏評(píng)估與miRNA 轉(zhuǎn)錄后調(diào)控的表觀遺傳基因在HCC 預(yù)后關(guān)系方面的研究。因此，探究HCC中miRNA 靶向的表觀因子的調(diào)控關(guān)系，識(shí)別預(yù)后顯著相關(guān)的表觀因子，可以為HCC 中表觀遺傳基礎(chǔ)研究提供新思路。

1 資料與方法

1.1 HCC 中差異基因的篩選

從TCGA 數(shù) 據(jù) 庫(kù)（https：//portal.gdc.cancer.gov/）下載371 例HCC 樣本和50 例正常肝組織樣本的RNA 測(cè)序數(shù)據(jù)以及372 例HCC 樣本和50 例正常肝組織樣本的miRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)。利用R 程序比較HCC 樣本和正常肝組織樣本的基因表達(dá)水平，根據(jù)∣log2FC ∣>1 且FDR<0.05 為 標(biāo) 準(zhǔn)，篩 選 差 異 表 達(dá)miRNA 和mRNA。

1.2 構(gòu)建miRNA?DEEFs 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)

從TCGA 數(shù)據(jù)庫(kù)下載所有樣品的臨床資料，并將整理好的臨床資料與差異分析miRNA 整合成一個(gè)矩陣，使用單因素COX 分析獲得預(yù)后顯著的差異miRNA，多因素COX 分析采用逐步回歸法，最后成功建立了將HCC 患者分為高危和低危兩組的風(fēng)險(xiǎn)回歸預(yù)測(cè)模型。通過在線數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)模型中miR?NA 的靶基因。此外，從表觀因子數(shù)據(jù)庫(kù)下載所有的表觀因子，然后與miRNA 靶基因取交集，識(shí)別出模型中miRNA 靶向的表觀因子。HCC 中miRNA靶向的表觀因子與差異表達(dá)的mRNA 取交集篩選出DEEFs。根據(jù)miRNA 對(duì)靶基因的調(diào)控機(jī)制，最終成功構(gòu)建了miRNA 和DEEFs 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.3 DEEFs 的富集分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

使用“clusterProfiler”R 軟件包（3.14.3 版）［13］對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的DEEFs 進(jìn)行基因本體論（gene ontolo?gy，GO）分析、京都基因和基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）途徑分析，GO 分析揭示了DEEFs 在生物過程、細(xì)胞組成和分子功能中的作用，KEGG 分析顯示了DEEFs 的富集途徑。使用STRING 工具構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)，探索表觀遺傳基因相互作用［14］。此外，使用Cytoscape 軟件（版本3.7.1）［15］及CytoHubba 插件選擇核心基因。

1.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型和臨床特征的綜合分析

為了進(jìn)一步探討預(yù)測(cè)模型中miRNA 與肝細(xì)胞癌臨床特征的相關(guān)性，在單因素COX 比例危險(xiǎn)回歸分析找出影響OS 率的關(guān)鍵臨床指標(biāo)，選擇P<0.05的臨床指標(biāo)然后進(jìn)行多因素COX 比例危險(xiǎn)回歸分析，確定風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型能否獨(dú)立預(yù)測(cè)預(yù)后。繪制單因素回歸分析及多因素回歸分析的森林圖，研究臨床指標(biāo)的價(jià)值和風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型在臨床實(shí)踐中的潛在應(yīng)用。

1.5 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中DEEFs 的生存分析

首先對(duì)下載的臨床資料進(jìn)行整理，刪除肝細(xì)胞癌臨床信息中無OS 或OS 低于30 d 的病例，然后，將患者生存時(shí)間、生存狀態(tài)與HCC 中差異表達(dá)mRNA 測(cè)序數(shù)據(jù)合并。使用Kaplan-Meier（K-M）法分析網(wǎng)絡(luò)中表觀因子與HCC 預(yù)后的關(guān)系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)通過R 軟件包（版本3.6.3）、Perl 腳本工具進(jìn)行分析處理。連續(xù)變量使用t檢驗(yàn)和方差分析（ANOVA），分類變量使用Pearson 的卡方檢驗(yàn)和Fisher 精確檢驗(yàn)來檢測(cè)統(tǒng)計(jì)差異。當(dāng)P<0.05 表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HCC 測(cè)序數(shù)據(jù)的差異分析

從腫瘤基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫(kù)中獲得HCC 的RNA-seq 數(shù)據(jù)，下載時(shí)間為2020-10-18，其中原發(fā)性肝細(xì)胞癌374 例（3 例為復(fù)發(fā)腫瘤樣本），其中包括371 例初治HCC 樣本和50 個(gè)正常組織的mRNA 的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，同時(shí)下載包括原發(fā)性肝細(xì)胞癌375 例（3 例為復(fù)發(fā)腫瘤樣本），其中包括372 例初治HCC 樣本和50 個(gè)正常組織的miRNA 的表達(dá)譜數(shù)據(jù)，所有腫瘤樣本來源于未經(jīng)治療之前?；虿捎胓encode.v22.annotation.gtf.gz 探針注釋，如有多個(gè)探針對(duì)應(yīng)同一基因則取平均值?；虮磉_(dá)量標(biāo)準(zhǔn)化形式采用log2（TPM+1）。本研究所涉及的所有數(shù)據(jù)從TCGA 下載，數(shù)據(jù)采集和應(yīng)用均按照TC?GA 發(fā)布指南和數(shù)據(jù)訪問策略進(jìn)行，不需要倫理審查。差異分析使用R（3.6.3 版）上BioConductor 中的“edge”R 軟件包［16］來執(zhí)行，根據(jù)（LogFC>=1，F(xiàn)DR<0.05）篩選出差異表達(dá)的mRNA 的測(cè)序數(shù)據(jù)，選擇高低表達(dá)的25 差異表達(dá)的mRNA 通過聚類分析繪制熱圖（圖1A）。在mRNA 中上調(diào)基因4 815 個(gè)，下調(diào)基因1 367 個(gè)的組間差異通過繪制火山圖展示（圖2A）。同樣方法對(duì)miRNA 表達(dá)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行差異分析，分別選擇高低表達(dá)的25 差異表達(dá)的miRNA 通過聚類分析繪制熱圖（圖1B），其中上調(diào)基因257 個(gè)，下調(diào)基因48 個(gè)并繪制火山圖（圖2B）。

圖1 HCC 中差異表達(dá)的mRNA 和miRNA 的熱圖Fig 1 Heatmap of differentially expressed mRNA and miRNA in HCC

圖2 HCC 中差異表達(dá)mRNA 和miRNA 的火山圖Fig 2 Volcanic plots of differentially mRNA and miRNA in HCC

2.2 預(yù)測(cè)模型的構(gòu)建與選擇

通過以上方法獲得候選miRNA 后，使用計(jì)算機(jī)生成的隨機(jī)數(shù)將整個(gè)TCGA-HCC 數(shù)據(jù)集（n=343）分為訓(xùn)練集（172 例）和測(cè)試集（171 例）。接著對(duì)HCC 患者的臨床資料進(jìn)行整理，刪除無OS 或OS 低于30 d 的病例，然后，將患者生存時(shí)間、生存狀態(tài)與差異miRNA 表達(dá)數(shù)據(jù)合并。在訓(xùn)練集中進(jìn)行模型構(gòu)建，然后應(yīng)用于測(cè)試集、整個(gè)TCGA-HCC數(shù)據(jù)集以進(jìn)行最佳模型選擇。使用單因素COX 分析，根據(jù)P<0.01 選擇與肝細(xì)胞癌的整體生存（OS）具有預(yù)后價(jià)值的miRNA。多因素Cox 回歸分析在訓(xùn)練集中建立了一個(gè)效果良好且穩(wěn)定的基于3 個(gè)miRNA 的預(yù)測(cè)模型（表1）。

表1 HCC 預(yù)后模型中相關(guān)的miRNA 列表Tab 1 List of related miRNAs in the prognostic model of HCC

Kaplan-Meier（K-M）生存曲線提示miR-7-5p 的HR>1，是高風(fēng)險(xiǎn)miRNA，隨著miR-7-5p 表達(dá)量的增加，患者的預(yù)后危險(xiǎn)性逐漸增加（圖3C）；相反，miR-139-5p 和miR-101-3p 的HR<1，是 低 風(fēng) 險(xiǎn)miRNA，隨著它們表達(dá)水平的增加，患者的預(yù)后危險(xiǎn)性逐漸降低（圖3A、B）。多因素Cox 回歸的逐步加權(quán)相關(guān)系數(shù)如下：生存風(fēng)險(xiǎn)分值=（-0.293 71×ExpmiR-139-5p）+（-0.247 25×ExpmiR-101-3）+（0.376 329×ExpmiR-7-5p）。根據(jù)肝細(xì)胞癌患者風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分值的中位數(shù)，把訓(xùn)練組的患者分為高低表達(dá)兩組，高風(fēng)險(xiǎn)組（n=86 例）患者的OS 比低風(fēng)險(xiǎn)組（n=86 例）更差（圖4A）。筆者使用時(shí)間相關(guān)ROC 評(píng)估風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型的可靠性，曲線下面積（AUC 值）為0.742（圖5A），說明預(yù)測(cè)模型在生存監(jiān)測(cè)中取得了很好準(zhǔn)確性。同時(shí)風(fēng)險(xiǎn)分?jǐn)?shù)曲線、生存狀況和表達(dá)模式顯示兩組患者的評(píng)分較低的患者通常比風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者預(yù)后更好（圖6A）。進(jìn)一步證明預(yù)測(cè)模型的準(zhǔn)確性。

圖3 HCC 中與預(yù)后相關(guān)的差異表達(dá)miRNA 的Kaplan-Meier 生存曲線Fig 3 Kaplan-Meier survival curves of differentially expressed miRNA associated with prognosis in HCC

2.3 評(píng)估預(yù)測(cè)模型

為進(jìn)一步證實(shí)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型，在測(cè)試集和整個(gè)TCGA-HCC 數(shù)據(jù)集上驗(yàn)證，該模型成功地把測(cè)試集（n=171，P=6.561e-03）的HCC 患者分為高風(fēng)險(xiǎn)組（n=90）和低風(fēng)險(xiǎn)組（n=81），并在OS 方面存在顯著差異（圖4B），隨時(shí)間變化的ROC 分析表明，該模型對(duì)測(cè)試組HCC 患者的預(yù)測(cè)中表現(xiàn)良好。該組的RUC 值為0.757（圖5B），同樣，在整個(gè)TCGAHCC 數(shù)據(jù)集（n=343，P=8.273e-06）上驗(yàn)證顯示，與低風(fēng)險(xiǎn)組患者（n=167）相比，高風(fēng)險(xiǎn)組患者（n=176）的OS 較差（圖4C）。隨時(shí)間變化的ROC 分析表明，該模型對(duì)整個(gè)TCGA-HCC 數(shù)據(jù)集的HCC 患者也有良好的預(yù)測(cè)表現(xiàn)。該組的RUC 值為0.757，（圖5C）。在測(cè)試集和整個(gè)TCGA-HCC 數(shù)據(jù)集中的風(fēng)險(xiǎn)得分、生存狀態(tài)和表達(dá)模式的分布也顯示出與訓(xùn)練組一致的結(jié)果，風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較高的患者存活率低于風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分較低的患者（圖6B、C）。結(jié)果不僅證明了高低風(fēng)險(xiǎn)的肝細(xì)胞癌患者在生存時(shí)間和風(fēng)險(xiǎn)程度上存在顯著差異，而且也證明了風(fēng)險(xiǎn)模型的準(zhǔn)確性。

圖4 HCC 中與預(yù)后相關(guān)miRNA 風(fēng)險(xiǎn)模型的Kaplan-Meier 生存曲線Fig 4 Kaplan-Meier survival curve of miRNA risk model related to prognosis in HCC

圖5 HCC 中miRNA 風(fēng)險(xiǎn)模型預(yù)測(cè)患者預(yù)后方面準(zhǔn)確性的ROC 生存分析Fig 5 Receiver operating characteristic（ROC）curve analysis on the accuracy of miRNA risk models in HCC to predict the prognosis of patients

圖6 HCC 患者的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分、生存狀態(tài)和基因表達(dá)譜熱圖Fig 6 Risk score，survival status and gene expression profile heatmap of HCC patients

2.4 風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型和臨床特征的綜合分析

評(píng)估預(yù)測(cè)的miRNA（miR-139-5p、miR-101-3p和miR-7-5p）相互作用是否與HCC 患者的總體存活率相關(guān)。首先，根據(jù)miRNA 的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分將HCC患者樣本被分為高表達(dá)組和低表達(dá)組，然后，確定預(yù)測(cè)信號(hào)的預(yù)后價(jià)值是否獨(dú)立于HCC 患者的其他臨床病理變量。選定的變量包括年齡、性別、病理TNM 分期、病理分級(jí)和AJCC 分期和我們的風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分進(jìn)行單因素和多因素Cox 回歸分析。結(jié)果表明該預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分模型是HCC 患者的獨(dú)立預(yù)后因素（圖7）。綜上所述，預(yù)測(cè)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)分對(duì)于HCC 患者預(yù)后的預(yù)測(cè)獨(dú)立于其他臨床特征。

圖7 HCC 中miRNA 風(fēng)險(xiǎn)模型和患者的臨床病理變量的預(yù)后準(zhǔn)確性評(píng)估Fig 7 Evaluation of the prognostic accuracy of miRNA risk models and patients'clinicopathological variables in HCC

2.5 肝細(xì)胞癌中miRNA-DEEFs 調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

通 過miRTarBase、TargetScan 和miRDB 數(shù) 據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)模型中miRNA 的靶基因，總共獲得了21 763對(duì)miRNA-靶基因。首先從表觀因子數(shù)據(jù)庫(kù)獲得720 個(gè)表觀因子（EpiFactors database（http：//epifac?tors.autosome.ru/）與miRNA 靶基因取交集，識(shí)別出模型中miRNA 靶向的533 個(gè)表觀因子。然后，把HCC 中miRNA 靶向的表觀因子與差異表達(dá)的mRNA 取交集篩選出63 個(gè)DEEFs。其中34 個(gè)表觀因子與miRNA 的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（8 個(gè)下調(diào)靶基因，26 個(gè)上調(diào)靶基因）。最終，基于HCC 中預(yù)后相關(guān)的3 個(gè)miRNA 和34 個(gè)差異表達(dá)的表觀遺傳因子，構(gòu)建一個(gè)miRNA-DEEFs 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)（圖8）。

圖8 篩選分析得到HCC 中miRNA?DEEFs 網(wǎng)絡(luò)圖Fig 8 Screening and analysis to obtain the miRNA?DEEFs network diagram in HCC

2.6 DEEFs 的功能富集分析和蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)

對(duì)miRNA 靶向的DEEFs 進(jìn)行GO 富集分析，GO 富集由三個(gè)部分組成：生物學(xué)過程（biological process，BP）、細(xì)胞成分（cellular component，CC）和分子功能（molecular function，MF）。生物學(xué)過程的前三個(gè)GO 術(shù)語(yǔ)是共價(jià)染色質(zhì)修飾、組蛋白修飾和肽基賴氨酸修飾，細(xì)胞成分的前三個(gè)GO 項(xiàng)是染色體區(qū)域、核染色質(zhì)和染色體，著絲粒區(qū)，分子功能的前三個(gè)GO 術(shù)語(yǔ)是甲基轉(zhuǎn)移酶活性、轉(zhuǎn)移酶活性，轉(zhuǎn)移一碳基團(tuán)和S-腺苷甲硫氨酸依賴性甲基轉(zhuǎn)移酶活性（圖9A）。KEGG 富集結(jié)果證實(shí)癌癥中的賴氨酸降解和MicroRNAs 是最顯著的富集途徑（圖9B）。GO 和KEGG 的富集表明，預(yù)測(cè)的目標(biāo)基因與表觀遺傳因子的調(diào)控密切相關(guān)。主要影響染色質(zhì)的共價(jià)修飾、組蛋白修飾和肽基賴氨酸修飾、甲基轉(zhuǎn)移酶活性、賴氨酸降解和miRNA 表達(dá)后的調(diào)控。為了進(jìn)一步探究表觀因子之間的相互作用，使用蛋白相互作用（Protein-protein interaction net?work，PPI）分 析 的 搜 索 工 具（STRING，https：//string-db.org/）［圖10A］構(gòu)建miRNA 靶向的表觀因子PPI 網(wǎng)絡(luò)，使用Cytoscape 軟件（版本3.7.1）及Cy?toHubba 插件選擇核心基因進(jìn)行可視化（圖10B）。

圖9 HCC 中miRNA 調(diào)控的表觀因子的富集分析結(jié)果Fig 9 Enrichment analysis of miRNA regulated epigenetic factors in HCC

圖10 差異表觀因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)Fig 10 Regulatory network of differential apparent factors

2.7 miRNA 靶向調(diào)控的DEEFs 的生存分析

Kaplan?Meier（K-M）法分析miRNA 靶向 調(diào)控的表觀因子表達(dá)水平與HCC 預(yù)后的關(guān)系。在HCC中miR-139-5p、miR-101-3p 表達(dá)水平減低時(shí)，其調(diào)控的表觀因子（EZH2、PKM、HJURP 和CHEK1）高表達(dá)與較差的預(yù)后相關(guān)。表明這些表觀因子可能起到致癌作用（圖11A～D）。雖然本文已經(jīng)證實(shí)miR-7-5p 高表達(dá)預(yù)示著HCC 患者的預(yù)后較差，但在本研究K-M 生存分析中沒有發(fā)現(xiàn)miR-7-5p 靶向調(diào)控的表觀因子對(duì)肝細(xì)胞癌患者預(yù)后有抑癌的影響。

圖11 HCC 中差異表觀因子的Kaplan-Meier 生存曲線Fig 11 Kaplan Meier survival curve of different apparent factors in HCC

3 討論

腫瘤中的miRNA 表達(dá)特征與正常組織不同，也因腫瘤類型而異。在HCC 中經(jīng)常觀察到miRNA表達(dá)的增加，這些上調(diào)的miRNA 在HCC 中充當(dāng)致癌miRNA［17］。因此，當(dāng)miRNA 的調(diào)控解除時(shí)可以影響腫瘤細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移，可能是腫瘤抑制基因的目標(biāo)［18］。顯然，miRNA 內(nèi)源性表達(dá)的改變是肝癌發(fā)生的重要機(jī)制?？紤]到miRNA 通過轉(zhuǎn)錄后對(duì)表觀遺傳調(diào)控的協(xié)同作用，我們?cè)噲D通過整合分析來研究miRNA 與靶向表觀因子在HCC 中的影響。最終通過構(gòu)建一個(gè)miRNA 靶向的表觀因子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，綜合分析miRNA 轉(zhuǎn)錄后對(duì)表觀遺傳調(diào)控的協(xié)同作用，結(jié)果得出miR-139-5p、miR-101-3p 和miR-7-5p 與HCC 預(yù)后顯著相關(guān)。此外，對(duì)miRNA靶向的表觀因子進(jìn)行生存分析發(fā)現(xiàn)EZH2、PKM、HJURP 和CHEK1 對(duì)肝細(xì)胞癌生存有顯著影響。

研究表明，miR-139-5p 在不同的器官中具有抗癌功效，miR-139-5p 高表達(dá)與較好的預(yù)后有關(guān)［19］。我們通過對(duì)HCC 測(cè)序數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)肝癌組織中miR-139-5p 相比正常組織中是顯著上調(diào)的miRNA。而miR-139-5p 的過表達(dá)可以通過增加SLITRK4 通路表達(dá)來減少HCC 細(xì)胞的入侵和增殖能力［20］，表明miR-139-5p 將成為肝細(xì)胞癌治療的有效靶點(diǎn)。有證據(jù)表明miR-139-5p 調(diào)控的表觀遺傳因子HJURP高表達(dá)，促進(jìn)了HCC 細(xì)胞的增殖，臨床上，HJURP高表達(dá)與HCC 個(gè)體的不利預(yù)后相關(guān)［21］。PKM 在肝癌中的作用是增強(qiáng)糖解促進(jìn)HCC 進(jìn)展，主要機(jī)制是抑制了HCC 葡萄糖代謝重新編程、細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移［22，23］。因 此，PKM 的 高 表 達(dá) 促 進(jìn)HCC 中 進(jìn) 展。在本研究中，證實(shí)miR-139-5p 和靶向調(diào)控表觀遺傳因子HJURP 和PKM 在人類肝細(xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展中起到重要作用。因此，新識(shí)別的表觀遺傳因子HJURP 和PKM 可能成為肝細(xì)胞癌治療的新靶點(diǎn)。

此外，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）可以通過抑制其啟動(dòng)子的活性來抑制miR-101-3p 表達(dá)，在HCC 中miR-101-3p 相比正常組織明顯低表達(dá)［24］。而特定miR-101-3p 抑制劑能增強(qiáng)HCC 的細(xì)胞 增 殖、轉(zhuǎn) 移 和 入 侵 能 力［25，26］。miR-101-3p 靶 向 的表觀因子EZH2 在HCC 中是最顯著地解除調(diào)節(jié)之一，EZH2 的上調(diào)與HCC 進(jìn)展和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［27］。此外，肝細(xì)胞癌中CHEK1 過表達(dá)導(dǎo)致HCC 患者的整體存活率（OS）較差［28］。在本研究中，HCC 中miRNA-101-3p 表達(dá)上調(diào)且患者預(yù)后較差。此外，其靶向表觀因子EZH2 和CHEK1 表達(dá)上調(diào)患者預(yù)后較差，證實(shí)miR-101-3p 和靶向調(diào)控表觀遺傳因子EZH2 和CHEK1 在人HCC 的病因中具有重要作用。

本研究中miR-7-5p 的發(fā)現(xiàn)擴(kuò)展了在癌癥發(fā)展過程中對(duì)轉(zhuǎn)錄后表觀因子調(diào)控的認(rèn)識(shí)。眾所周知，miR-7-5p 可以直接被長(zhǎng)非編碼RNA（lncRNA）RUSC1-AS1 結(jié)合，促進(jìn)HCC 細(xì)胞的增殖并減少凋亡。在肝細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)可以促進(jìn)HCC 在體內(nèi)發(fā)生和發(fā)展［29］，這意味著miR-7-5p 在肝細(xì)胞癌發(fā)展過程中起到至關(guān)重要的作用。雖然，沒有發(fā)現(xiàn)miR-7-5p 靶向表觀因子與HCC 預(yù)后顯著相關(guān)。但是，我們推測(cè)它們?cè)诟渭?xì)胞癌的發(fā)生、發(fā)展過程中的作用不可忽視。

雖然在調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)編碼基因表達(dá)中認(rèn)識(shí)到miRNA 的重要性，目前miRNA 的精確功能仍然難以確定。但是，miRNA 在人類致癌物質(zhì)中卻起著重要的作用。大量的研究發(fā)現(xiàn)miRNA 可以協(xié)同作用于靶基因，關(guān)注miRNA 與靶基因之間的相互作用可能更真實(shí)地捕捉到肝癌的潛在病理機(jī)制。在本研究中，成功構(gòu)建的miRNA 靶向DEEFs 的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示了在HCC 中存在差異表達(dá)的miRNA 與HCC 預(yù)后關(guān)系。其中與腫瘤抑制劑相關(guān)的miR-139-5p 和miR-101-3p 在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中被降低表達(dá)，可能是潛在的治療靶點(diǎn)。相反，與癌癥基因相關(guān)的miR-7-5p 高表達(dá)可能促進(jìn)HCC 的進(jìn)展。在正常細(xì)胞中miRNA 調(diào)節(jié)各種生物過程受到嚴(yán)格監(jiān)控［30］。 每個(gè)miRNA 都有可能通過各種調(diào)節(jié)器獨(dú)立控制表觀遺傳調(diào)控［31-33］。 因此，構(gòu)建miR?NA 靶向差異表觀因子的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，揭示了肝細(xì)胞癌表觀遺傳學(xué)上復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，有助于加深HCC中miRNA 對(duì)表觀遺傳基因調(diào)控機(jī)制的研究。

作者貢獻(xiàn)度說明：

實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：張海航、盧彥達(dá)。實(shí)驗(yàn)實(shí)施：張海航、曾江正、朱旭、孫華茂、楊璐、付裕。實(shí)驗(yàn)評(píng)估：張海航。審校：盧彥達(dá)。