誘導(dǎo)乳腺上皮細(xì)胞重編程前后miRNA表達(dá)譜差異分析

呂丹薇，張丹丹，劉明星，胡雅楠，王國(guó)棟，覃梁珊，黃 奔，*

（1.廣西大學(xué) 亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南寧 530004；2.廣西壯族自治區(qū)人民醫(yī)院，南寧 530004）

乳腺生物反應(yīng)器是少數(shù)可以合法用于商業(yè)用途的重組蛋白獲得系統(tǒng)之一，具有獲得的蛋白產(chǎn)量高、純化簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，有著廣闊的生產(chǎn)應(yīng)用及研究前景。山羊乳腺具有高產(chǎn)奶量和強(qiáng)大的翻譯后修飾能力，被認(rèn)為是非常具有應(yīng)用前景的重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)。然而傳統(tǒng)的乳腺生物反應(yīng)器的獲得需要涉及到轉(zhuǎn)基因胚胎及轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的獲得，整個(gè)過(guò)程前期投入大且成功率低，嚴(yán)重限制了乳腺生物反應(yīng)器的生產(chǎn)與應(yīng)用。因此，如果能在體外獲得功能性的乳腺上皮細(xì)胞，并將其應(yīng)用于轉(zhuǎn)基因乳腺的重建，或許可以很好地解決乳腺生物反應(yīng)器的生產(chǎn)限制問(wèn)題。

傳統(tǒng)的體外獲得功能性乳腺上皮細(xì)胞的方法主要采用原代細(xì)胞分離技術(shù)，這種方法存在細(xì)胞獲得率低、耗時(shí)長(zhǎng)、易污染等缺陷。細(xì)胞重編程技術(shù)在體外獲得功能性細(xì)胞方面的應(yīng)用為乳腺上皮細(xì)胞的獲得提供了新的解決方案。常見(jiàn)的誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生重編程的方法包括轉(zhuǎn)錄因子和小分子化合物，隨著研究的不斷深入，一些miRNA也陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)可以用來(lái)誘導(dǎo)細(xì)胞發(fā)生重編程。

miRNA是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22 bp的內(nèi)源性小分子非編碼RNA，在物種間具有較高的保守性。miRNA對(duì)基因表達(dá)的調(diào)控主要表現(xiàn)在基因轉(zhuǎn)錄后的調(diào)控。在細(xì)胞重編程方面，miRNA通過(guò)負(fù)向調(diào)節(jié)各種關(guān)鍵的mRNA的表達(dá)，在重編程過(guò)程中調(diào)控細(xì)胞表型的改變，在重編程后維持細(xì)胞表型的穩(wěn)定。有研究表明，miRNA在誘導(dǎo)細(xì)胞多能性和重編程細(xì)胞的獲得方面發(fā)揮著重要作用，不僅可以與轉(zhuǎn)錄因子聯(lián)合調(diào)控細(xì)胞重編程，還可以單獨(dú)調(diào)控細(xì)胞重編程以獲得誘導(dǎo)高能干細(xì)胞（IPSC）、神經(jīng)細(xì)胞和心肌細(xì)胞等功能性細(xì)胞。此外，miRNA在乳腺發(fā)育及泌乳環(huán)節(jié)也發(fā)揮著重要的作用。例如，miR-126-2p、miR-15a調(diào)節(jié)β酪蛋白的分泌，miR-454、miR-143、miR-15b和miR-27a可以調(diào)節(jié)乳脂的合成代謝，miR-484、miR-155、miR-143可以調(diào)節(jié)乳糖的合成與代謝。盡管已有研究相繼報(bào)道了許多與大家畜乳腺發(fā)育和泌乳相關(guān)的miRNA，但至今還沒(méi)有研究關(guān)注miRNA在大家畜重編程乳腺上皮細(xì)胞獲得前后表達(dá)水平的變化，也未見(jiàn)大家畜miRNA在重編程過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制研究。

廣西大學(xué)黃奔課題組（以下稱(chēng)“本課題組”）前期通過(guò)使用含有Forskolin、TTNPB、VPA、Repsox、Tranylcypromine五種小分子化合物的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，對(duì)山羊耳緣成纖維細(xì)胞進(jìn)行了為期8 d的誘導(dǎo)，成功地將山羊耳緣成纖維細(xì)胞重編程為具有泌乳能力的乳腺上皮細(xì)胞。本研究建立在前期研究的基礎(chǔ)上，旨在通過(guò)對(duì)重編程前后的細(xì)胞進(jìn)行Small RNA測(cè)序和生物信息學(xué)分析，揭示重編程前后細(xì)胞miRNA表達(dá)水平的變化，并在Small RNA水平上印證重編程前后細(xì)胞命運(yùn)的改變，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞樣品來(lái)源

誘導(dǎo)前的山羊耳緣成纖維細(xì)胞、誘導(dǎo)8 d的山羊耳緣成纖維細(xì)胞，均為本課題組前期研究中保存的細(xì)胞樣品，具體見(jiàn)參考文獻(xiàn)［19］。

1.2 主要試劑和儀器設(shè)備

TRIzol，購(gòu)自武漢賽維爾生物科技有限公司；瓊脂糖，購(gòu)自BIOWEST公司；cDNA合成試劑盒、熒光定量PCR試劑盒，購(gòu)自南京諾唯贊生物科技股份有限公司。

超凈工作臺(tái)，蘇州佳德凈化科技公司產(chǎn)品；離心機(jī)，Eppendorf公司產(chǎn)品；電泳儀，Bio-Rad公司產(chǎn)品；PCR儀，Analytikjena公司產(chǎn)品；熒光定量PCR儀，羅氏（Roche）公司產(chǎn)品；安捷倫2 100 RNA Nano 6 000 Assay Kit，美國(guó)Agilent公司產(chǎn)品；K5500分光光度計(jì)，北京凱奧科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品。以上儀器、設(shè)備均由廣西大學(xué)亞熱帶農(nóng)業(yè)生物資源保護(hù)與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。

1.3 Small RNA文庫(kù)的構(gòu)建及測(cè)序

以誘導(dǎo)前的山羊耳緣成纖維細(xì)胞為試驗(yàn)組、誘導(dǎo)8 d的山羊耳部緣成纖維細(xì)胞為對(duì)照組。兩組的Small RNA文庫(kù)構(gòu)建及測(cè)序交由安諾優(yōu)達(dá)基因科技（北京）有限公司完成。詳細(xì)步驟：（1）樣品處理。使用TRIzol法從樣品中提取總RNA。（2）總RNA質(zhì)檢。采用2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA是否有雜質(zhì)和降解情況，采用凱奧K5500分光光度計(jì)檢測(cè)總RNA純度，采用安捷倫2 100 RNA Nano 6 000 Assay Kit檢測(cè)總RNA樣品的濃度及完整性。（3）構(gòu)建測(cè)序文庫(kù)。利用膠分離技術(shù)對(duì)質(zhì)檢合格的總RNA進(jìn)行片段選擇，選擇15～35 nt的片段。對(duì)篩選后的RNA片段分別進(jìn)行3′接頭和5′接頭的連接，并將其反轉(zhuǎn)錄為cDNA。通過(guò)PCR擴(kuò)增，建立測(cè)序文庫(kù)，并對(duì)構(gòu)建好的測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行進(jìn)一步庫(kù)檢，參考圖1。（4）上機(jī)測(cè)序。采用SE50測(cè)序策略對(duì)庫(kù)檢合格的文庫(kù)進(jìn)行Illumina HiSeq高通量測(cè)序。

圖1 Small RNA文庫(kù)構(gòu)建流程Fig.1 Small RNA library construction process

1.4 差異miRNA的篩選與分析

獲得測(cè)序原始數(shù)據(jù)后，將4行數(shù)據(jù)作為一個(gè)單位，對(duì)原始數(shù)據(jù)的條數(shù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。接著，去除原始數(shù)據(jù)中低質(zhì)量的、N比例大于10%的、沒(méi)有3′接頭的、去除兩端接頭長(zhǎng)度為0的、包含ployA／T的序列，并進(jìn)行Q20、Q30質(zhì)控，去掉長(zhǎng)度＜15 nt和＞35 nt的所有重復(fù)序列，得到過(guò)濾后的數(shù)據(jù)（clean reads）。通過(guò)基因組比對(duì)分析軟件Bowtie 1.1.2將上述clean reads與參考基因組比對(duì)，條件設(shè)置為完全匹配，獲得clean reads在參考基因組中的定位信息。將比對(duì)上基因組序列的clean reads與miRbase數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行比對(duì)，獲得已知miRNA。對(duì)于沒(méi)有被注釋為已知miRNA的clean reads，使用miRDeep2軟件中的方法進(jìn)行新miRNA的預(yù)測(cè)。

采用DEseq軟件對(duì)已知miRNA和新miRNA進(jìn)行差異表達(dá)分析，篩選條件：校正后值＜0.05（padj＜0.05）且試驗(yàn)組和對(duì)照組平均表達(dá)量倍數(shù)變化的ln值絕對(duì)值≥1（｜ln（Fold_change）｜≥1），使用BenJamini＆Hochberg法進(jìn)行多重檢驗(yàn)，矯正錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率值（false discovery rate，F(xiàn)DR），并根據(jù)上述FDR值篩選出差異顯著的miRNA。使用miRanda 3.3a預(yù)測(cè)差異miRNA的靶基因，并使用R語(yǔ)言對(duì)靶基因進(jìn)行基因本體論（Gene Ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書(shū)（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析。

1.5 差異miRNA的RT-qPCR驗(yàn)證

隨機(jī)選取7個(gè)差異顯著的已知miRNA對(duì)差異分析結(jié)果進(jìn)行RT-qPCR驗(yàn)證。miRNA引物設(shè)計(jì)參考miRBase上的miRNA成熟體序列，使用Vazyme公司開(kāi)發(fā)的MiRNA Design軟件進(jìn)行設(shè)計(jì)，由擎科生物南寧合成部合成，引物序列參考表1。使用Vazyme HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR（貨號(hào)R323-01）逆轉(zhuǎn)錄酶將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。以山羊U6為內(nèi)參，用Vazyme Q711-02／03試劑盒的方法對(duì)獲得的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，反應(yīng)體系見(jiàn)表2。反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，60℃退化30 s，共40個(gè)循環(huán)；95℃反應(yīng)15 s，生成熔解曲線(xiàn)。每個(gè)樣本設(shè)計(jì)4個(gè)技術(shù)重復(fù)孔，在Roche定量PCR儀中進(jìn)行反應(yīng)，數(shù)據(jù)結(jié)果采用2法進(jìn)行計(jì)算，用SPSS 20對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。

表1 RT-qPCR引物信息Tab.1 Primer information of RT-PCR

表2 RT-qPCR反應(yīng)體系Tab.2 RT-qPCR reaction system μL

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序數(shù)據(jù)的預(yù)處理和比較

測(cè)序結(jié)果顯示：對(duì)照組、試驗(yàn)組的山羊成纖維細(xì)胞均獲得13 442 618條原始數(shù)據(jù)。對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行進(jìn)一步處理后，對(duì)照組、試驗(yàn)組分別獲得11 390 634，11 457 432條clean reads，各樣本Q20堿基百分比均在98.81%以下，Q30堿基百分比均在98.05%以下。將對(duì)照組和試驗(yàn)組的clean reads與參考基因組比對(duì)，對(duì)照組平均有8 693 829條clean reads與山羊參考基因組匹配，平均匹配率為78.21%；試驗(yàn)組平均有8 733 739條cleans reads與山羊參考基因組匹配，平均匹配率為76.3%。以上結(jié)果表明，clean reads具有可靠性，數(shù)據(jù)質(zhì)量均一良好，可用于后續(xù)分析。

2.2 差異表達(dá)miRNA的篩選

經(jīng)過(guò)所有樣本的clean reads比對(duì)，已知miRNA 403個(gè)，預(yù)測(cè)到新miRNA 125個(gè)。在已知miRNA中，有135個(gè)miRNA差異顯著（＜0.05），其中有72個(gè)miRNA顯著上調(diào)（＜0.05）、63個(gè)miRNA顯著下調(diào)（＜0.05）。在新miRNA中，有11個(gè)miRNA差異顯著（＜0.05），其中有6個(gè)miRNA顯著上調(diào)（＜0.05）、5個(gè)miRNA顯著下調(diào)（＜0.05）。差異顯著程度排名前15位的miRNA見(jiàn)表3、圖2。

圖2 差異miRNA豐度熱圖Fig.2 Heatmap of differentially expressed miRNA abudance

表3 差異表達(dá)miRNA（排名前15位）Tab.3 Differentially expressed miRNA（top 15）

2.3 差異表達(dá)miRNA的定量PCR驗(yàn)證

為了進(jìn)一步驗(yàn)證重編程前后已知miRNA及基因差異分析結(jié)果的準(zhǔn)確性，以山羊U6作為內(nèi)參，隨機(jī)選擇了7個(gè)差異顯著的已知miRNA進(jìn)行定量PCR驗(yàn)證。結(jié)果顯示，與重編程前相比，重編程后chimiR-455表達(dá)量下調(diào)，chi-let-7a-5p、chi-miR-30e-5p、chi-miR-143-3p、chi-miR-30c-5p、chi-miR-200b、chi-miR-125a-5p表達(dá)量上調(diào)，其中chi-miR-30e-5p、chi-miR-143-3p、chimiR-30c-5p、chi-miR-200b表達(dá)量極顯著上調(diào)（＜0.000 1）。綜上所述，差異miRNA的定量結(jié)果與測(cè)序數(shù)據(jù)的差異分析結(jié)果一致，見(jiàn)圖3。說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)真實(shí)有效，重編程前后miRNA的差異表達(dá)分析結(jié)果具有一定的參考價(jià)值。

圖3 差異miRNA的RT-qPCR驗(yàn)證圖Fig.3 RT-qPCR validation results of differential miRNAs

2.4 差異表達(dá)miRNA的靶基因富集分析

通過(guò)135個(gè)差異顯著的已知miRNA，共預(yù)測(cè)到13 257個(gè)無(wú)重復(fù)差異靶基因，通過(guò)11個(gè)差異顯著的新miRNA共預(yù)測(cè)到2 885個(gè)無(wú)重復(fù)差異靶基因，共富集到18 732個(gè)GO條目。具有顯著差異的已知miRNA和新miRNA的靶基因的分子功能（molecular function）主要與結(jié)合（binding）、催化活性（catalytic）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transducer）、分子傳導(dǎo)（molecular transducer）等相關(guān)；參與的生物過(guò)程（biological process，BP）主要包括細(xì)胞進(jìn)程（cellular process）、生物調(diào)控（biological regulation）、單一生物進(jìn)程（single-organism process）、代 謝 進(jìn) 程（metabolice process）、細(xì)胞組分和生物發(fā)生（celluar component organization or biogenesis）、發(fā)育進(jìn)程（developmental process）等；細(xì)胞組分主要與細(xì)胞（cell part）、細(xì)胞器（organelle）、細(xì)胞器組分（organelle part）、膜（membrane）、膜組分（membrane part）等相關(guān)。其中生物調(diào)控（biological regulation）、代 謝 進(jìn) 程（metabolice process）、細(xì)胞組分和生物發(fā)生（celluar component organization or biogenesis）、發(fā)育進(jìn)程（developmental process）等生物進(jìn)程與細(xì)胞重編程及乳腺發(fā)育分化密切相關(guān)，見(jiàn)圖4、圖5。

圖4 差異已知miRNA靶基因的GO功能富集分析Fig.4 GO functional enrichment analysis of differentially expressed known miRNA target genes

圖5 差異新miRNA靶基因的GO功能富集分析Fig.5 GO functional enrichment analysis of differentially expressed novel miRNA target genes

KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)，差異顯著的已知miRNA和新miRNA共富集在346個(gè)信號(hào)通路上，其中差異顯著的已知miRNA的靶基因顯著富集在雌激素信號(hào)通路（estrogen signaling pathway）、催乳素信號(hào)通路（prolactin signaling pathway）、催產(chǎn)素信號(hào)通路（oxytocin signaling）、Hedgehog信號(hào)通路（hedgehog signaling pathway）、脂肪酸生物合成（fatty acid biosynthesis）、脂肪細(xì)胞因子信號(hào)通路（adipocytokine signaling pathway）、PI3K-Akt信號(hào)通路（PI3K-Akt signaling pathway）和胰島素信號(hào)通路（insulin signaling pathway）等通路中，這些通路在乳腺發(fā)育和泌乳過(guò)程中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，見(jiàn)圖6；差異顯著的新miRNA的靶基因顯著富集在蛋白質(zhì)消化和吸收（protein digestion and absorption）、MAPK信號(hào)通路（MAPK signaling pathway）、黏著斑（focal adhesion）、ECM-受體互作（ECM-receptor interaction）等通路中，這些通路在細(xì)胞重編程和乳腺發(fā)育中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用，見(jiàn)圖7。

圖6 差異已知miRNA靶基因的KEGG通路富集分析Fig.6 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed known miRNA target genes

圖7 差異新miRNA靶基因的KEGG通路富集分析Fig.7 KEGG pathway enrichment analysis of differentially expressed novel miRNA target genes

3 討論

miRNA是乳腺發(fā)育過(guò)程及重編程過(guò)程的重要調(diào)節(jié)因子，在小鼠、人、奶牛等哺乳動(dòng)物的乳腺組織中，其表達(dá)水平會(huì)隨著乳腺的發(fā)育而不斷變化。本研究中差異miRNA的分析結(jié)果表明，重編程后細(xì)胞的miRNA表達(dá)模式發(fā)生了明顯的變化，且在差異程度排名前15位中有部分miRNA與乳腺發(fā)育和泌乳密切相關(guān)，例如chi-miR-200a、chi-miR-200c、chi-miR-141、chi-miR-183、chi-miR-184。miR-200a、miR-200c、miR-141是miR-200家族的成員，其中miR-200a對(duì)乳腺的分化具有關(guān)鍵的調(diào)節(jié)作用。K.Nagaoka等發(fā)現(xiàn)，在妊娠期及哺乳期小鼠乳腺組織中，miR-200a表達(dá)量明顯增加；此外，上調(diào)miR-200a會(huì)促進(jìn)上皮細(xì)胞標(biāo)志性基因CDH1和酪蛋白標(biāo)志性基因CSN2的表達(dá)，抑制成纖維細(xì)胞標(biāo)志性基因Viminten的表達(dá)。miR-200c和miR-141是泌乳過(guò)程的重要調(diào)控因子，S.Le Guillou等對(duì)奶牛泌乳期乳腺組織的miRNA表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)miR-200c和miR-141是乳腺上皮組織中表達(dá)量最高的miRNA之一。此外，Li Z.等的研究結(jié)果表明，與非泌乳期奶牛乳腺組織相比，泌乳期奶牛乳腺組織中miR-200c和miR-141表達(dá)量顯著增加。miR-183與乳脂代謝過(guò)程密切相關(guān)，它可以通過(guò)靶向MST1基因調(diào)控山羊乳腺細(xì)胞的乳脂代謝，也可以通過(guò)靶向IRS1基因調(diào)控奶牛乳腺上皮細(xì)胞的乳脂代謝。而miR-184是一種在奶牛乳腺上皮細(xì)胞中高度富集的miRNA，在人和小鼠中，miR-184具有促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞命運(yùn)進(jìn)程，抑制乳腺腫瘤形成的作用。重編程前后差異的miRNA的功能集中在乳腺發(fā)育分化和泌乳方面，這表明了在重編程前后細(xì)胞功能發(fā)生了改變。

上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指上皮細(xì)胞經(jīng)過(guò)特定程序轉(zhuǎn)化為間質(zhì)表型的細(xì)胞的生物學(xué)過(guò)程。EMT過(guò)程是可逆的，稱(chēng)為間充質(zhì)-上皮轉(zhuǎn)化（MET）。EMT與MET過(guò)程均與胚胎發(fā)育、組織重塑、癌癥發(fā)生密切相關(guān)。在本課題組的研究結(jié)果中，成纖維細(xì)胞向乳腺上皮細(xì)胞命運(yùn)的轉(zhuǎn)換需要涉及到EMT途徑的抑制。重編程前后差異miRNA的分析結(jié)果表明，在差異倍數(shù)排名前15位的差異miRNA中，有部分miRNA對(duì)EMT過(guò)程具有調(diào)控作用，它們分別是miR-34c-5p、miR-34c-3p、miR-708-3p、miR-200b。miR-34c-5p、miR-34c-3p是miR-34家族的成員，miR-34c-5p可以通過(guò)作用于Notch信號(hào)通路抑制EMT的發(fā)生，而miR-34c-3p可以通過(guò)MAP3K2信號(hào)通路調(diào)控EMT的發(fā)生。miR-200b是miR-200家族的成員，它是抑制EMT途徑的關(guān)鍵因子。在具有EMT特征的胰腺癌細(xì)胞中，miR-200b的表達(dá)水平會(huì)呈現(xiàn)出顯著下調(diào)的趨勢(shì)。此外，如果在乳腺癌細(xì)胞中上調(diào)miR-200b表達(dá)水平，可以抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT。miR-708-3p可以通過(guò)靶向EMT激活因子來(lái)抑制EMT的進(jìn)程，例如J.W.Lee等通過(guò)在細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-708-3p發(fā)現(xiàn)，miR-708-3p可以通過(guò)直接靶向ZEB1、CDH2及vimentin等EMT激活因子，進(jìn)而抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT。在重編程前后部分差異表達(dá)的miRNA的功能集中在重編程方面，這表明在重編程后細(xì)胞狀態(tài)可能發(fā)生了改變。

雌激素信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路、催乳素信號(hào)通路對(duì)乳腺發(fā)育分化及泌乳具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。雌激素是誘導(dǎo)青春期乳腺發(fā)育的關(guān)鍵調(diào)控因子。雌激素通過(guò)與雌激素受體α結(jié)合，促進(jìn)雙調(diào)蛋白與表皮生長(zhǎng)因子受體的結(jié)合，激活FGF的表達(dá)，并進(jìn)一步推動(dòng)乳腺側(cè)支和末端芽的發(fā)育，最終獲得功能性乳腺。此外有研究表明，給切除了卵巢的小鼠注射雌二醇可以恢復(fù)其乳腺上皮細(xì)胞的DNA合成能力，如果在青春期小鼠乳腺中進(jìn)行抗雌激素處理，則會(huì)抑制乳腺導(dǎo)管末端芽中上皮細(xì)胞的合成。PI3K-Akt信號(hào)通路在細(xì)胞的生長(zhǎng)、代謝、增殖、凋亡及血管生成等重要的生物過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。在乳腺發(fā)育方面，月桂酸和油酸能激活G蛋白偶聯(lián)受體84（GRP84），進(jìn)而通過(guò)PI3K-Akt信號(hào)通路促進(jìn)乳腺的發(fā)育，而硬脂酸則會(huì)通過(guò)作用于G蛋白偶聯(lián)受體120（GPR120）抑制PI3K-Akt信號(hào)通路進(jìn)而阻礙乳腺的發(fā)育。在泌乳方面，PI3KAKt信號(hào)通路可以調(diào)控泌乳過(guò)程中乳糖及乳脂的合成，并同時(shí)誘導(dǎo)催乳素的合成，促進(jìn)機(jī)體進(jìn)入哺乳期。以上研究結(jié)果說(shuō)明，PI3K-Akt信號(hào)通路在乳腺上皮細(xì)胞的增殖和生長(zhǎng)、乳腺導(dǎo)管的形成及泌乳方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。催乳素是一類(lèi)由腦垂體或乳腺上皮細(xì)胞分泌的激素，它通過(guò)與細(xì)胞膜表面的催乳素受體結(jié)合，在哺乳期乳腺發(fā)育、乳脂合成及分泌過(guò)程中發(fā)揮著重要的作用。在泌乳方面，Zhang Z.等的研究表明，麥芽提取物可以通過(guò)作用于催乳素信號(hào)通路和JAK-STAT信號(hào)通路，進(jìn)而促進(jìn)大鼠乳腺組織泌乳。在乳腺的發(fā)育方面，N.D.Horseman等和C.J.Ormandy等通過(guò)構(gòu)建轉(zhuǎn)基因小鼠發(fā)現(xiàn)，敲除PRL基因或PRLR基因后，小鼠在青春期乳腺導(dǎo)管分支會(huì)減少，并且腺泡芽不發(fā)育。上述研究表明，催乳素信號(hào)通路對(duì)乳腺發(fā)育及泌乳過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。綜合差異miRNA的靶基因GO功能富集結(jié)果和KEGG通路富集結(jié)果發(fā)現(xiàn)，有部分差異miRNA的靶基因參與的生物過(guò)程和分子功能與在乳腺發(fā)育過(guò)程中所涉及到的發(fā)育、代謝、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及催化活性相關(guān)，且部分基因所富集的通路對(duì)乳腺發(fā)育分化及泌乳過(guò)程具有重要的調(diào)控作用。這說(shuō)明重編程后細(xì)胞的基因功能及基因的表達(dá)模式發(fā)生了顯著的變化，印證了重編程后細(xì)胞命運(yùn)的改變。

4 結(jié)論

山羊耳緣成纖維細(xì)胞重編程前后差異miRNA靶基因的功能、參與調(diào)控的信號(hào)通路與乳腺發(fā)育分化及泌乳密切相關(guān)。且經(jīng)小分子化合物誘導(dǎo)后山羊耳緣成纖維細(xì)胞的性質(zhì)、功能及命運(yùn)發(fā)生了改變。