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      哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的結(jié)構(gòu)分析

      2022-07-05 07:49:26屈奇奇李昊然
      韶關(guān)學(xué)院學(xué)報 2022年6期
      關(guān)鍵詞:天冬氨酸木霉殘基

      柯 野,屈奇奇,李昊然

      (韶關(guān)學(xué)院 英東生物與農(nóng)業(yè)學(xué)院,廣東 韶關(guān) 512005)

      生物防治是利用生物物種間的相互作用,以一種或一類生物抑制另一種或另一類生物.生物防治不會污染環(huán)境,可避免大量使用化學(xué)農(nóng)藥帶來的一系列環(huán)境、植保和能源方面的問題[1].木霉(Trichoderma)作為生物防治菌劑,廣泛地應(yīng)用到生產(chǎn)實踐中.最早對木霉菌的研究報道可追溯到1794年.隨著深入地研究,目前已發(fā)現(xiàn)木霉屬有150多種[2],并且其很多種都應(yīng)用于生物防治生產(chǎn)之中.木霉菌能應(yīng)用于生物防治主要是由于重寄生和產(chǎn)生抗生素的作用.重寄生利用木霉的酶系統(tǒng)識別、滲透、酶解病原菌寄主的細胞壁以此獲得營養(yǎng)[3],從而致死病原菌.為了掌握木霉重寄生過程的酶學(xué)機理,研究者對其產(chǎn)生的幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶和幾丁質(zhì)脫乙?;傅确矫孀隽溯^多的研究,并且將這些酶的基因序列、酶學(xué)特性、構(gòu)效關(guān)系和應(yīng)用也進行了系統(tǒng)性研究[4],但是對木霉產(chǎn)生的胞外蛋白酶研究未引起重視.

      近年來,研究發(fā)現(xiàn)木霉產(chǎn)生的蛋白酶系對其重寄生具有重要的作用,但對其作用機理尚未見深入的研究報道.2005 年,Suárez M B 等人在對T.harzianumCECT 2413 胞外蛋白組學(xué)研究過程中,分離到一個天冬氨酸內(nèi)肽蛋白酶P6281,并獲得了其結(jié)構(gòu)基因序列[5].2009年Samolski利用芯片(microarray)技術(shù)發(fā)現(xiàn)在添加幾丁質(zhì)的培養(yǎng)基中,哈茨木霉有大量基因表達上調(diào),其中包括P6281蛋白的基因[6].2013年Szabo發(fā)現(xiàn)在線蟲卵上寄生的哈茨木霉中該基因進行表達[7].由此可見P6281可能是哈茨木霉寄生其他真菌和線蟲卵過程中的一個重要蛋白酶.在此基礎(chǔ)上,筆者克隆了編碼P6281的cDNA序列,并在畢赤酵母中成功表達該酶,對其酶學(xué)性質(zhì)和抑菌作用進行了相關(guān)的研究.本文對該重組P6281蛋白酶的一級、二級和三級結(jié)構(gòu)進行分析,以此來探究其酶學(xué)性質(zhì)與結(jié)構(gòu)功能的關(guān)系.

      1 材料與方法

      1.1 實驗材料

      1.1.1 菌株來源

      哈茨木霉(Trichoderma harzianum)購自中國微生物菌種保藏中心.

      1.1.2 試劑

      Trizol試劑購自 Invitrogen 公司;PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒購自 TaKaRa 公司;GS115菌株和表達載體由本實驗室保藏.

      1.2 實驗方法

      1.2.1 哈茨木霉菌株的培養(yǎng)及其RNA的提取、P6281基因的克隆表達

      將哈茨木霉菌株的菌絲塊接種于PDA瓊脂平板上,28 ℃、培養(yǎng)2~3 d后;用鑷子挑取平板表面的菌絲體,迅速采用液氮浸泡研磨后,將菌絲體粉末轉(zhuǎn)至Trizol試劑中,按照該試劑的要求提取并鑒定菌體總 RNA;采用 PrimeScript? 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(TaKaRa 公司,中國北京)進行反轉(zhuǎn)錄cDNA,根據(jù)美國Genbank數(shù)據(jù)庫中報道P6281序列(accession:AWV82459),比對T.harzianum全基因組測序的相應(yīng)基因序列(accession:NQLC01000310.1),對其進行引物設(shè)計(Oligo 6軟件),以cDNA為模板進行PCR擴增,對該PCR產(chǎn)物進行克隆測序,然后將PCR產(chǎn)物電轉(zhuǎn)到畢赤酵母GS115中進行異源表達.

      1.2.2 P6281蛋白酶的序列分析

      運用Bio-Edit 7.0軟件對P6281的序列組成、比對等的分析,http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/的SignalP 5.0軟件對酶定位分析,https://swissmodel.expasy.org/網(wǎng)站進行同源建模以及模型評估,VMD 1.9、DeepView等軟件對其序列的結(jié)構(gòu)進行預(yù)測分析.

      2 結(jié)果分析

      2.1 P6281基因的克隆表達結(jié)果

      通過提取哈茨木霉總RNA,進一步反轉(zhuǎn)錄獲得了cDNA,以cDNA為模板PCR擴增克隆獲得了P6281基因,經(jīng)過測序鑒定,然后將其基因亞克隆到表達載體上,電轉(zhuǎn)入畢赤酵母GS115菌株中,獲得高效異源表達.

      2.2 P6281的一級結(jié)構(gòu)分析

      P6281氨基酸的一級結(jié)構(gòu)序列由386個氨基酸殘基組成,該序列與NCBI的報道相比,僅152位點的R殘基突變?yōu)镾殘基.在一級結(jié)構(gòu)序列中,1~17位序列為信號肽序列,該序列中富含7個A殘基,占信號肽氨基酸殘基總數(shù)41.7%,其切割位點序列為AALA,屬于常見的信號肽切割X-A-X-A類型[8],這表明P6281的信號肽與絕大多數(shù)胞外分泌蛋白的信號肽切割位點一致.

      18~386 位序列為酶原序列,其中18~65位序列為前導(dǎo)肽,該序列輔助蛋白酶適當折疊,阻礙蛋白底物與酶的底物結(jié)合區(qū)域結(jié)合,抑制酶原表現(xiàn)出蛋白酶的活性,以此維持酶原的穩(wěn)定性[9].P6281酶原在加工分泌過程中,其K32-R33殘基序列,被高爾基體中Kex2蛋白酶識別,促使其在高爾基體中加工折疊[10].并且該前導(dǎo)肽在酸性環(huán)境下自動地被切除掉,形成有活性的成熟肽[11].在前導(dǎo)肽序列中,堿性氨基酸殘基高達11個,占氨基酸總數(shù)的22.9%,其中K殘基8個,R殘基3個,這與其他該類型的天冬氨酸蛋白酶中前導(dǎo)肽富含堿性氨基酸殘基一致[12];這些堿性氨基酸殘基中,K殘基較為保守,可能與酶原催化位點的天冬氨酸殘基相互作用,以此有助于酶的正確折疊;如Aspergillus niger var.macrosporus產(chǎn)生的aspergillopepsin I中的 K56 殘基對 aspergillopepsin I的正常折疊至關(guān)重要[13],而在 P6281 中,序列保守的K53殘基可能同樣對其正常折疊具有重要作用.

      P6281成熟肽為66~386位序列,該序列共由321個氨基酸殘基構(gòu)成,推測其分子量為32.8 KDa,等電點pI為4.05,該序列中S殘基數(shù)量最多(57個,占氨基酸總數(shù)的17.76%),T殘基含量較多(40個,占總數(shù)的12.46%),這兩種氨基酸殘基總量高達30%,為其他該類酶平均數(shù)量的兩倍[14];但是這一特性似乎沒有太大影響其酶學(xué)性質(zhì).M殘基和H殘基數(shù)量最少為0個,G、S、T、C、Y、N和Q極性氨基酸為179個,占氨基酸總數(shù)的55.77%;A、V、L、I、F、W、M和P非極性氨基酸殘基數(shù)為105個,占氨基酸總數(shù)的32.71%.由此可見,P6281的疏水性氨基酸殘基占整個氨基酸總數(shù)85%以上,這與蛋白酶中疏水性氨基酸殘基數(shù)量所占比例較高相一致,為蛋白酶具有疏水性核心提供了前提保障[11].一般A1家族的活性位點為保守Asp-Thr-Gly(I)Motif結(jié)構(gòu),利用http://www.ebi.ac.uk/interpro/網(wǎng)站的InterPro數(shù)據(jù)庫對成熟肽序列進行分析可知,P6281中具有該Motif結(jié)構(gòu),分別位于D91-T92-G93和D271-T272-G273,這表明其活性位點殘基分別為D91和D271.一般距活性位點較近,與其相伴的“Gly-疏水殘基-疏水殘基-Gly”Motif結(jié)構(gòu)形成第一個psi環(huán),即P6281的第一個psi(Ⅰ)環(huán)為G162-I163-I164-G165;“Ile-疏水殘基-Gly-Asp/Gln/Asn”Motif結(jié)構(gòu)形成第二個psi環(huán),即P6281中的I360-I361-G362-Q363形成的第二個psi環(huán)(Ⅱ)(見圖1).該psi環(huán)在A1家族中較為保守,該結(jié)構(gòu)對于其結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定,特別是維持活性中心的穩(wěn)定具有重要的作用[15].

      圖1 P6281與Irpex lacteus天冬氨酸蛋白酶(PDB code:1wkr.1.A)的序列及其二級結(jié)構(gòu)分析

      2.3 P6281的同源建模、二級和三級結(jié)構(gòu)分析

      根據(jù)蛋白質(zhì)氨基酸序列一致性大于30%情況下可進行同源建模的理論,將P6281成熟肽序列提交至https://swissmodel.expasy.org/網(wǎng)站Modelling Project中進行同源性比對建模;比對結(jié)果表明,P6281與來自于 Irpex lacteus的天冬氨酸蛋白酶(PDB code:1wkr.1.A)的序列同源性高達 49.69%[14](見圖1),這完全符合同源建模要求;因此,以此建模并對其評估檢測,所建模型中肽鏈主鏈的φ角、ψ角和側(cè)鏈都基本合理,這表明該模型合理(見圖2).為了便于對該結(jié)構(gòu)的敘述,本文將成熟肽第一個氨基酸殘基(G)編號定為1,其他殘基以此類推編號.據(jù)圖1和圖2可見,P6281同該家族的天冬氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)一樣,由兩個大小相似的類二重對稱的N結(jié)構(gòu)域(N-lobe)和C結(jié)構(gòu)域(C-lobe)構(gòu)成,這兩個結(jié)構(gòu)域主要由反平行的β折疊片層結(jié)構(gòu)和簡短α 螺旋二級結(jié)構(gòu)構(gòu)成;N-lobe和C-lobe兩者之間的縫隙(即為cleft)成為了底物結(jié)合區(qū)域,兩個催化殘基(D26和D206)也位于該區(qū)域中,該區(qū)域可以容納7~8個底物氨基酸殘基,這些氨基酸殘基平均分布在催化殘基的兩旁[16].P6281和模板1wkr.1.A相比,兩者之間的氨基酸殘基序列存在插入或刪除的短序列或殘基,雖然這些序列或殘基未位于底物結(jié)合區(qū)域,但是對其酶的穩(wěn)定性和動力學(xué)具有一定的影響,這也是導(dǎo)致酶學(xué)性質(zhì)差異的原因之一[17].

      2.4 脯氨酸、二硫鍵、氫鍵和Zn離子結(jié)合的分析

      脯氨酸殘基對蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)中l(wèi)oop環(huán)具有穩(wěn)定作用[18],由圖1和圖2可知,在模板1wkr的柔性區(qū)域中不僅具有脯氨酸殘基,而且進一步形成了3個絲氨酸和脯氨酸形成的順式肽鍵,該類順式肽鍵對酶結(jié)構(gòu)具有特殊的功能作用[19];然而P6281的loop環(huán)的空間結(jié)構(gòu)中未有脯氨酸殘基,更未有順式肽鍵;由此可見,P6281的loop環(huán)穩(wěn)定性和酶學(xué)性質(zhì)與其他該類酶存在差異.

      圖2 P6281的帶狀結(jié)構(gòu)模型

      二硫鍵、氫鍵以及Zn離子結(jié)合情況是影響天冬氨酸蛋白酶穩(wěn)定性和催化活性的重要因素[20].在大多數(shù)胃蛋白酶型天冬氨酸蛋白酶中二硫鍵的位置比較保守,如豬胃蛋白酶中有3個二硫鍵[21];而P6281具有相對保守的C34和C40殘基,該兩個殘基之間的巰基(-SH)相距37.67 nm(一般二硫鍵長度約為20.5 nm).因此,P6281很可能在C34和C40之間形成了一個二硫鍵,而模板1wkr沒有二硫鍵.根據(jù)軟件DS預(yù)測P6281的氫鍵數(shù)量為270個,與其他該類型蛋白酶相比,氫鍵數(shù)量差異不顯著,并且P6281和模板1wkr均未與Zn離子結(jié)合.由此可見P6281的脯氨酸、二硫鍵、氫鍵數(shù)量和Zn結(jié)合情況而言,都直接影響了P6281的熱穩(wěn)定性,與其熱穩(wěn)定性不強具有直接的相關(guān)性.

      2.5 底物結(jié)合區(qū)域的分析

      酶對其底物的水解過程是酶與底物之間通過氫鍵、鹽鍵、疏水鍵等的作用,酶底物結(jié)合區(qū)域與底物相結(jié)合,然后通過酸堿催化或共價催化等作用,將其底物切割斷裂.因此,酶底物結(jié)合區(qū)域的空間結(jié)構(gòu)特征、氨基酸殘基組成和性質(zhì)等方面對酶的水解特性具有關(guān)鍵性作用.根據(jù)P6281對酪蛋白、BSA、明膠和大豆分離蛋白等底物的水解結(jié)果可知,P6281對酪蛋白的水解效果最佳,這與其他該類酶對疏水性底物具有偏好性的結(jié)果一致,當然也存在具體水解效果的差異,這主要體現(xiàn)在底物結(jié)合區(qū)域結(jié)構(gòu)的差異上.對于P6281蛋白酶的底物結(jié)合區(qū)域,如圖3所示,具體結(jié)構(gòu)特征分析如下.

      圖3 P6281的底物結(jié)合區(qū)域

      S1底物結(jié)合區(qū)域,是由I24、I98、V55、S56、Y57和G58構(gòu)成的疏水性口袋,其中催化活性殘基D26和D206也在該區(qū)域與底物通過氫鍵結(jié)合.在S1底物結(jié)合區(qū)域中,底物與這些殘基之間采用氫鍵結(jié)合,同時活性催化殘基D26和D206也采用氫鍵方式與底物結(jié)合.為了進一步穩(wěn)定催化殘基D26和D206與底物結(jié)合體的穩(wěn)定性,催化殘基D26分別與S29和I99之間形成“底物-催化殘基(D26)-S29/I99”的氫鍵聯(lián)合體;同時催化殘基D206分別與T209和I296之間形成這種氫鍵聯(lián)合體.flap環(huán)是構(gòu)成S1底物結(jié)合區(qū)域的重要組成部分,該環(huán)結(jié)構(gòu)為天冬氨酸蛋白酶的切斷底物提供了一個疏水的環(huán)境[11],這對酶的催化功能具有獨特的作用.在P6281的flap環(huán)主要由Y57、G58、S59、G60殘基組成,這4個殘基均為疏水性殘基,這也就為P6281的S1底物結(jié)合區(qū)提供了疏水環(huán)境.一般而言,在霉菌天冬氨酸蛋白酶中的flap環(huán)頂端的D殘基高度保守,該D殘基對裂解Lys6-Ile7鍵激活胰蛋白酶原,以及與賴氨酸殘基的相互作用中發(fā)揮重要作用(預(yù)測識別賴氨酸殘基的殘基并不保守)[14].在P6281中,flap環(huán)的S59代替了其他酶中高度保守的D殘基,因而P6281似乎不具有激活胰蛋白酶原的潛力.

      S1’底物結(jié)合區(qū)域,位于cleft裂縫的另一側(cè),是由保守的T27、G28和S29殘基構(gòu)成的一個內(nèi)陷型空腔,該空腔可以容納底物P1’側(cè)鏈分子,并且其部分氨基酸殘基與底物之間形成氫鍵,以此穩(wěn)定底物P1’分子.S2’底物結(jié)合區(qū)域,位于C-lobe,是由A180、T202、I204、V292和N293形成的疏水口袋;與模板相比較只有I204為保守氨基酸殘基,其余殘基均發(fā)生了突變,與其他來源的同類天冬氨酸蛋白酶相比較,該位點殘基也不保守;進一步對同模板和其他來源天冬氨酸蛋白酶相比較,P6281形成該底物結(jié)合區(qū)域的氨基酸殘基均不帶電荷,這表明P6281更趨向于疏水性氨基酸殘基的底物,這也體現(xiàn)了P6281對底物水解的肽鍵選擇性.

      S2底物結(jié)合區(qū)域,是指由高度保守G208和T209殘基與flap結(jié)構(gòu)之間相互夾住的空間,該空間容納底物的側(cè)鏈分子,而底物分子自身向外旋轉(zhuǎn);并且flap環(huán)的G58和S59與底物之間能形成氫鍵以穩(wěn)定底物分子.該結(jié)構(gòu)中氨基酸殘基保守,這可能與flap環(huán)和緊挨D206活性殘基有關(guān),只有這種穩(wěn)定保守的Motif結(jié)構(gòu),才能保證催化位點正確的空間構(gòu)象,確保P6281具有活性.

      S3底物結(jié)合區(qū)域,是指由不保守、帶負電荷的E6和D7殘基與flag環(huán)之間相夾的空間,并且其底部由較為保守疏水殘基I24、G91和Y57包圍而成的小空腔,該小空腔容納底物P3基團的側(cè)鏈疏水基團,這致使底物P3的側(cè)鏈基團面向clef裂縫內(nèi)部;為了P6281與底物之間的穩(wěn)定性,底物能與T209等基團形成氫鍵.由于E6D7殘基帶負電荷,不同于一般由疏水性殘基構(gòu)成的其他同類型酶,這導(dǎo)致底物P3位點的候選基團中,比其他該類蛋白酶可能更偏向帶正電荷的Arg/Lys/His殘基.

      S4底物結(jié)合區(qū)域,是由G208、T209、T210、L211、S232、S233、S234、Y270和S271形成的一個強疏水性口袋.底物P4殘基的側(cè)鏈能部分或者完全的埋入疏水囊中;由于疏水性是促使底物與酶之間相互結(jié)合的重要因素之一,這就更利于帶有較長或較大的疏水側(cè)鏈殘基的P4殘基結(jié)合該區(qū)域,并且組成該區(qū)域的疏水性氨基酸殘基不保守;這表明P6281對底物P4位點更偏向于疏水性氨基酸殘基,以及不保守的殘基組成決定了P6281對底物肽鍵選擇的獨特性.

      3 結(jié)論

      本論文利用幾種生物信息學(xué)軟件和網(wǎng)站,對哈茨木霉酸性蛋白酶P6281的結(jié)構(gòu)進行了模擬和分析.在P6281一級結(jié)構(gòu)中,1~17位為信號肽序列,其切割位點為常見的X-A-X-A類型;18~65位為前導(dǎo)肽,含有高爾基體中Kex2蛋白酶識別的K32-R33殘基序列,促使其加工折疊;66~386為成熟肽,疏水性氨基酸殘基量占整個氨基酸總數(shù)85%以上,并且含有高度保守的活性殘基Motif結(jié)構(gòu),這對維持活性中心的穩(wěn)定具有重要的作用.在二級結(jié)構(gòu)中,P6281富含β折疊和少量短鏈的螺旋結(jié)構(gòu).對其三級結(jié)構(gòu)分析可見,P6281是N-lobe和C-lobe類二重對稱形成的球狀結(jié)構(gòu),在該結(jié)構(gòu)中無Zn2+、loop結(jié)構(gòu)無Pro、僅1個二硫鍵,這是P6281熱穩(wěn)定性弱的重要原因.在兩個lobe結(jié)合縫隙的底物結(jié)合區(qū)域中主要以疏水性殘基組成為主,以及部分殘基的不保守性,這就決定了P6281對疏水性底物殘基的偏好性和肽鍵選擇的獨特性.綜上可知,通過對P6281各級結(jié)構(gòu)的分析,解析了該酶結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系,為該酶的擴大生產(chǎn)應(yīng)用、酶學(xué)性質(zhì)的改造奠定了基礎(chǔ).

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