毛荷蓮 劉婷

肝癌作為發(fā)病率最高的腫瘤之一,其在中國(guó)的發(fā)病率和死亡率一直居高不下［1］。肝硬化以及慢性肝炎感染是肝癌發(fā)生發(fā)展的重要危險(xiǎn)因素,肝癌的發(fā)病率與這些情況密切相關(guān)［2］。由于大多數(shù)肝癌患者診斷于肝功能不全的晚期,所以死亡率和肝癌發(fā)病率大致是相似的［3］。經(jīng)過(guò)對(duì)肝癌的長(zhǎng)期研究,盡管在肝癌患者的治療方面取得了一定進(jìn)展,包括肝切除和肝移植等。但由于肝癌進(jìn)展迅速,且肝癌的早期診斷具有挑戰(zhàn)性,大多數(shù)肝癌患者仍預(yù)后不良［4-6］。因此,提高早期肝癌患者檢出率對(duì)于臨床治療肝癌具有重要意義,成為當(dāng)前臨床診治和基礎(chǔ)研究急需解決的難題,其難點(diǎn)在于尋找新的且有效的肝癌分子生物學(xué)標(biāo)志。RASSF1基因在人類癌細(xì)胞的生長(zhǎng)和發(fā)展過(guò)程中起著重要作用［7］。已有研究表明該基因參與細(xì)胞凋亡、細(xì)胞周期控制、微管穩(wěn)定性調(diào)節(jié)和腫瘤抑制,且在其他研究中顯示RASSF1 在暴露于E2 后可在各種癌癥中沉默［8-11］。然而,當(dāng)前鮮有對(duì)于RASSF1 基因與肝癌臨床指征的相關(guān)性的研究。因此,本文選擇應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)胃癌組織及相應(yīng)癌旁組織中RASSF1表達(dá)量,并分析兩者之間的相關(guān)性。隨后,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將沉默RASSF1 的siRNA、siRNA-NC、分別導(dǎo)入細(xì)胞內(nèi),采用CCK-8 實(shí)驗(yàn)、transwell 細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2014 年1 月～2019 年12 月期間本院收錄的154 份肝癌病理組織樣本,所有患者均經(jīng)術(shù)后病理組織學(xué)檢查明確其肝癌診斷。納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合肝癌的診斷標(biāo)準(zhǔn)；②患者初診、手術(shù)之前并未接受任何抗腫瘤治療,包括放療,化療等手段；③臨床病理資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：①具有家族遺傳性疾病者；②合并其他腫瘤患者。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn),患者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 RASSF1 表達(dá)水平的檢測(cè) 通過(guò)RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)肝癌組織以及對(duì)應(yīng)癌旁組織中RASSF1 表達(dá)量,并對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。

實(shí)時(shí)檢測(cè)熒光定量PCR,通過(guò)Trizol 法提取細(xì)胞總RNA,借逆轉(zhuǎn)錄試劑盒,將提取出的RNA 反轉(zhuǎn)錄為cDNA,以cDNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增,在PCR 儀中按反應(yīng)條件為 95℃,30 s；95℃,5 s；60℃,30 s,共進(jìn)行40 個(gè)反應(yīng)循環(huán)。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)為內(nèi)參,采用 2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次,取平均值。引物序列見(jiàn)表1。

表1 PCR 引物序列

1.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代 選取10%胎牛血清、雙抗的高糖DMEM 培養(yǎng)基用于細(xì)胞培養(yǎng)液,將細(xì)胞培養(yǎng)在含5%CO2、37℃的細(xì)胞培養(yǎng)箱中。將細(xì)胞培養(yǎng)至細(xì)胞融合率達(dá)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期即可進(jìn)行傳代。使用胰酶消化細(xì)胞后加入完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,充分離心后棄上清,保留沉淀的細(xì)胞。加入完全培養(yǎng)基后用移液器吹打細(xì)胞使其散開(kāi)。將單細(xì)胞懸液分別裝入2～3 個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)瓶中,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染 將細(xì)胞制成單細(xì)胞懸液,隨后將其接種于六孔板中,繼續(xù)培養(yǎng)至細(xì)胞融合度達(dá)半數(shù)左右更換Opti-MEM 無(wú)血清培養(yǎng)基。將RASSF1 模擬物、以及無(wú)關(guān)對(duì)照序列分別稀釋后按比例與Opti-MEM 培養(yǎng)基混勻,而后將lipo2000、質(zhì)粒分別按比例與制好的Opti-MEM 混合液相混,一段時(shí)間后,將兩者混勻后靜置,然后將轉(zhuǎn)染液緩慢加入相應(yīng)的孔中。4～6 h 后更換為完全培養(yǎng)基,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)。

1.2.4 CCK-8 實(shí)驗(yàn) 常規(guī)培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,制成單細(xì)胞懸液接種于96 孔板,繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)24 h 后,加入CCK-8 反應(yīng)液,在細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育1～2 h。在酶標(biāo)儀上450 nm 處檢測(cè)細(xì)胞的熒光表達(dá)量。

1.2.5 transwell 細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞,使用胰酶消化,含1%FBS 的DMEM培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,調(diào)整細(xì)胞密度。將transwell 小室放置于24 孔板中,先在小室中加入100 μl 單細(xì)胞懸液,在下層24 孔板中加入500 μl 完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h后取出小室,棄培養(yǎng)基,甲醛固定、結(jié)晶紫染色以及磷酸緩沖液(PBS)清洗小室后,使用倒置顯微鏡下觀察其外層濾膜上的細(xì)胞,隨機(jī)選取各小室5 個(gè)視野并計(jì)數(shù)。

1.2.6 transwell 細(xì)胞侵襲實(shí)驗(yàn) 取轉(zhuǎn)染后處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的各組細(xì)胞的單細(xì)胞懸液,在transwell 小室上鋪好Matrigel 凝膠并放置于24 孔板中,上室加入單細(xì)胞懸液,下室加入完全培養(yǎng)基。培養(yǎng)48 h 后取出小室,棄培養(yǎng)基,甲醛固定、結(jié)晶紫染色以及PBS 清洗各小室后,將其倒置顯微鏡下觀察其外層濾膜上的細(xì)胞,隨機(jī)選取各小室5 個(gè)視野并計(jì)數(shù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS25.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)數(shù)資料以率(%)表示,采用χ2檢驗(yàn)。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RASSF1 基因表達(dá)水平 RASSF1 在肝癌中高表達(dá),且其表達(dá)水平明顯低于癌旁組織。采用RT-PCR技術(shù)對(duì)肝癌組織及其對(duì)應(yīng)癌旁組織中RASSF1 的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè),肝癌組織中RASSF1 表達(dá)水平低于癌旁組織。見(jiàn)圖1A,圖1B。

圖1A RASSF1 基因表達(dá)水平離散圖

圖1B RASSF1 基因表達(dá)水平柱形圖

2.2 RASSF1 基因表達(dá)水平與臨床特征相關(guān)性分析RASSF1 基因表達(dá)水平與肝癌腫瘤大小、病理分級(jí)、AJCC 臨床分期相關(guān)(P<0.05),與患者的年齡、性別無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 RASSF1 基因表達(dá)水平與臨床特征相關(guān)性分析(n)

2.3 RASSF1 表達(dá)水平對(duì)肝癌患者預(yù)后情況的影響將患者生存時(shí)間與聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)檢測(cè)結(jié)果比對(duì)分析,繪制患者的預(yù)后生存曲線。見(jiàn)圖2。結(jié)果顯示,低表達(dá)RASSF1 的肝癌患者預(yù)后較差,而高表達(dá)RASSF1 的肝癌患者普遍預(yù)后較好。表明RASSF1 表達(dá)水平與患者的預(yù)后存在明顯相關(guān)。

圖2 RASSF1 表達(dá)水平對(duì)肝癌患者預(yù)后生存曲線

2.4 RASSF1 低表達(dá)對(duì)細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力的影響 為探究RASSF1 與肝癌的關(guān)系,通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)沉默肝癌LM3 細(xì)胞中RASSF1 的siRNA、siRNANC 分別導(dǎo)入至細(xì)胞內(nèi),應(yīng)用CCK-8 實(shí)驗(yàn)、transwell 細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)分別對(duì)各類細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力進(jìn)行評(píng)估,結(jié)果顯示,低表達(dá)細(xì)胞增殖OD 值為(1.45±0.19),高于對(duì)照細(xì)胞的(0.97±0.09),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。遷移實(shí)驗(yàn)中,低表達(dá)細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為(683±45),高于對(duì)照細(xì)胞的(384±29),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。侵襲實(shí)驗(yàn)中,低表達(dá)細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)為(512±33),高于對(duì)照細(xì)胞的(291±12),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。證明低表達(dá)RASSF1 可以促使細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)。

3 討論

原發(fā)性肝癌成為世界上第五大常見(jiàn)肝癌,具有高發(fā)病率的特征［12］。肝炎、脂肪肝和肝纖維化形成,都可能會(huì)最終發(fā)展為肝癌［13］。肝癌對(duì)于全球人類的健康造成威脅,2015 年,中國(guó)新發(fā)現(xiàn)并確診了46.6 萬(wàn)例肝癌病例,其中有42.2 萬(wàn)例死亡［14］。由于早期肝癌的檢出率不高,且大多數(shù)肝癌患者預(yù)后不良,使得當(dāng)前有關(guān)尋找新的肝癌相關(guān)分子生物學(xué)標(biāo)志的研究受到研究者們的高度重視。

RASSF1 基因最初是在使用XPA 作為誘餌的酵母雙雜交篩選中鑒定的［15］。自從其在3 號(hào)染色體(3p21.3)上常見(jiàn)雜合性缺失的最小區(qū)域內(nèi)被發(fā)現(xiàn)以來(lái),作為候選抑癌基因位點(diǎn)受到了廣泛的關(guān)注與研究。研究表明RASSF1 通過(guò)與MST1/2、LATS1、Sav1 和Mob1直接相互作用在rhBMP-2 治療中起到關(guān)鍵作用［16］。且RASSF1 高甲基化作為乳腺癌的生物標(biāo)志物可能與癌癥的預(yù)后有關(guān)［9］。另有研究發(fā)現(xiàn)RASSF1 作為腫瘤抑制基因可誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G1期以此調(diào)控細(xì)胞衰老［10］。雖然RASSF1 被報(bào)道能夠在多種癌癥中沉默表達(dá)［8,11］,然而,目前對(duì)于RASSF1 與肝癌相關(guān)性的研究鮮有報(bào)道。

本研究通過(guò)應(yīng)用RT-PCR 技術(shù)檢測(cè)臨床肝癌組織標(biāo)本以及癌旁組織中RASSF1 基因的表達(dá)量,分析該基因的表達(dá)與肝癌臨床相關(guān)指標(biāo)的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)。研究結(jié)果顯示,RASSF1 在肝癌組織中表達(dá)下調(diào),且與患者腫瘤大小、病理分級(jí)、AJCC 臨床分期有關(guān)。而后本研究從細(xì)胞層面上檢測(cè)了肝癌細(xì)胞系與正常肝細(xì)胞中RASSF1 的表達(dá)量,結(jié)果顯示肝癌細(xì)胞系中其表達(dá)量明顯下降,說(shuō)明RASSF1 的表達(dá)量對(duì)于肝癌的發(fā)生發(fā)展有重要意義。本研究采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)構(gòu)建低表達(dá)、其對(duì)照細(xì)胞系通過(guò)CCK-8、transwell 遷移實(shí)驗(yàn)及侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了各組細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力。結(jié)果表明低表達(dá)RASSF1 可以促使細(xì)胞增殖、遷移、侵襲能力增強(qiáng)。

綜上所述,RASSF1 具有成為肝癌早期診斷治療的分子生物學(xué)標(biāo)志的潛在價(jià)值。然而,對(duì)于RASSF1 高表達(dá)抑制肝癌的具體機(jī)制尚未明確,需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究闡明其具體的分子機(jī)制。期望后續(xù)工作可以激勵(lì)更多同行研究人員尋找用于早期診斷肝癌的分子生物學(xué)標(biāo)志從而為治療提供新的有效的分子靶點(diǎn)。