馬文奎，吳 昊，閻來慶，關(guān)盛宇，徐 尚，周 強，錢立華，郭小凱，劉 強，劉奮澤，阿布力孜·吾斯曼，劉國世*

（1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 100193；2.新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科學(xué)學(xué)院，烏魯木齊 830052；3.內(nèi)蒙古金草原生態(tài)科技集團有限公司，內(nèi)蒙古 巴彥淖爾 015115）

湖羊是世界著名的多胎綿羊品種，也是我國一級地方保護畜禽品種和唯一的白色羔皮羊品種，具有適應(yīng)能力強、性成熟早、繁殖率高、多羔等優(yōu)良性狀。近年來隨著畜牧業(yè)集約化、規(guī)?；目焖侔l(fā)展，人工授精技術(shù)在全世界得到廣泛應(yīng)用，為提高養(yǎng)殖生產(chǎn)效率，優(yōu)質(zhì)種公羊的精液需求量也在逐年增加。精液冷凍保存不僅可以延長優(yōu)質(zhì)精液保存時間，還能提高優(yōu)秀種公羊的種用價值和利用率。

褪黑素（melatonin，MT）是一種主要由松果腺分泌的神經(jīng)激素，具有多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)睡眠、抗衰老、抗凋亡、抗氧化應(yīng)激、提高免疫力等。褪黑素在精液冷凍過程中通過清除精子細胞內(nèi)過量的活性氧，提高凍后精子質(zhì)量。在雞精液冷凍試驗中發(fā)現(xiàn)，添加0.25 mg／mL褪黑素可以顯著提高冷凍精液解凍后精子活力、質(zhì)膜完整率和頂體完整率，并伴隨著解凍后精液超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）和谷胱甘肽過氧化物酶（GPx）活性上升及丙二醛（MDA）和活性氧（ROS）水平的降低。在小鼠精液冷凍試驗中發(fā)現(xiàn)，補充0.125 mg／mL褪黑素可減少氧化損傷和細胞凋亡，精子活力提高。也有研究表明，添加褪黑素對公豬精子特性及后續(xù)體外胚胎發(fā)育具有改善作用，使卵母細胞的囊胚發(fā)育速率顯著提高。與褪黑素有關(guān)的多數(shù)試驗集中在褪黑素濃度處理上，且只分析了冷凍精液的品質(zhì)，并沒有相關(guān)的輸精試驗。為此，本試驗以湖羊為研究對象，通過在精液冷凍液中添加褪黑素，探究褪黑素對冷凍精液解凍后精子運動能力、妊娠率和產(chǎn)羔性能的影響，為褪黑素在冷凍精液中的使用奠定基礎(chǔ)，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 試驗動物

體質(zhì)健壯的2歲湖羊種公羊4只，體重為80～90 kg，無繁殖疾病，膘情良好；初產(chǎn)湖羊母羊100只，作為人工授精受體，體重為40～45 kg。湖羊公羊、母羊均由內(nèi)蒙古巴彥淖爾市金草原生態(tài)科技集團有限公司提供。

1.2 藥品

孕馬血清促性腺激素（pregnant mare serum gonadotropin，PMSG，批號為191222）、促排3號（A3），由寧波三生藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；陰道栓、維生素A-D（批號為180601），均購自北京綠欣康農(nóng)牧科技有限公司。

1.3 主要試劑

精液冷凍稀釋液Ⅰ液（TYYDJSJ-400-Ⅰ，貨號為TYXS20）、精液冷凍稀釋液Ⅱ液（TYYDJSJ-400-Ⅱ，貨號為TYXS20），均購自北京田園奧瑞生物科技有限公司；75%乙醇、碘酒、新潔爾滅等均為國產(chǎn)，市購；新鮮雞蛋，市購。

1.4 主要儀器和用品

冰箱（型號為BCD-182LTMPA），購自青島海爾股份有限公司；水浴鍋（型號為DZKW-D-2），購自北京市光明醫(yī)療儀器有限公司；精液質(zhì)量分析系統(tǒng)（型號為CASAS-QH-Ⅲ），購自清華同方股份有限公司；B超儀（型號為RKU10），購自徐州市凱信電子設(shè)備有限公司；冷凍泡沫箱、0.25 mL細管碼架及搓板，北京田園奧瑞生物科技有限公司自主研發(fā)；液氮罐、10 mL／50 mL注射器、載玻片、蓋玻片、紅寶石計數(shù)板、大鑷子、吸水紙、記號筆、10 μL／200 μL／1 000μL槍頭、1.5 mL離心管、剪刀，均為國產(chǎn)，市購；采精器（假陰道）和輸精槍，內(nèi)蒙古巴彥淖爾市金草原生態(tài)科技集團有限公司提供；10μL／200μL／1 000μL（Eppendorf）移液器、顯微鏡，市購。以上儀器和用品均由中國農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院動物遺傳育種與繁殖重點實驗室提供。

2 方法

2.1 儀器和用品的準備

通過空調(diào)將室溫控制在25℃左右，水浴鍋調(diào)至30～35℃。提前備好注射器、離心管、搓板、碼架、記號筆等器材。開機預(yù)熱顯微鏡。

2.2 稀釋液的配制和預(yù)熱

按照羊冷凍稀釋液說明書配制稀釋液。每瓶80 mL稀釋液加蛋黃20 mL，大約需要取新鮮雞蛋2個；用75%乙醇消毒、擦凈雞蛋表面；打開蛋殼，漏掉蛋清，將蛋黃倒在吸水紙上，輕輕滾動蛋黃，將蛋清擦凈；用10 mL注射器抽取10 mL蛋黃加入基礎(chǔ)液中，另用10 mL注射器取6.5 mL甘油加到稀釋液中；將冷凍液分成4個組，褪黑素1×10mol／L（1組）、1×10mol／L（2組）、1×10mol／L（3組），對照組不添加褪黑素；反復(fù)顛倒混勻后，將稀釋液放入水浴鍋中預(yù)熱；未用完的稀釋液置冰箱冷藏保存，備用。

2.3 采精

為誘導(dǎo)公羊爬跨，刺激公羊性欲，采精開始前尋找一只當日發(fā)情母羊，保定在采精架上，備用；用75%乙醇對假陰道和集精杯進行清洗消毒，最后用生理鹽水沖洗干凈，直至75%乙醇被完全沖洗干凈，假陰道中裝滿用溫度計調(diào)試好的38℃溫水；4只公羊依次進行采精，采精前需要用衛(wèi)生紙將陰莖部位擦拭干凈。采精時需注意保溫并避免污染，做好采精量、顏色等記錄。

2.4 精液分析與稀釋

將精液置于水浴鍋中保溫；根據(jù)集精杯刻度讀取采精量，或者用10 mL注射器量出采精量；按精液、稀釋液1∶3比例向精液中緩慢加入稀釋液，邊加邊混勻；然后取稀釋后精液200μL加到1.5 mL離心管中，再加入800μL稀釋液，混勻；取3μL左右精液滴到精液質(zhì)量分析系統(tǒng)專用載玻片上，蓋好蓋玻片；用顯微鏡低倍鏡找到精子，然后換到適宜倍數(shù)物鏡下（20×），用精液質(zhì)量分析系統(tǒng)檢測精子活力、平均曲線運動速度（VCL）、平均直線運動速度（VSL）、平均路徑速度（VAP）、精子平均側(cè)擺幅度（ALH）、直線運動精子活率，檢測3～7個視野，取平均值。若精液質(zhì)量太差，精子活力低于60%則不進行冷凍。若精液質(zhì)量較好、精子活力大于60%則根據(jù)精子密度檢測結(jié)果將精液進一步稀釋為1億／mL。

2.5 平衡

封好的精液放在碼架上和搓板等一并放入4℃低溫操作柜，平衡3～4 h。

2.6 灌裝封口

稀釋后的精液，操作人員用口吸入0.25 mL冷凍管灌裝，用封口粉處理封口，用無菌紗布擦去多余封口粉，最后在細管上標注羊號及冷凍日期。

2.7 冷凍

提前將液氮罐中的液氮倒在冷凍泡沫盒中，待平衡至4℃時，碼架和搓板等一并放入熏蒸箱中熏蒸10 min，熏蒸結(jié)束時將碼架和搓板取出，隨后將精液細管浸入液氮中。

2.8 裝袋保存

經(jīng)檢測合格的細管凍精裝入拇指管，然后裝入紗布袋，放入液氮罐保存。注意防止人員凍傷，做好標簽，及時添加液氮。

2.9 精液品質(zhì)的檢測

將水浴鍋水溫調(diào)至37℃。用鑷子取一支冷凍好的細管精液，迅速放入水浴鍋中解凍至少30 s，擦凈管外的水，然后用剪刀剪開細管封口端，滴一滴精液到精液質(zhì)量分析系統(tǒng)載玻片上，蓋好蓋玻片，在顯微鏡下觀察活力。利用計算機輔助精液質(zhì)量分析系統(tǒng)測定精子運動指標，包括精子活力、VCL、VSL、VAP、ALH、直線運動精子活率。

2.10 母羊處理

同期發(fā)情埋栓前，將100只母羊隨機分為4組：褪黑素1×10mol／L組（1組），24只母羊；褪黑素1×10mol／L 組（2 組），24 只母羊；褪黑素1×10mol／L組（3組），23只母羊；對照組22只母羊。一組羊一個圈舍。共計埋栓100只，有7只掉栓。

2.10.1 母羊同期發(fā)情處理 使用硅膠栓（CIDR）+PMSG+促卵泡素釋放激素（LRHA3）法對湖羊進行同期發(fā)情處理。在發(fā)情周期內(nèi)隨機選取1天植入CIDR栓（含30 mg孕酮），將其定為第0天，第13天撤去CIDR，撤栓時注射PMSG，劑量范圍為250～350 IU，24 h后用公羊試情，記錄發(fā)情時間。

2.10.2 子宮頸口輸精 首先將細管凍精取出，置于空中解凍15 s，然后放于37℃水浴中1 min，用衛(wèi)生紙擦干冷凍管表面水分，將封口粉一端對準15 mL離心管中，另一端用剪刀剪開。取1滴精液于載玻片上進行運動能力檢測。凍后精子活力在50%左右的放于恒溫箱中，備用。將經(jīng)過同期發(fā)情處理且確認發(fā)情的各組母羊進行人工保定。將精液輸至過子宮頸口第一褶皺處。每只母羊輸精2支解凍精液，輸精時同時使用A3 1 mL，在輸精12 h后進行復(fù)配。輸精完成做好標記。在輸精33 d后進行妊娠檢查。

2.11 母羊妊娠率、產(chǎn)羔率和羔羊成活率的測定

輸精后33天采用B超儀進行妊娠檢查，記錄妊娠母羊數(shù)，計算妊娠率。約150 d后產(chǎn)羔，統(tǒng)計產(chǎn)羔數(shù)和羔羊成活數(shù)，計算產(chǎn)羔率、羔羊成活率。

2.12 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析

精液冷凍前后相關(guān)指標檢測重復(fù)3次，數(shù)據(jù)使用SPSS 25.0軟件進行卡方檢驗（Chi-Square Test）。測定數(shù)據(jù)以“平均值±標準誤”表示。

3 結(jié)果與分析

3.1 不同個體雄性湖羊鮮精理化特性分析

4只湖羊公羊采精3次，每次均為乳白色，凍前精液的采精量、密度和精子活力均無顯著差異（P＞0.05），見表1。

表1 不同個體雄性湖羊鮮精理化特性分析Tab.1 Analysis of physical and chemical characteristics of fresh sperm of different male Hu sheep

3.2 不同濃度的褪黑素對湖羊精液冷凍前后精子活力及運動能力的影響

使用精液質(zhì)量分析系統(tǒng)對湖羊精液冷凍前后進行運動能力檢測，結(jié)果表明：各組精子活力、VCL、VSL、VAP和直線運動精子活率均顯著低于凍前（P＜0.05）；1組精子活力顯著高于3組和對照組（P＜0.05），VCL顯著高于對照組（P＜0.05）；2組精子活力、VCL、VSL、直線運動精子活率均顯著高于1組、3組和對照組（P＜0.05），VAP、ALH顯著高于對照組（P＜0.05）；3組VCL顯著高于對照組（P＜0.05）。說明2組褪黑色素劑量對精子冷凍后的活力、VCL、VSL、VAP、ALH和直線運動精子活率的保護效果較好。見表2。

表2 冷凍液中添加褪黑素后對冷凍精液的精子活力及運動能力的影響測定結(jié)果Tab.2 Viability and exercise ability of Hu sheep after freezing by adding melatonin to the frozen semen

3.3 冷凍稀釋液中添加褪黑素對湖羊冷凍精液子宮頸口輸精妊娠率的影響

利用子宮頸口輸精技術(shù)對93只同期發(fā)情湖羊母羊進行子宮頸口輸精，在配種后33天對配種妊娠率進行統(tǒng)計，結(jié)果表明：1組與其他組妊娠率差異不顯著（P＞0.05）；2組（70.83%）妊娠率顯著高于3組（40.91%）和對照組（39.13%，P＜0.05），與1組（45.83%）相比差異不顯著（P＞0.05）。說明2組褪黑色素劑量對精子冷凍后子宮頸口輸精妊娠率有較好效果。見表3。

表3 冷凍液中添加褪黑素后湖羊冷凍精液子宮頸口輸精妊娠率測定結(jié)果Tab.3 Pregnancy rate by cervical insemination of frozen semen of Hu sheep after adding melatonin to semen cryo-diluent

3.4 湖羊冷凍精液子宮頸口輸精對產(chǎn)羔率和成活率的影響

利用子宮頸口常規(guī)輸精技術(shù)對93只同期發(fā)情湖羊母羊進行輸精，配種后對產(chǎn)羔率進行統(tǒng)計，結(jié)果表明：1組產(chǎn)羔率為209.09%，羔羊成活率為91.30%；2組產(chǎn)羔率為217.65%，羔羊成活率為94.59%；3組產(chǎn)羔率為211.11%，羔羊成活率為89.47%；1，2，3組產(chǎn)羔率和羔羊成活率與對照組（200.00%）相比差異不顯著（P＞0.05）。說明精液冷凍液中添加褪黑素對母羊產(chǎn)羔率和羔羊成活率沒有顯著影響。見表4。

表4 湖羊冷凍精液子宮頸口輸精產(chǎn)羔率和羔羊成活率測定結(jié)果Tab.4 Lambing rate and survival rate of frozen semen in cervical orally insemination of Hu sheep

4 討論與結(jié)論

4.1 冷凍液中添加褪黑素對精子活力的影響

褪黑素已在精液冷凍過程中廣泛使用。郭良勇等在湖羊冷凍液中添加不同濃度（10，20，30 mg／mL）褪黑素，結(jié)果表明：褪黑素20 mg／mL組頂體膜完整率極顯著提高，谷胱甘肽（GSH）含量極顯著升高，丙二醛（MDA）含量極顯著降低。本試驗最佳褪黑素濃度（1×10mol／L，換算后相當于2.3 mg／mL）低于郭良勇等的試驗濃度。山羊冷凍稀釋液添加1×10mol／L褪黑素能夠改善解凍后精液品質(zhì)。宋博宇在精液低溫保存過程中發(fā)現(xiàn)，褪黑素添加濃度為20 mg／L時，精液保存5 d后精子活率、質(zhì)膜完整率、頂體完整率和線粒體活性顯著高于對照組。同樣，吳美靈利用褪黑素及其代謝產(chǎn)物 清除活性氧，結(jié)果表明：1×10mol／L 和1×10mol／L褪黑素能顯著提高安格斯牛的精子活力、質(zhì)膜和線粒體膜完整性。本試驗的試驗動物（湖羊）和添加濃度（1×10mol／L、1×10mol／L、1×10mol／L）與吳美靈選取的試驗動物（安格斯）和濃度（1×10mol／L、1×10mol／L）不一致，但都通過添加褪黑素使精子活力提高。李方舟等發(fā)現(xiàn)，褪黑素能夠提高低溫保存的羊精液品質(zhì)和存活時間。吳大平的研究表明，在水牛精液冷凍稀釋液中添加褪黑素可以降低精子畸形率，提高凍后精子活力。褪黑素可以通過激活體內(nèi)過氧化物酶而間接發(fā)揮抗氧化作用，以減少精子活性氧的產(chǎn)生，從而起到提高精子活力的作用。楊寶衛(wèi)等研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能有效提高豬精子活力。以上研究中的試驗條件和試驗動物與本試驗不同，但結(jié)果一致。

4.2 冷凍液中添加抗氧化劑對妊娠率的影響

趙霞等未在蒙古羊冷凍精液中添加任何抗氧化劑，輸精后結(jié)果表明，利用腹腔鏡輸精法的受體受胎率平均值最高（60.20%）；其次為過子宮頸第二到第三皺褶（3～4 cm）輸精，受體受胎率平均值為58.3%；過子宮頸第一皺褶（1～2 cm）輸精法和常規(guī)輸精法的受體受胎率平均值相近，分別為37.5%和36.30%。本試驗中，冷凍液中添加褪黑素1×10mol／L后輸精，母羊妊娠率（70.83%）高于趙霞等采用內(nèi)窺鏡在子宮頸口輸冷凍精液的效果（37.5%）。這可能是由于試驗動物不同、在未添加任何抗氧化劑的情況下使得精子活力較低，妊娠率有所下降；本試驗輸精過程中采用的是過子宮頸口第一褶皺，對照組妊娠率（39.13%）略高于趙霞等常規(guī)輸冷凍精液的結(jié)果（36.30%）。這可能是由于冷凍過程中操作流程、試驗動物不同導(dǎo)致。不同動物精子對降溫的敏感程度不同，而羊精子對低溫環(huán)境更加敏感。一般情況下活力不超過50%，這是導(dǎo)致冷凍精液人工授精受胎率不高的原因之一。羊冷凍精液保存過程中的關(guān)鍵問題是人工在冷凍—解凍—輸精操作誤差或通過尋找酶類抗氧化劑和非酶類抗氧化劑等減少降溫過程中對精子造成的損傷，因此尋求更好的保護劑提高羊精液冷凍保存后的精子存活率和受胎率，對羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。

本試驗結(jié)果表明：冷凍稀釋液中添加褪黑素1×10mol／L、1×10mol／L、1×10mol／L均有利于提高冷凍精液解凍后的運動能力和解凍后輸精的妊娠率，其中添加1×10mol／L的效果最好。