肉桂精油和肉桂醛的抑菌、抗氧化和酪氨酸酶抑制活性研究

路 露， 束成杰， 葛 翎， 潘潔塵， 朱 凱， 石寶俊*

(1.南京林業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院，江蘇 南京 210037；2.南京野生植物綜合利用研究院，江蘇 南京 211100；3.南京林業(yè)大學(xué) 江蘇省林業(yè)資源高效加工利用協(xié)同創(chuàng)新中心,江蘇 南京 210037)

精油是由芳香植物形成的具有強(qiáng)烈氣味的揮發(fā)性復(fù)合物。 目前已生產(chǎn)了大約3 000種精油，其中將近300種精油已用于保健、香料、化妝品、農(nóng)業(yè)和食品工業(yè)[1-2]。肉桂為樟科樟屬植物肉桂(CinnamomumcassiaPresl)的干燥樹皮，又名玉桂、牡桂等，是世界上重要的香料和藥材之一[3]。肉桂中可以提取出豐富的肉桂油，其主要含肉桂醛等揮發(fā)性成分以及多糖、多酚、黃酮等非揮發(fā)性成分。近年來肉桂精油的生物活性研究備受關(guān)注。Chen等[4]研究發(fā)現(xiàn)，肉桂中的多酚類物質(zhì)可對胰島素敏感性具有一定的影響；肉桂中黃酮類物質(zhì)不僅可以延緩食物的變質(zhì)，而且對自由基造成的損傷有抑制作用[5]。Ka等[6]發(fā)現(xiàn)肉桂醛能抑制癌細(xì)胞的增殖，同時(shí)還有報(bào)道肉桂醛具有抑菌[7-9]、抗氧化[10]和殺螨[11]的作用，而對于肉桂精油及其內(nèi)在成分與生物活性構(gòu)效關(guān)系的研究較少涉及。因此，本研究對比了肉桂精油及其主要成分肉桂醛的生物活性，以期為進(jìn)一步開發(fā)肉桂在醫(yī)藥、食品、化妝品等行業(yè)的選擇應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí) 驗(yàn)

1.1 原料、試劑與儀器

肉桂精油，購于廣西藤縣龍慶農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限公司。肉桂醛(純度≥99%)、 2,2′-聯(lián)氮雙(3-乙基苯并噻唑啉- 6-磺酸)二銨鹽(ABTS)、 2,4,6-三吡啶基三嗪(TPTZ)、丁基羥基茴香醚(BHA,純度98%)，上海阿拉丁生化科技股份有限公司；酪氨酸酶溶液、熊果苷(純度99%)，Sigma公司；左旋多巴(L-DOPA)溶液，Abcm公司；二甲基亞砜(DMSO,純度>99%)，分析純。大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、白色念珠菌(Candidaalbicans)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和綠膿桿菌(Pseudomonasaeruginosa),南京野生植物資源綜合利用研究院提供。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1 g、酵母抽提物0.5 g、NaCl 1 g、瓊脂2 g、蒸餾水100 mL，121 ℃進(jìn)行高壓滅菌20 min。YPD 培養(yǎng)基：酵母抽提物1 g、蛋白胨2 g、葡萄糖2 g、瓊脂2.5 g、蒸餾水100 mL，121 ℃進(jìn)行高壓滅菌20 min。

氣相色譜-質(zhì)譜(GC-MS)聯(lián)用儀,安捷倫科技公司；TU-1900雙光束紫外可見分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限公司；SPX-150B-Z型生化培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；DZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司。

1.2 肉桂精油GC-MS成分分析

色譜條件為：DB-5MS色譜柱，初溫80 ℃，保留時(shí)間為5 min，以5 ℃/min升溫至200 ℃，并保留5 min。進(jìn)樣口溫度為250 ℃，F(xiàn)ID檢測器溫度為280 ℃；以氦氣為載氣，進(jìn)樣量為1μL。

質(zhì)譜條件為：EI離子源230 ℃，四級桿150 ℃，電子能量70 eV，全程掃描。

1.3 抑菌試驗(yàn)

1.3.1濾紙片試驗(yàn) 參考文獻(xiàn)[12]的方法，稍作改動。100 μL的菌液均勻涂布在培養(yǎng)基表面，無菌鑷子夾取已滅菌的6 mm濾紙片放在對應(yīng)培養(yǎng)基上。取10 μL樣品打在濾紙片上，丙酮作為對照，靜置10 min。放置培養(yǎng)箱中37 ℃培養(yǎng)24 h，每組做3個(gè)平行，用游標(biāo)卡尺測量其抑菌圈直徑。

1.3.2最小抑菌濃度(MIC)和最小殺菌濃度(MBC)的測定 根據(jù)Tu等[13]所使用的方法稍加修改。用丙酮配制0.04～10 g/L的肉桂精油和肉桂醛溶液，取1 mL液體培養(yǎng)基加入150 μL不同濃度的肉桂精油或肉桂醛溶液，同時(shí)加入500 μL菌液(2×108CFU/mL)，各試管在37 ℃，180 r/min搖床培養(yǎng)24 h。澄清無菌生長的最低濃度即為MIC；取澄清試管液體50 μL均勻涂布于對應(yīng)固體培養(yǎng)基上，37 ℃培養(yǎng)24 h，無可見細(xì)菌生長即為MBC。每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 抗氧化活性測試

1.4.1ABTS自由基清除能力 按照參考文獻(xiàn)[14]的方法進(jìn)行測定。在波長734 nm下測量樣品的吸光度(A1)，對照組(無水乙醇)的吸光度(A0)，BHA作陽性對照。重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)取平均值，ABTS自由基(ABTS+·)清除率(YABTS+·)按式(1)計(jì)算:

(1)

1.4.2總抗氧化能力 按照參考文獻(xiàn)[15]的方法進(jìn)行總抗氧化能力實(shí)驗(yàn)。在波長593 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(FeSO4濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo))，Y=0.002 4X-0.013 8(R2=0.999 5)。通過FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到對應(yīng)的鐵離子還原/抗氧化能力(FRAP)值。

1.5 抑制酪氨酸酶活性測試

將肉桂精油和肉桂醛溶于PBS，稀釋成不同質(zhì)量濃度溶液，根據(jù)文獻(xiàn)[16]稍加修改，如表1所示向試管中分別加入肉桂精油或肉桂醛、PBS和酪氨酸酶溶液(100 U/mL)，混合均勻，置于37 ℃水浴中反應(yīng)10 min，分別迅速加入1 mLL-DOPA 溶液(1.5 mmol/L)，混合均勻，置于37 ℃水浴中反應(yīng)5 min，在475 nm處測定吸光度(A)，各反應(yīng)組吸光度分別記作A1、A2、A3和A4，熊果苷為陽性對照。按照式(2)計(jì)算酪氨酸酶的抑制率(R):

表1 各反應(yīng)液組成Table 1 Composition of each reaction solution

(2)

2 結(jié)果與分析

2.1 肉桂精油GC-MS成分分析

采用GC-MS對肉桂精油化學(xué)組成進(jìn)行分析，結(jié)果如表2所示，肉桂精油的主要成分為86.07%肉桂醛和6.25%的2’-甲氧基肉桂醛。

表2 肉桂精油的化學(xué)組分Table 2 Chemical groups of Cinnamon essential oil

2.2 肉桂精油和肉桂醛的抑菌活性

2.2.1麥?zhǔn)媳葷岱y定菌液濃度 根據(jù)試劑盒說明書在430 nm處測定吸光度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，公式為y=0.085 3x-0.01，R2=0.998 7。根據(jù)吸光度配制濃度為2×108CFU/mL菌液。

2.2.2MIC和MBC測定結(jié)果 由表3可知，肉桂精油和肉桂醛對真菌和細(xì)菌表現(xiàn)出不同的敏感性，MIC在0.08～1.25 g/L之間。肉桂精油對白色念珠菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和綠膿桿菌的MBC值分別為0.62、 2.5、 10、 5和5 g/L，而肉桂醛對以上5種菌的MBC值分別為0.31、 5、 5、 5和2.5 g/L。可以看出，二者對真菌的抑制效果最佳，MIC分別為0.31和0.08 g/L，MBC分別為0.62 和0.31 g/L。大量研究[17-19]發(fā)現(xiàn)肉桂精油對真菌的抑菌作用強(qiáng)于細(xì)菌，與本研究的結(jié)果一致。通過對比無菌生長的肉桂醛和肉桂精油的MIC和MBC值，肉桂醛對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和綠膿桿菌的抑菌效果優(yōu)于肉桂精油，而肉桂精油對大腸桿菌的抑菌效果更好。Joris[20]研究發(fā)現(xiàn)肉桂精油中的甲氧基肉桂醛對大腸桿菌有很強(qiáng)的抑制作用，而本研究使用的肉桂精油有6.25%的2’-甲氧基肉桂醛。因此肉桂精油對大腸桿菌的抑制作用更強(qiáng)。

表3 肉桂精油和肉桂醛的最小抑菌濃度1)Table 3 Minimum inhibitory concentration of cinnamon essential oil and cinnamaldehyde

2.2.3濾紙片法結(jié)果 由表4可知，肉桂精油和肉桂醛抑制白色念珠菌的效果亦是最佳，金黃色葡萄球菌次之。當(dāng)質(zhì)量濃度為40 g/L時(shí)，肉桂醛對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為(23.25±0.12)mm和(13.42±0.28)mm，而肉桂精油對2種菌種的抑菌直徑為(18.46±0.26)mm和(11.58±0.51)mm。由此可知,肉桂醛對白色念珠菌和金黃色葡萄球菌的抑菌效果優(yōu)于肉桂精油。

表4 肉桂精油和肉桂醛對供試菌種的抑菌圈直徑Table 4 The inhibition zone diameters of cinnamon essential oil and cinnamaldehyde mm

2.3 肉桂精油和肉桂醛的抗氧化活性

2.3.1ABTS+·清除能力 圖1為不同質(zhì)量濃度肉桂精油、肉桂醛，以及BHA對ABTS+·的清除率變化曲線。由圖1可知，肉桂醛對ABTS+·的清除率隨質(zhì)量濃度變化不大，在選擇的質(zhì)量濃度范圍內(nèi)清除率只保持在25%左右；而肉桂精油對ABTS+·的清除率隨著質(zhì)量濃度的增加而增大，具有正相關(guān)性。當(dāng)質(zhì)量濃度為16 g/L時(shí)，肉桂精油對ABTS+·的清除率達(dá)到94.1%，是相同質(zhì)量濃度肉桂醛的3倍，與4 mg/L BHA清除效果相當(dāng)。

圖1 肉桂精油、肉桂醛和BHA對ABTS+·的清除率 圖2 肉桂精油和肉桂醛總抗氧化能力Fig.1 Scavenging rate of ABTS+of cinnamon essential oil,cinnamaldehyde and BHA Fig.2 Fe3+ reduction ability of cinnamon essential oil and cinnamaldehyde

2.3.2總抗氧化能力測定 肉桂精油和肉桂醛的總抗氧化能力測定結(jié)果見圖2。由圖可知，肉桂醛的總抗氧化能力隨質(zhì)量濃度變化不大，而肉桂精油的總抗氧化能力隨著質(zhì)量濃度的增加而增大。

16 g/L肉桂醛的總抗氧化能力與258.6 μmol/L FeSO4相當(dāng)；16 g/L肉桂精油的總抗氧化能力與1 502 μmol/L FeSO4相當(dāng),是肉桂醛的5.8倍。由此可知，肉桂精油的抗氧化活性優(yōu)于肉桂醛。這可能是由于含石竹烯的肉桂精油各抗氧化成分之間存在協(xié)同增效作用[21]。

2.4 肉桂精油和肉桂醛的抑制酪氨酸酶活性

眾所周知，酪氨酸酶的活性與黑色素的生產(chǎn)量有關(guān)[22]。由表5可知，肉桂精油和肉桂醛對酪氨酸酶抑制率隨著質(zhì)量濃度的增加而提高，其中40 g/L的肉桂精油對酪氨酸酶抑制率為83.61%，而相同濃度肉桂醛對酪氨酸酶抑制率達(dá)87.34%，分別為同濃度陽性對照熊果苷的1.36和1.42倍。肉桂精油和熊果苷對酪氨酸酶的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為4.02 和19.80 g/L，而肉桂醛對酪氨酸酶的IC50小于1.25 g/L。由此可知，二者均對酪氨酸酶具有良好的抑制作用，而肉桂醛的抑制作用強(qiáng)于肉桂精油。

表5 肉桂精油和肉桂醛對酪氨酸酶的抑制效果Table 5 The inhibitory effect of cinnamon essential oil and cinnamaldehyde on tyrosinase

3 結(jié) 論

3.1通過濾紙片法、MIC和MBC對比肉桂精油和肉桂醛的抑菌活性，結(jié)果顯示：二者對真菌的抑制效果均強(qiáng)于細(xì)菌；肉桂醛對金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和綠膿桿菌的抑制效果優(yōu)于肉桂精油，二者對枯草芽孢桿菌的抑制效果相近，而肉桂精油對大腸桿菌的抑菌效果優(yōu)于肉桂醛。

3.2當(dāng)質(zhì)量濃度為16 g/L時(shí)，肉桂精油的ABTS+·清除率為94.1%，是相同濃度肉桂醛的3倍；FRAP值為1 502 μmol/L，是相同濃度肉桂醛的5.8倍。肉桂精油的抗氧化活性優(yōu)于肉桂醛。

3.3肉桂精油對酪氨酸酶的半數(shù)抑制質(zhì)量濃度(IC50)為4.02 g/L，而肉桂醛對酪氨酸酶的IC50小于1.25 g/L。由此可知，相對于肉桂精油，肉桂醛具有更好的酪氨酸酶抑制效果。