聚乳酸羥基乙酸-甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白復(fù)合微球的制備 形態(tài)表征及生物相容性研究

劉金晶， 周強強， 龍桂月， 黃 臻， 廖紅兵

隨著生物制藥和生物醫(yī)學(xué)的快速發(fā)展，生物活性大分子治療發(fā)展迅速，而如何將生物活性大分子安全有效地運載至體內(nèi)，并保持有效濃度，是其臨床應(yīng)用的主要挑戰(zhàn)之一。理想的生物活性大分子運載系統(tǒng)需具備以下性能：(1)良好的生物相容性；(2)生物可降解性；(3)非免疫原性[1]。聚乳酸羥基乙酸(polylactide-co-glycolide，PLGA)是一種常用的高分子可降解聚合物，在水環(huán)境內(nèi)，聚合物的酯鍵水解，每個水解酯鍵形成一個羥基和一個羧基。酯鍵水解導(dǎo)致聚合物長鏈被切斷，增加PLGA的親水性，更易形成水溶性碎片。最終，這些水溶性碎片降解成為乳酸和乙醇酸，可進(jìn)一步在體內(nèi)被降解為二氧化碳和水，對機體無毒性[2]。由于PLGA具有優(yōu)異的生物相容性和生物降解性，已被美國食品藥品監(jiān)督管理局(Food and Drug Administration，F(xiàn)DA)批準(zhǔn)為有效的藥物傳遞載體[3-4]。蛋白質(zhì)可通過包埋和吸附的方式加載到空白PLGA微球內(nèi)，制成藥物緩釋體系。除了微球給藥體系，另有藥物涂層等方式[5]。有研究者設(shè)計并成功制備出負(fù)載胰島素的PLGA納米顆粒，并且PLGA納米顆粒外覆由5β-膽酸修飾的乙二醇?xì)ぞ厶?，以此改善胰島素的口服給藥效果[6]。PLGA還能與一些骨替代材料，如羥基磷灰石、磷酸鈣類材料復(fù)合，以改善骨替代材料的性能[7-9]。甲狀旁腺激素相關(guān)蛋白(parathyroid hormone-related protein,PTHrP)對骨代謝有雙重作用，有研究表明在低濃度劑量作用下，PTHrP能促進(jìn)骨生成，而在高濃度作用下則會引起破骨效應(yīng)[10]。磷酸鈣骨水泥(calcium phosphate cement，CPC)具有良好的生物相容性、骨誘導(dǎo)性、骨傳導(dǎo)性、自凝性以及可注射性，但是其降解效率低，材料凝固后內(nèi)部缺少孔隙，這使得CPC的降解速率與新骨生成速率不匹配[11-12]。將PTHrP裝載到PLGA微球[即負(fù)載PTHrP的PLGA微球(polylactide-co-glycolide microspheres loaded with parathyroid hormone-related protein,PLGA-PTHrP)]，將其引入CPC內(nèi)部，得到CPC/PLGA-PTHrP復(fù)合材料體系。PLGA降解，PTHrP持續(xù)釋放以促進(jìn)CPC的早期降解，在CPC內(nèi)部形成分散的孔隙，促進(jìn)早期成骨[13]。本研究制備PLGA-PTHrP，并觀察其在體外的表征、蛋白質(zhì)釋放特點，以及其對大鼠全骨髓細(xì)胞的增殖效應(yīng)影響?，F(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1材料與儀器 聚乙烯醇(poly vinyl alcohol，PVA；四川維尼綸廠)，二氯甲烷(天津大學(xué)科威公司)，PLGA(分子量1.3萬，羧基末端，50∶50；山東省藥學(xué)科學(xué)院)，PTHrP(美國Protech)，集熱式磁力攪拌器(德國IKA)，掃描電子顯微鏡(德國Zeiss)，冷凍干燥機(上海億倍實業(yè))，AMEM培養(yǎng)液(美國HyClone)，胎牛血清(澳洲GIBCO)，青鏈霉素混合液(北京索萊寶有限公司)。SD大鼠購自廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實驗動物中心。

1.2實驗方法

1.2.1 復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備空白PLGA微球 2 g PVA中加入100 ml去離子水，放置于集熱式磁力攪拌器上，緩慢加熱至90 ℃，持續(xù)攪拌至PVA完全溶解，制備成2% PVA外相水。取60 mg PLGA于15 ml離心管，轉(zhuǎn)移至通風(fēng)櫥內(nèi)，加入3 ml二氯甲烷，高速震蕩至PLGA完全溶解，制備成20%初乳。向初乳內(nèi)加入0.9 ml去離子水，高速震蕩10 s，將所得溶液快速轉(zhuǎn)移至5 ml注射器內(nèi)，快速均勻滴加至30 ml 2% PVA外相水中，冰浴下磁力攪拌機8 000 r/min，15 s，制備成復(fù)乳。將復(fù)乳溶液轉(zhuǎn)移至含270 ml去離子水的燒杯內(nèi)，置于磁力攪拌機上，500 r/min攪拌4 h，使二氯甲烷揮發(fā)。溶劑揮發(fā)后，停止攪拌，靜置0.5 h，得到白色沉淀物，即為PLGA空白微球。收集白色沉淀于離心管，雙蒸水洗滌，室溫下4 000 r/min，離心5 min，反復(fù)吹打洗滌3次。將收集到的空白PLGA微球在真空冷凍干燥機內(nèi)冷凍干燥24 h，-20 ℃保存。

1.2.2 PLGA-PTHrP制備 無菌條件下，配制不同濃度的PTHrP溶液，分為：A組，1.5 μg/ml；B組，1.0 μg/ml；C組，0.5 μg/ml。各組蛋白質(zhì)溶液均為5 ml。稱取0.2 g空白PLGA微球，將微球與各組蛋白質(zhì)溶液混合，震蕩混勻，靜置30 min，收集微球，冷凍干燥，-20 ℃低溫保存。

1.2.3 微球形態(tài)觀察及粒徑測量 取空白PLGA微球制樣，掃描電鏡下觀察微球形態(tài)結(jié)構(gòu)，使用激光粒度分析儀測量微球的粒徑范圍，計算平均粒徑。掃描電鏡圖用Image-Pro Plus軟件分析。

1.2.4 PLGA-PTHrP的體外釋放檢測 根據(jù)試劑盒說明書配制BCA工作液，取10 μl的標(biāo)準(zhǔn)品蛋白溶液(5 mg/ml)，生理鹽水稀釋10倍作為蛋白標(biāo)準(zhǔn)品。分別取標(biāo)準(zhǔn)品0、1、2、4、8、12、16、20 μl加到96孔板內(nèi)，再分別加入20、19、18、16、12、8、4、0 μl生理鹽水，混勻，每孔終體積為20 μl。向各孔內(nèi)分別加入200 μl BCA溶液，靜置1 h。應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測595 nm波長下各孔OD值，繪制蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線。后將200 μg載不同濃度PTHrP的PLGA微球分別浸泡在含1 ml磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffered saline,PBS)的離心管內(nèi)，37 ℃恒溫?fù)u床振蕩，并于1 h、6 h、12 h、1 d、2 d、4 d、6 d、8 d、10 d和12 d，分別取20 μl浸提液，應(yīng)用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行檢測，根據(jù)所得OD值和蛋白濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線計算PTHrP濃度，并繪制蛋白累計釋放曲線。

1.2.5 PLGA-PTHrP對全骨髓細(xì)胞增殖影響的觀察

取4～8周齡SD大鼠，以過量麻醉法處死，無菌條件下分離取出股骨、脛骨，去凈軟組織，儲存于PBS溶液(含1%青鏈霉素雙抗)中。移至超凈工作臺，剪去兩端骨骺端，用注射器吸取AMEM培養(yǎng)液(含1%青鏈霉素雙抗)從兩端沖出骨髓直至髓腔發(fā)白。收集培養(yǎng)液于離心管，1 500 r/min離心5 min，棄上清液，細(xì)胞重懸接種于T25培養(yǎng)瓶，使用含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)，1%雙抗的AMEM培養(yǎng)液作為完全培養(yǎng)液，于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)16 h，培養(yǎng)條件設(shè)置為37 ℃、5% CO2。收集上清液，1 000 r/min離心5 min，棄上清后重懸，重新接種于T25培養(yǎng)瓶中。每2 d換液1次，繼續(xù)培養(yǎng)3 d。收集細(xì)胞，以4×104cells/ml細(xì)胞濃度接種至96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μl。實驗分組：空白對照組(完全培養(yǎng)液)、PLGA微球組(含1 mg/ml空白PLGA微球的完全培養(yǎng)液)、PLGA-PTHrP組(含1 mg/ml PLGA-PTHrP微球的完全培養(yǎng)液)。培養(yǎng)12 h、1 d、3 d、5 d、7 d、9 d后，每孔加入10 μl，5%的CCK-8溶液，避光培養(yǎng)2.5 h，酶標(biāo)儀檢測記錄450 nm波長下各孔OD值。

2 結(jié)果

2.1PLGA微球形態(tài)觀察和粒徑檢測結(jié)果 在200倍鏡下，PLGA微球呈球形或類球形，分散均勻。500倍鏡下，可見微球表面較規(guī)則平整，有些微球呈現(xiàn)為多孔狀。隨機選擇300個微球，經(jīng)激光粒度分析儀測算，微球的平均粒徑為(56.73±7.22)μm。見圖1～2。

?200×；?500×；?1 000×；?1 000×

圖2 PLGA微球粒徑分布圖

2.2PLGA-PTHrP體外釋放檢測結(jié)果 在前100 h，各組載蛋白微球的蛋白釋放速率較高，蛋白釋放量達(dá)到蛋白總量的63.1%。隨后進(jìn)入釋放平緩期，總緩釋時間達(dá)到300 h。至緩釋結(jié)束，蛋白釋放量達(dá)總量的87.3%。見圖3。

圖3 PLGA-PTHrP的PTHrP累計釋放量變化圖

2.3PLGA-PTHrP對全骨髓細(xì)胞增殖活性的影響

CCK-8檢測結(jié)果顯示，在細(xì)胞接種后第1天，三組細(xì)胞均無明顯的增殖現(xiàn)象，隨后細(xì)胞進(jìn)入指數(shù)生長期，增殖速度明顯升高。到第7～9天時，細(xì)胞增殖速度減緩。三組細(xì)胞的增殖情況無顯著差異。見圖4。

圖4 三組不同時間點OD值變化圖

3 討論

3.1微球研發(fā)的歷史可追溯至20世紀(jì)末期，按構(gòu)成微球的成分可將其分為有機聚合物微球和無機微球。本研究所制微球?qū)儆谟袡C聚合物微球。構(gòu)成有機聚合物微球的有機聚合物主要包含蛋白類高分子聚合物，如明膠、白蛋白、多糖類高分子聚合物以及合成類高分子聚合物等[14]。明膠是一種天然高分子蛋白，具有良好的生物相容性和降解性。在醫(yī)學(xué)方面，明膠微球常用于藥物緩釋、栓塞治療、體內(nèi)示蹤和組織工程等方面；在藥物緩釋方面，明膠微球的體外藥物釋放率與明膠微球的溶脹率有關(guān)。有學(xué)者制備了與更昔洛韋交聯(lián)的明膠微球，其體外藥物釋放與明膠和藥物的比例有關(guān)，明膠和藥物的比值越高，釋放越慢，藥物突釋效應(yīng)越小[15]。殼聚糖中含有大量的氨基和羥基，是天然堿性多糖，有良好的生物相容性、可降解性，故殼聚糖在組織工程、藥物遞送、藥物緩釋等方面廣泛應(yīng)用。殼聚糖常與明膠制備成明膠-殼聚糖復(fù)合微球，常作為組織工程的支架。有研究分別制備了包裹雙氯酚酸鈉的明膠微球、殼聚糖微球和明膠-殼聚糖復(fù)合微球，體外釋放實驗結(jié)果顯示復(fù)合微球的前期藥物突釋情況、釋藥時間以及藥物釋放量優(yōu)于單一微球[16]。PLGA等合成高分子聚合物成球性好，化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定，能穩(wěn)定地釋放裝載在微球里的藥物等活性物質(zhì)，釋放速率對藥物性質(zhì)的依賴性較小[17]。PLGA微球制備方法包括復(fù)乳溶劑揮發(fā)法、噴霧干燥法、相分離法、微流體法、膜乳化技術(shù)等。噴霧干燥法制得微球的藥物包封率較高，生物活性好，而微粒容易黏附在噴霧干燥器的內(nèi)壁，對于熱敏性高的藥物，則不適用該方法。相分離法制備過程復(fù)雜，對攪拌方式、攪拌速度、有機溶液種類、有機溶液濃度、萃取液等因素都有嚴(yán)格的要求，同時對載藥微球的粒徑、形態(tài)、藥物包封率等有顯著影響[18-19]。膜乳化技術(shù)制備的微球尺寸均一，條件可控，能制備小粒徑的載藥微球，但是微球生成的速率較緩慢[20]。復(fù)乳溶劑揮發(fā)法是制備載蛋白以及肽類藥物微球的金標(biāo)準(zhǔn)。該法簡單易行，能在一定程度上控制微球粒徑，但是在封裝蛋白質(zhì)等大分子時，蛋白質(zhì)分子在水-有機物介質(zhì)表面容易發(fā)生結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定，有可能會造成結(jié)構(gòu)展開或者聚集。目前主要通過添加血清白蛋白、糖類等賦形劑來維持蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定[21]。

3.2在以上幾種微球類型以及制備方法中，經(jīng)綜合考慮設(shè)備要求、制備工藝、操作可行性以及裝載藥物類型，本課題組選擇復(fù)乳溶劑揮發(fā)法制備微球。結(jié)果顯示，所得PLGA微球的尺寸均勻，形態(tài)規(guī)則，且最終制得的PLGA-PTHrP微球在體外實驗中顯示出較好的緩釋效應(yīng)。CCK-8實驗表明，與空白對照組相比較，空白微球和載蛋白微球共培養(yǎng)細(xì)胞的增殖效應(yīng)并未受到抑制，提示PLGA微球和載蛋白濃度為1.5 μg/ml的微球?qū)Υ笫笕撬杓?xì)胞沒有毒性，生物相容性好，可用于后續(xù)實驗研究。PTHrP可以通過上調(diào)核因子-κB受體活化因子配基(receptor activator of nuclear factor-κB ligand,RANKL)表達(dá)，促進(jìn)破骨前體細(xì)胞向破骨細(xì)胞分化，促進(jìn)骨吸收。本課題組的前期研究發(fā)現(xiàn)，PLGA作為致孔劑制備的CPC/PLGA復(fù)合材料在植入體內(nèi)4周可觀察到破骨樣細(xì)胞首先對PLGA微球進(jìn)行吞噬消化，在CPC基質(zhì)內(nèi)部形成孔隙，后期形成的新骨與微球降解前的形態(tài)一致，呈骨球狀[7]。本課題組將PTHrP負(fù)載于PLGA微球內(nèi)制備得到PLGA-PTHrP，其創(chuàng)新點在于PLGA既作為蛋白載體也作為一種致孔劑，后續(xù)工作把該復(fù)合微球引入骨替代材料(如CPC內(nèi)部)，期望通過PLGA的早期降解以及PTHrP的局部釋放促進(jìn)破骨活動，以加速CPC的早期降解，彌補其降解速度與新骨生成速度不匹配的缺點。

3.3但是，本實驗也有一些不足之處：PTHrP在初期有蛋白突發(fā)釋放的現(xiàn)象，各組載蛋白PLGA微球在前100 h內(nèi)蛋白的釋放速率較快，釋放量達(dá)到蛋白總量的63.1%。關(guān)于如何解決藥物突發(fā)釋放問題，仍是目前載藥系統(tǒng)研發(fā)的難點之一。藥物的釋放一般可以分為初始突發(fā)釋放、滯后時間、侵蝕加速釋放三個階段[22]。藥物的突發(fā)釋放與PLGA微球表面的弱結(jié)合以及吸附分子有關(guān)，該階段不利于藥物的持續(xù)釋放。為了解決藥物的突發(fā)釋放問題，目前的研究主要集中在改進(jìn)制備微球的配方以及對負(fù)載藥物的修飾上。在制備過程中可以縮短溶劑蒸發(fā)時間或選擇無毒的有機溶劑。此外，還有研究者制備載艾塞那肽的卵磷脂納米粒，再將納米顆粒封裝進(jìn)PLGA微球內(nèi)，結(jié)果顯示，封裝納米顆粒的PLGA微球初始突發(fā)釋放明顯減少[23-24]。

綜上所述，本研究成功制備了負(fù)載有效濃度PTHrP的PLGA微球，但只探索了其在體外的緩釋效應(yīng)以及其對細(xì)胞增殖效應(yīng)的影響，還需進(jìn)一步驗證該載藥系統(tǒng)的生物相容性，并進(jìn)行動物實驗以驗證其在體內(nèi)的緩釋效應(yīng)。