李宏偉，張 揚，鄭 斐，賈云鶴，周 飛，倪玨萍

(上海曉明檢測技術服務有限公司，上海 201612)

小麥赤霉病是影響小麥生產的主要病害之一，在世界范圍內分布廣泛，流行頻率高。小麥赤霉病的發(fā)生流行，不僅導致小麥結實率和千粒重下降，影響小麥高產穩(wěn)產，同時病原菌在感病籽粒中產生的真菌毒素，尤其是脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)，被誤食后會引起發(fā)熱、嘔吐、腹瀉等中毒反應，嚴重的甚至導致死亡[1]。Li等[2]對采集于江蘇和安徽等地的59個樣品進行了檢測發(fā)現，在89.3%小麥樣品中存在DON毒素；王淞等[3]對山東、河北、吉林等10個地區(qū)的50份樣品進行了檢測，DON檢出率為30%；Fang等[4]連續(xù)5年調查了江蘇省小麥的毒素污染水平，發(fā)現DON常年檢出率為50%～100%。由此可見，解決小麥赤霉病菌毒素污染問題已迫在眉睫，而控制赤霉病的發(fā)生發(fā)展是治理毒素污染問題的根源。

目前，生產上種植的小麥品種對赤霉病的抗性普遍較差，化學防治仍然是防控小麥赤霉病的重要手段[5]。當前生產中防控小麥赤霉病的藥劑主要有苯并咪唑類(多菌靈、甲基硫菌靈等)、甾醇生物合成抑制劑類(戊唑醇、咪鮮胺、己唑醇、丙硫菌唑、葉菌唑等)和氰基丙烯酸酯類(氰烯菌酯)等3類。近年來，又有琥珀酸脫氫酶抑制劑類(氟唑菌酰羥胺)殺菌劑上市。截止2021年5月，我國登記用于防治小麥赤霉病的藥劑有413個(包括單劑與混劑)，其中，以多菌靈為有效成分的藥劑187個，以戊唑醇為有效成分的藥劑92個，以甲基硫菌靈為有效成分的藥劑81個，其次為咪鮮胺(55個)、三唑酮(42個)、福美雙(35個)。與防治其他病害的藥劑相比，用于防治小麥赤霉病的藥劑依舊顯得不足。基于此，本文選擇丙硫菌唑等5種不同結構類型的殺菌劑開展了其對小麥赤霉病的室內生測和田間小區(qū)藥效比對試驗，旨在通過小麥赤霉病新藥篩選試驗與評價方法的建立，為研發(fā)出有效防治小麥赤霉病的新殺菌劑品種提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 供試靶標

小麥赤霉病病原菌(Fusarium graminearum)：室內試驗病原菌為相同菌株，由本實驗室于2018年在田間采集并分離保存；田間試驗病原菌一地為自然發(fā)生，一地為人工接種。

1.2 供試藥劑

室內試驗：95%丙硫菌唑(prothioconazole) TC、97%戊唑醇(tebuconazole) TC、100%氰烯菌酯(phenamacril) TC、98%多菌靈(carbendazim) TC、99.5%氟唑菌酰羥胺(pydiflumetofen) TC，由上海曉明檢測技術服務有限公司提供。

田間小區(qū)試驗：480 g/L丙硫菌唑SC (南通泰禾化工股份有限公司)；430 g/L戊唑醇SC (拜耳作物科學有限公司)；200 g/L氟唑菌酰羥胺SC (瑞士先正達作物保護有限公司)；25%氰烯菌酯SC (江蘇省農藥研究所股份有限公司)；50%多菌靈WP (江蘇三山農藥有限公司)。

1.3 試驗方法

1.3.1 菌絲生長抑制法

參照NY/T 1156.2—2006[6]。將5種供試原藥用溶劑溶解為10 000 mg/L的母液，然后按照預試驗結果配制系列梯度濃度的試驗藥液，并制作成直徑9 cm的含藥PDA平板，每處理3次重復。氟唑菌酰羥胺的濃度為：0.4、0.1、0.04、0.01、0.004 mg/L；其他4種藥劑的濃度為：4、1、0.4、0.1、0.04 mg/L。待含藥PDA平板晾干后，用接種針將直徑5 mm的小麥赤霉病菌餅接種至含藥平板中央，菌絲面朝下，放置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)。待對照菌落直徑為6～7 cm時，采用十字交叉法，調查各處理的菌落直徑，按照1.3.6節(jié)中公式(1)計算菌絲生長抑制率，用DPS v16.05統(tǒng)計分析軟件，對藥劑濃度和菌絲生長抑制率進行數量反應生測幾率值分析，得到各藥劑的EC75及其95%置信限。

1.3.2 葉片法

1%水瓊脂試管準備：用250 mL三角瓶，稱量1.5 g瓊脂粉后，加入150 mL水，配制成1%水瓊脂(質量/體積比)，121 ℃滅菌20 min；滅菌完成后，用移液器取3 mL 1%水瓊脂分裝至20 mL玻璃試管中，于試管架上垂直放置，冷卻待用。

接菌：將提前培養(yǎng)2～3 d的赤霉病菌，沿菌落邊緣用1.1 cm的打孔器打菌餅，后用接種器將菌餅接種至1%水瓊脂試管中，菌絲面朝上，置于25 ℃生化培養(yǎng)箱中黑暗培養(yǎng)18～20 h。

浸藥及培養(yǎng)：剪取一葉一心期小麥葉片，保持葉片高度在7 cm左右，每處理24片葉，將葉片浸入裝有藥液的離心管中后開始計時，20 s后將葉片取出，放置于寫好標簽的紙巾上，晾干1 h左右，將晾干藥液的葉片分裝至寫好標簽的 1%水瓊脂試管中，每試管中8片葉，每處理3次重復，置于人工氣候箱(25℃，12 hL/12 hD)中培養(yǎng)6 d，測量菌絲生長高度，按照1.3.6節(jié)中公式(2)計算菌絲生長抑制率。用DPS v16.05統(tǒng)計分析軟件，對藥劑濃度和菌絲生長抑制率進行數量反應生測幾率值分析，得到各藥劑的EC75及其95%置信限。

1.3.3 孢子萌發(fā)抑制法

參照陳雨等[7]試驗方法。將小麥赤霉病病原菌在3%綠豆湯培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)5 d (28 ℃，黑暗，180 r/min)。在無菌條件下，用滅菌紗布濾去菌絲，將濾液離心(5 000 r/min，10 min)去除上清液。將分生孢子重新懸浮于滅菌水中，調節(jié)孢子濃度至1×106個/mL，制備成孢子懸浮液。取0.05 mL孢子懸浮液，涂布于含藥的1%水瓊脂(WA)平板上，每處理3次重復。涂布孢子后的平板，置于生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃，黑暗)。24 h后調查孢子萌發(fā)情況，并按照1.3.6節(jié)中公式(3)計算孢子萌發(fā)抑制率。

1.3.4 盆栽法

在室內用大盆缽種植小麥至抽穗，在小麥揚花初期，噴施配制好的藥液至麥穗上。每盆缽20穗，每處理3次重復。24 h后接種1×105個/mL的小麥赤霉病菌孢子懸浮液，置于保濕間內培養(yǎng)(25 ℃，12 hL/12 hD，RH＞90%)，5 d后調查麥穗的病級，調查方法參照行標NY/T 1464.15—2007[8]，并按照1.3.6中公式(5)、(6)計算病情指數及防治效果。

1.3.5 田間小區(qū)藥效試驗

使用5種殺菌劑的田間推薦用量，比較其對小麥赤霉病的防效差異。

施藥2次，即小麥揚花初期首次施藥，間隔6～7 d進行第2次施藥；小區(qū)面積為24 m2，每處理3次重復。用水量為450 L/hm2。

2021年進行2點田間試驗。

試驗點1：安徽省桐城市范崗鎮(zhèn)，赤霉病自然發(fā)生。小麥品種為揚麥23，2020年10月20日撒播。2021年4月4日第1次施藥，間隔6 d第2次施藥，最后1次施藥后27 d進行調查。

試驗點2：江蘇省句容市后白鎮(zhèn)，首次施藥當天，人工噴霧接種赤霉病菌孢子液。小麥品種為鄭麥9741，2020年11月20日撒播。2021年4月16日第1次施藥，間隔7 d第2次施藥，第2次施藥后24 d進行調查。

每小區(qū)對角線5點取樣，每點調查50穗。調查后計算各處理的病穗率、病情指數及防治效果。調查及計算方法參照行標NY/T 1464.15—2007[8]。

1.3.6 計算方法和數據統(tǒng)計分析

菌絲生長速率法：

葉片法：

孢子萌發(fā)法：

田間小區(qū)試驗：用DPS v16.05統(tǒng)計分析軟件，對各處理的防效進行鄧肯氏新復極差法差異顯著性分析。計算公式如下：

式中：CK1為空白對照區(qū)施藥后病情指數；PT1為藥劑處理區(qū)施藥后病情指數。

2 結果與分析

2.1 菌絲生長速率法

結果表明(表 1)，5種殺菌劑對小麥赤霉病的EC75為0.168 8～3.793 8 mg/L，其中氟唑菌酰羥胺對小麥赤霉病病原菌的菌絲生長抑制率最強，再依次是氰烯菌酯、多菌靈、戊唑醇、丙硫菌唑。該結果與谷春艷等[9]的研究結果一致。

2.2 葉片法

結果表明(表1)，5種殺菌劑對小麥赤霉病EC75為 2.5098～111.9229 mg/L，氟唑菌酰羥胺的菌絲生長抑制率最強，其次為丙硫菌唑、氰烯菌酯、戊唑醇和多菌靈。

表1 5種殺菌劑對小麥赤霉病菌菌絲生長的抑制活性

2.3 孢子萌發(fā)法

結果表明(表2和表3)，氟唑菌酰羥胺對小麥赤霉菌孢子的抑制活性最高，在2.5 mg/L劑量下，孢子萌發(fā)抑制率達 100%；其次為丙硫菌唑和氰烯菌酯，在 400 mg/L劑量下，孢子萌發(fā)抑制率可達到100%；戊唑醇和多菌靈對孢子的抑制活性一般，在400 mg/L劑量下，孢子萌發(fā)抑制率＜30%。這與向禮波等[10]研究結果基本一致，即氟唑菌酰羥胺對湖北省6個地區(qū)的 106株禾谷鐮孢菌孢子的平均 EC50為(0.176 0± 0.059 6) mg/L，且氟唑菌酰羥胺的活性顯著高于氰烯菌酯。

表2 2種殺菌劑對小麥赤霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

表3 3種殺菌劑對小麥赤霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用

2.4 盆栽法

結果表明(表4)，在相同施藥濃度下，氟唑菌酰羥胺對小麥赤霉病的防治效果最好，其次為丙硫菌唑、氰烯菌酯、戊唑醇和多菌靈。

表4 5種殺菌劑對盆栽小麥赤霉病的活性

2.5 田間小區(qū)藥效試驗

兩地試驗結果表明(表5)，5種殺菌劑在江蘇試驗點的防效均低于安徽試驗點的防效。分析其原因，安徽試驗點為自然發(fā)病，發(fā)病較輕，清水對照的病指為 8.19；而江蘇試驗點在自然發(fā)病的基礎上，進行了人工接種，發(fā)病較重，清水對照的病指為29.79。但 5種殺菌劑在兩地所表現出的防效高低趨勢一致。其中，480 g/L丙硫菌唑SC和200 g/L氟唑菌酰羥胺 SC對小麥赤霉病的防效最高，其防效可穩(wěn)定在85%以上；其次為430 g/L戊唑醇SC和25%氰烯菌酯SC，其防效可穩(wěn)定在75%以上；50%多菌靈WP的防效最低，但仍能達到70%以上。

表5 5種殺菌劑對小麥赤霉病的田間防治效果

2.6 方法的綜合評價

綜合以上試驗結果，在5種試驗方法下，氟唑菌酰羥胺、戊唑醇、氰烯菌酯、多菌靈和丙硫菌唑均對小麥赤霉病表現出較好的活性，但同種藥劑在不同試驗方法下，表現出的活性有所不同。以氰烯菌酯和丙硫菌唑為例，⑴ 在菌絲生長速率法和葉片法下，氰烯菌酯的EC75分別為0.833 7、18.538 1 mg/L；丙硫菌唑的EC75分別為3.793 8、15.376 5 mg/L，同樣是抑制菌絲生長，氰烯菌酯在離體和半活體條件下的活性相差22倍；丙硫菌唑在離體和半活體條件下的活性相差4倍。⑵ 在孢子萌發(fā)抑制法和盆栽法下，在劑量100 mg/L時，氰烯菌酯的孢子萌發(fā)抑制率為6.81%，而盆栽法的防效為58.4%；丙硫菌唑的孢子萌發(fā)抑制率為 3.88%，而盆栽法的防效為70.4%，同樣是抑制孢子活性，兩種方法下的活性差異顯著。⑶ 田間小區(qū)試驗中，氰烯菌酯的施用劑量為750 g ai/hm2(折算到劑量為1 000 mg/L)，防效達77.61%～91.74%。以達到75%防效計，室內(葉片法)和田間劑量的相關倍數約54倍；丙硫菌唑的施用劑量為200 g ai/hm2(折算到劑量為267 mg/L)，防效達89.50%～93.89%。以達到75%防效計，室內(葉片法)和田間劑量的相關倍數約18倍。

3 討 論

在新藥研發(fā)過程中，采用何種生物測定方法，能夠快速、準確地篩選出有效的化合物，已成為極為重要的研究內容。本文結合在新化合物篩選中的實際工作，對5種生測方法進行了系統(tǒng)比較，見表6。

表6 5種不同試驗方法的差異比較

菌絲生長速率法和孢子萌發(fā)法是離體測試，優(yōu)點是試驗周期短，重復性好，用藥量少，能夠定性測定出與化合物直接作用的活性。缺點是單獨使用一種方法，不能同時測定對菌絲和孢子的活性。該兩種方法適用于新化合物普篩階段的快速篩選，便于先導化合物的發(fā)現和優(yōu)化。

葉片法優(yōu)點是試驗材料易得，浸葉片后的藥液可用于其他靶標的活體盆栽篩選，有利于節(jié)省化合物的用量；該方法是藥劑通過與葉片互作后發(fā)揮作用，更接近于藥劑在田間實際應用的情況。但該方法主要測定藥劑對菌絲的抑制活性，無法同時測定藥劑對孢子的抑制活性，因此存在一定的局限性。該方法適用于對活性化合物的驗證。

盆栽法是一種模擬病原菌田間侵染過程的測定方法，其優(yōu)點是測定結果的準確性好，與田間試驗的相關性高；其不足之處在于該方法所需化合物的量多，且小麥從播種到抽穗的生長周期長，接種孢子后對培養(yǎng)條件的要求較高。該方法適用于活性化合物進入田間前的活性驗證。

田間小區(qū)試驗能夠準確評價高活性化合物的真實防效，但該試驗方法所需的化合物量多，且試驗開展受季節(jié)限制。為提高試驗的成功率，建議在齊穗期到揚花初期進行人工接種，增大菌源量，同時選擇便于澆水的田塊，提高田間濕度，促進病害發(fā)生。另外，各地的小麥赤霉病病原菌的敏感性可能不同，因此，在進行田間小區(qū)試驗時可選擇多地同時進行。該方法適用于高活性化合物的田間藥效驗證及評價。

綜上所述，建議菌絲生長速率法、孢子萌發(fā)法用于先導化合物的發(fā)現和優(yōu)化，葉片法、盆栽法用于活性化合物的驗證，田間小區(qū)試驗用于高活性化合物的驗證和評價。該方法在本試驗機構的應用已篩選到部分高殺菌活性化合物，并進行了田間驗證，證明該方法可適用于小麥赤霉病新殺菌劑的篩選與評價。