昂格力瑪，寶蘇日高，孟永梅

(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院蒙醫(yī)基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)中心，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110)

慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)是一種慢性腎臟疾病，其特征是腎功能緩慢進(jìn)行性下降，導(dǎo)致不可逆的腎硬化和腎單位喪失。近年來，CRF的發(fā)病率和死亡率明顯上升，給社會(huì)帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。在中國(guó)，2012年有1.195億CRF患者，總患病率為10.8%[1]。CRF終末期的主要治療方式是血液透析和腎移植，然而接受血液透析治療的患者患癌癥的總體風(fēng)險(xiǎn)更高[2]，腎移植方面雖取得了進(jìn)展，但有限的腎臟來源限制了其應(yīng)用。因此，從草藥或食用藥材中開發(fā)新的有效治療或緩解CRF的藥物勢(shì)在必行。

腎間質(zhì)纖維化是引起各種腎臟疾病發(fā)展為CRF的主要因素和重要環(huán)節(jié)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1，TGF-β1)在致纖維化細(xì)胞因子中作用最強(qiáng)，Smad蛋白是TGF-β家族的下游信號(hào)蛋白，且是最關(guān)鍵的下游調(diào)節(jié)因子，Smad蛋白的活化主要通過TGF-β的調(diào)節(jié)。Smad蛋白可以介導(dǎo)TGF-β在胞內(nèi)傳到過程。TGF-β/Smad信號(hào)傳到通路在腎纖維化的過程中發(fā)揮重要的作用。所以通過抑制TGF-β活性，來拮抗或阻斷TGF-β/Smad信號(hào)傳導(dǎo)可以延緩腎纖維化的進(jìn)展[3]。傳統(tǒng)蒙藥大黃-3湯由大黃、訶子、堿面配伍而成，常用于治療腹脹[4]、便秘[5]、肥胖[6]和閉經(jīng)[7]等。有研究發(fā)現(xiàn)大黃在改善慢性腎功能衰竭早期癥狀和延緩腎功能衰竭進(jìn)展方面具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[8]。潛在的機(jī)制包括抑制腎纖維化[9]、促進(jìn)毒素排泄、恢復(fù)代謝紊亂[10]、保護(hù)腎細(xì)胞免受過度炎癥和氧化應(yīng)激損傷。本實(shí)驗(yàn)研究大黃-3湯對(duì)CRF大鼠腎組織TGF-β/Smad信號(hào)通路的影響，從抑制人腎小球系膜細(xì)胞(HMC)異常增殖、腎小管上皮細(xì)胞(HK-2)間質(zhì)轉(zhuǎn)化，抗纖維化等方面，探討其延緩CRF進(jìn)展的作用機(jī)制。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與細(xì)胞110只無(wú)特定病原體SPF健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200～220)g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供。生產(chǎn)許可證號(hào)SCXK2006(北京)-0006。動(dòng)物在內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心飼養(yǎng)，光照/黑暗周期為12 h/12 h，飼養(yǎng)溫度為24～26 ℃，相對(duì)濕度為50%，實(shí)驗(yàn)期間給予標(biāo)準(zhǔn)食物和水，且不限量。

本研究中使用的人HMC和HK-2購(gòu)自上海中科院。細(xì)胞在含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中培養(yǎng)，溫度37 ℃，加濕5% CO2培養(yǎng)箱中孵育。培養(yǎng)基每3 d更換一次。

1.2 儀器、藥品及試劑全自動(dòng)化分析儀(Accut-Toshiba, Japan)；冷凍干燥器(Telstar LyoQuest，西班牙)；免疫組化全自動(dòng)染色機(jī)(萊卡，德國(guó))；全自動(dòng)玻片掃描儀(萊卡，德國(guó))；BD流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson, SanJose，USA)；羅氏LightCycler 96熒光定量PCR儀(羅氏，瑞士)；Jess多功能成像系統(tǒng)(Jess多功能全自動(dòng)蛋白質(zhì)免疫印跡定量分析系統(tǒng)，美國(guó))。大黃購(gòu)自國(guó)安市久旺藥業(yè)有限公司(久旺，中國(guó)，翼20150011)；訶子購(gòu)自河北聯(lián)康藥業(yè)有限公司(聯(lián)康，中國(guó)，翼20140028)；堿面購(gòu)自內(nèi)蒙古草原大江食品有限責(zé)任公司(草原大江，中國(guó)，SC20115010400383)，以上藥物由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)蒙醫(yī)藥學(xué)院方劑教研室布和朝魯老師鑒定為正品；腺嘌呤購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司(索萊寶，中國(guó)，513I054)；尿毒清顆粒購(gòu)自康臣藥業(yè)內(nèi)蒙古有限責(zé)任公司(康臣，中國(guó)，Z20073256)；轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)購(gòu)自派普泰克生物科技(蘇州)有限公司(PeproTech,美國(guó)，1218209)；生化檢測(cè)試劑血尿素氮(BUN)、血清肌酐(Scr)、24 h尿蛋白(CSF)購(gòu)自北京利德曼生化股份有限公司(利德曼，中國(guó))；胎牛血清(Biological Industries，美國(guó))；RPMI 1640培養(yǎng)基(美倫生物，中國(guó))；TriQuick總RNA提取試劑(索萊寶，北京，中國(guó))；HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit(康為世紀(jì)，中國(guó))；UltraSYBR Mixture(康為世紀(jì)，中國(guó))；高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液(索萊寶，北京，中國(guó))；硝酸纖維素膜PVDF(索萊寶，北京，中國(guó))；α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)、Smad 3、增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)、羊抗鼠抗體、羊抗兔抗體購(gòu)自北京華安有限公司；E-鈣粘蛋白(E-cadherin)購(gòu)自美國(guó)abcam試劑有限公祠；Smad 2購(gòu)自Cell Signaling Technology公司；beta-Tubulin購(gòu)自美國(guó)Affinity Biosciences公司。

1.3 藥物配制

1.3.1大黃-3湯 (1)煎煮:大黃、訶子粉碎過10目篩，各稱取100 g，加100 g堿面混合(共300 g)，后加總重量的8倍量水(2 400 mL)浸泡12 h，加熱煎煮3次，每次2 h，合并3次煎液。(2)濃縮:將提取液濃縮至生藥量與藥液體積比為1 ∶1.5。(3)凍干:在-80 ℃凍存12 h后在冷凍干燥器(Telstar LyoQuest，西班牙)中凍干至180 g凍干粉，大黃-3湯凍干粉在常溫儲(chǔ)存。臨用時(shí)取相應(yīng)體積添加超純水配制0.675 g·kg-1(低劑量)、1.35 g·kg-1(中劑量)和2.7 g·kg-1(高劑量)劑量大黃-3湯。

1.3.2尿毒清顆粒 取相應(yīng)體積的尿毒清顆粒添加超純水制備1.8 g·kg-1濃度。

2 方法

2.1 動(dòng)物分組及處理90只♂SD大鼠隨機(jī)分為正常組(16只)和造模組(80只)兩組。造模組以2.5%腺嘌呤混懸液按250 mg·kg-1· d-1連續(xù)灌胃14 d后, 再隔日給藥14 d，共28 d。造模成功后，隨機(jī)分為模型、陽(yáng)藥(尿毒清顆粒)、大黃-3湯低、中、高劑量組5組，每組15只。間隔給藥共12周，正常組與模型組給予等體積的生理鹽水。

2.2 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞及處理含藥血清制備：采用血清藥理學(xué)方法，將20只雄性SD大鼠隨機(jī)分為正常組(超純水)和大黃-3湯組(5.4 g·kg-1)兩組，每組通過灌胃法連續(xù)給藥7 d，d 5和d 7末次給藥后在0.5、1、2、3、4 h的時(shí)間段用乙醚麻醉后眼眶采血，12 500 r·min-1離心10 min，然后在56 ℃下加熱30 min以滅活補(bǔ)體。隨后，使用0.22 μm微孔膜對(duì)血液的血清部分進(jìn)行無(wú)菌過濾，并儲(chǔ)存在-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

無(wú)論是食用香料還是食用香精，都屬于食品添加劑范疇?？烧劦健笆称诽砑觿边@個(gè)詞，中國(guó)百姓多要忌憚三分。2008年的三鹿嬰幼兒配方奶粉食品安全事件，讓更多的人開始關(guān)注食品添加劑，也讓更多的人，尤其是母乳期的媽媽們，開始對(duì)“食品添加劑”一詞避而遠(yuǎn)之。一夜之間，食品添加劑在受到前所未有關(guān)注的同時(shí)，也被打入冷宮。

將對(duì)數(shù)期的1×104細(xì)胞用D-PBS洗滌兩次，接種在96孔板中，并與100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基一起在37 ℃的加濕5% CO2培養(yǎng)箱中孵育24 h。隨后，培養(yǎng)皿中的100 μL無(wú)血清培養(yǎng)基被分別含有0、0.1、1、2、4、5和10 mg·L-1的人TGF-β1的100 μL培養(yǎng)基替代，然后在37 ℃的加濕的5% CO2培養(yǎng)箱中48 h進(jìn)行共培養(yǎng)。選擇一個(gè)最有效的促進(jìn)HMC異常增殖和HK-2間質(zhì)轉(zhuǎn)化的濃度誘導(dǎo)細(xì)胞，并同時(shí)給予大黃-3湯含藥血清治療細(xì)胞。

2.3 檢測(cè)指標(biāo)

2.3.1生化檢測(cè) 將實(shí)驗(yàn)大鼠眼眶采血后的血樣在3 000 r·min-1，4 ℃離心15 min，收集上清(血清)。按照試劑盒說明書測(cè)定血清中BUN、Scr含量。

2.3.2組織學(xué)分析 將大鼠左腎臟固定在4%多聚甲醛，石蠟包埋，厚3 μm切片,HE和Masson染色進(jìn)，評(píng)估腎小球和腎小管間質(zhì)的損傷程度。

2.3.3免疫組化分析 將制備的3 μm的切片在免疫組化全自動(dòng)染色機(jī)進(jìn)行PCNA(1 ∶1 000)和α-SMA(1 ∶1 000)染色，使用全自動(dòng)玻片掃描儀進(jìn)行掃描，評(píng)估PCNA、α-SMA的表達(dá)。

2.3.4Real-time PCR分析 采用TriQuick總RNA提取試劑從腎組織和腎小管上皮細(xì)胞中提取總RNA。利用HiFiScript gDNA Removal cDNA Synthesis Kit將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用UltraSYBR Mixture在羅氏LightCycler 96熒光定量PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，并用2-ΔΔCt法計(jì)算。所有引物序列Tab 1所示。

Tab 1 Gene sequence

2.3.5蛋白免疫印跡分析 采用高效RIPA組織/細(xì)胞裂解液提取腎組織中的蛋白，采用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。蛋白質(zhì)在10% SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜PVDF上，然后在室溫下用5%脫脂奶粉將膜封閉3 h。膜與以下一抗在4℃孵育過夜：α-SMA(1 ∶1 000)、FSP1(1 ∶1 000)、Smad 2(1 ∶1 000)、Smad 3(2 ∶1 000)、E-cadherin(20 ∶1 000)、PCNA(1 ∶1 000)和beta-Tubulin(1 ∶1 000)。用TBST洗滌五次后，將膜與相應(yīng)的羊抗鼠抗體(Goat anti-rat IgG-HRP，1 ∶1 000)和羊抗兔抗體(Goat anti-rabbit IgG-AP，1 ∶1 000)結(jié)合辣根過氧化物酶在室溫下孵育2 h。最后用ECL試劑盒將PVDF膜在Jess多功能成像系統(tǒng)下成像，成像結(jié)束后將這些膜再次洗滌并使用增強(qiáng)型DAB顯色試劑盒顯色。用 ImageJ 1.48軟件分析所有蛋白條帶，計(jì)算各條帶與beta-Tubulin灰度值的比值并統(tǒng)計(jì)分析各組差異。

3 結(jié)果

3.1 腺嘌呤誘導(dǎo)SD大鼠造模CRF模型造模期間每日記錄各實(shí)驗(yàn)組的體質(zhì)量,每周眼眶采血檢測(cè)血清BUN和Scr，收集24 h尿液并檢測(cè)24 h尿蛋白CSF。檢測(cè)結(jié)果顯示,造模4周期間，正常組大鼠體質(zhì)量持續(xù)增加，造模組在造模前2周，每日灌胃腺嘌呤后體量下降，造模后2周造模組將每日灌胃改為隔日，體量逐漸增長(zhǎng)，但增長(zhǎng)速度仍然低于空白組(P<0.05)(Fig 1A)。造模4周結(jié)束后造模組大鼠BNN、Scr、24 h尿量均高于空白對(duì)照組(P<0.05)(Fig 1B-E),這一結(jié)果提示CRF模型造模成功。

Fig 1 Comparison of related indexes after adenine induced CRF rat A： Effects of adenine modeling on weight gain of experimental rats B：Effects of adenine on BUN of experimental rats C： Effects of adenine on Scr of experimental rats D： Effects of adenine on CSF of experimental rats E： Effects of adenine on 24 h urive volume of experimental rats. #P<0.05 vs normal group.

3.2 大黃-3湯對(duì)CRF大鼠尿液顏色的影響正常組大鼠尿液呈淡黃色，模型組大鼠尿液與正常組相比尿液顏色變深呈暗紅色,大黃-3湯不同劑量治療后CRF大鼠尿液顏色偏向于正常大鼠尿液顏色(Fig 2A)。

Fig 2 Effect of rhubarb-3 decoction on urine color (A) and renal function (B，C) of CRF rats(n=5)##P<0.01 vs normal group; **P<0.01 vs model group.

3.3 大黃-3湯對(duì)CRF模型大鼠腎功的影響生化檢測(cè)BUN和Scr，與正常組相比，模型組BUN和Scr含量明顯升高(P<0.01)，大黃-3湯低劑量能明顯降低BUN水平(P<0.01)(Fig 2B)；大黃-3湯低、中劑量能明顯減低Scr水平(P<0.01)(Fig 2C)。以上結(jié)果表明大黃-3湯能改善CRF大鼠腎功能。

3.4 大黃-3湯對(duì)CRF模型大鼠腎臟形態(tài)和病理的影響正常組腎臟呈馬豆?fàn)?，色澤鮮艷、光澤。模型組，腎臟腫大，白色顆粒廣泛分布在表面，腎臟呈白霜狀。與模型組相比，大黃-3湯腎臟體積變小且表面白霜外觀減少(Fig 3A)。為證實(shí)大黃-3湯對(duì)CRF大鼠腎臟損傷的修復(fù)作用，采用HE和Masson染色分析大黃-3湯對(duì)CRF大鼠腎臟病理的影響。HE染色結(jié)果顯示，正常組腎皮質(zhì)和髓質(zhì)結(jié)構(gòu)完整，界限清晰；腎小管上皮細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)完整；腎小球體積均勻，血管球較大，腎小囊囊腔較窄。模型組腎皮質(zhì)和髓質(zhì)散在或彌漫分布多核巨細(xì)胞和肉芽腫，很多肉芽腫周圍明顯纖維化而形成大小不等的纖維化病灶，灶內(nèi)淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和腎小管萎縮和消失。纖維化病灶間的腎小管上皮細(xì)胞增生，管腔擴(kuò)張而輕度代償性肥大。腎小球血管球體積明顯縮小，個(gè)別纖維化灶內(nèi)腎小管腔內(nèi)可見較多中性粒細(xì)胞。藥物治療后這些現(xiàn)象相對(duì)減輕(Fig 3B)。Masson染色結(jié)果顯示，正常組腎小管間質(zhì)、腎小囊囊壁和血管球內(nèi)見均勻的細(xì)線狀藍(lán)染的膠原纖維。模型組皮質(zhì)和髓質(zhì)纖維化病灶內(nèi)藍(lán)染的膠原纖維數(shù)量多，纖維束較粗，面積較大。藥物治療組皮質(zhì)和髓質(zhì)纖維化病灶內(nèi)腎小囊囊壁、腎間質(zhì)藍(lán)染的膠原纖維數(shù)量減少、纖維束變細(xì)、面積減小(Fig 3C)。

3.5 大黃-3湯對(duì)CRF模型大鼠腎組織PCNA和α-SMA表達(dá)的影響腎小球系膜細(xì)胞異常增殖在腎纖維過程中起著重要作用,腎纖維化會(huì)導(dǎo)致纖維化標(biāo)志物α-SMA的表達(dá)水平增加。與正常組相比，模型組大鼠腎組織中PCNA和α-SMA的蛋白表達(dá)顯著增加，尿毒清顆粒和大黃-3湯治療能顯著降低PCNA和α-SMA蛋白的表達(dá)(Fig 3D，E)。

Fig 3 Effect of rhubarb-3 decoction on renal pathological changes and expression of PCNA and α-SMA in CRF rats(A) The effect of rhubarb-3 decoction on color, appearance and morphology of kidney tissues in CRF rats. (B) HE staining. (C) Masson staining. (D) Immunohistochemical analysis of PCNA . (E) Immunohistochemical analysis of α-SMA (B，C，D，E×400).

3.6 大黃-3湯對(duì)HMC異常增殖的影響為篩選誘導(dǎo)劑TGF-β1有效促進(jìn)HMC異常增殖的最佳濃度，我們?cè)谘芯恐羞x用0、0.1、0.5、1、2、4、5和10 mg·L-1濃度的TGF-β1誘導(dǎo)HMCs增殖，CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示0.5、1、2、4、5和10 mg·L-1濃度的TGF-β1均可明顯促進(jìn)HMC增殖(P<0.05)。為保證有效且經(jīng)濟(jì)的前提下，在此濃度中我們選用1、2、5和10 mg·L-1濃度的TGF-β1作為有效誘導(dǎo)濃度來誘導(dǎo)HMC增殖。由TGF-β1誘導(dǎo)的同時(shí)用不同時(shí)間點(diǎn)的大黃-3湯含藥血清給予治療。CCK-8檢測(cè)結(jié)果顯示，與正常組大鼠血清相比，大黃-3湯給藥5 d、末次給藥后2 h的血清能明顯抑制1、2 mg·L-1TGF-β1誘導(dǎo)的HMC增殖；對(duì)5、10 mg·L-1TGF-β1誘導(dǎo)的增殖無(wú)抑制作用(Fig 4A，B)。

3.7 大黃-3湯對(duì)HK-2表型轉(zhuǎn)化的影響選用0、0.1、1、2、5和10 mg·L-1濃度的TGF-β1誘導(dǎo)腎HK-2間質(zhì)轉(zhuǎn)化，結(jié)果1 mg·L-1的TGF-β1被選為最佳誘導(dǎo)HK-2間質(zhì)轉(zhuǎn)化的濃度(Fig 4C,D)。由1 mg·L-1的TGF-β1誘導(dǎo)HK-2的同時(shí)用正常和大黃-3湯給藥7 d的含藥血清治療，結(jié)果表明，與正常組相比，大黃-3湯給藥7 d，末次給藥后1 h和3 h的含藥血清能顯著升高HK-2標(biāo)志物CK18的表達(dá)(P<0.01)(Fig 4E,F)；末次給藥后3 h的含藥血清能顯著降低間質(zhì)成纖維標(biāo)志物Vimentin的表達(dá)(P<0.05)(Fig 4G)。

3.8 大黃-3湯對(duì)CRF模型大鼠腎纖維化相關(guān)基因的影響與正常組相比，模型組CK18 mRNA表達(dá)顯著降低(P<0.01)；TGF-β1、Vimentin、FN mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)。大黃-3湯中、高劑量治療后CK18 mRNA表達(dá)明顯升高(P<0.05)；大黃-3湯低、中、高劑量能顯著降低TGF-β1mRNA表達(dá)(P<0.01)；大黃-3湯高劑量能顯著降低Vimentin mRNA表達(dá)(P<0.01)；大黃-3湯高劑量能顯著降低FN mRNA表達(dá)(P<0.01)(Fig 5A)。以上結(jié)果表明大黃-3湯能改善CRF模型大鼠腎纖維化相關(guān)基因異常表達(dá)。

3.9 大黃-3湯對(duì)CRF模型大鼠腎纖維化及TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白的影響與正常組相比，模型組α-SMA、Smad 2、Smad 3、PCNA蛋白表達(dá)明顯增加(P<0.05)；E-cadherin蛋白表達(dá)明顯降低(P<0.05)。大黃-3湯低、中、高劑量治療能明顯降低α-SMA蛋白表達(dá)(P<0.01)；大黃-3湯低、中劑量能明顯升高E-cadherin蛋白表達(dá)(P<0.01)；大黃-3湯低、高劑量能明顯降低Smad2、Smad3蛋白表達(dá)(P<0.01)；大黃-3湯中劑量能明顯降低PCNA蛋白表達(dá)(P<0.01)(Fig 5B-C)。以上結(jié)果表明，大黃-3湯能明顯改善CRF模型大鼠腎纖維化導(dǎo)致的TGF-β/Smad通路相關(guān)蛋白異常表達(dá)。

Fig 5 Effect of rhubarb-3 decoction on expression of fibrosis related genes and proteins in renal tissues of CRF rats(A) The effect of rhubarb-3 decoction on the expression of CK18, TGF-β1, vimentin and FN mRNA in CRF rats. (B)Western blot strip graph. (C) The effect of rhubarb-3 decoction on the expression of α-SMA, Smad 2, Smad 3, PCNA and E-cadherin protein in CRF rats. #P<0.05, ##P<0.01 vs normal group; *P<0.05, **P<0.01 vs model group.

4 討論

腎纖維化是腎功能喪失的主要原因，并被認(rèn)為是導(dǎo)致終末期腎病的關(guān)鍵病理特征。腎纖維化的主要特征包括腎間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎小球硬化。腎臟固有細(xì)胞-腎小球系膜細(xì)胞異常增殖和腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)成轉(zhuǎn)化(EMT)在腎纖維過程中起著重要作用[11]。而且TGF-β是腎纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，參與導(dǎo)致慢性腎病和終末期腎病(ESRD)的動(dòng)態(tài)病理生理過程[12]。最近的證據(jù)表明TGF-β/Smad信號(hào)通過表觀遺傳相關(guān)機(jī)制調(diào)節(jié)腎纖維化。在病理?xiàng)l件下，腎小球系膜細(xì)胞被激活，導(dǎo)致過度增殖和過量的細(xì)胞外基質(zhì)[13]和腎小管上皮細(xì)胞細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化成成纖維細(xì)胞[14]。系膜細(xì)胞過度增殖導(dǎo)致的細(xì)胞數(shù)量增加和促纖維化標(biāo)志物基因表達(dá)增強(qiáng)誘導(dǎo)的細(xì)胞外基質(zhì)積聚最終導(dǎo)致腎小球纖維化。因此，維持系膜細(xì)胞功能和逆轉(zhuǎn)異常基因表達(dá)有利于正常腎功能。上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)是腎間質(zhì)纖維化進(jìn)程中的重要信號(hào)通路，其代表上皮細(xì)胞及其黏附分子(包括E-cadherin)的損失，以及間充質(zhì)細(xì)胞和標(biāo)記物(如α-SMA)的增加。TGF-β是腎纖維化的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，通過各種細(xì)胞因子誘導(dǎo)α-SMA的表達(dá)來促進(jìn)肌成纖維細(xì)胞發(fā)育的重要介質(zhì)。在腎纖維化過程中，下游Smad信號(hào)通路被TGF-β1激活，導(dǎo)致腎瘢痕形成。因此，操縱下游TGF-β1信號(hào)傳導(dǎo)是逆轉(zhuǎn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化和腎間質(zhì)纖維化的有效治療靶點(diǎn)，而且有研究表明TGF-β1/Smad信號(hào)通過表觀遺傳相關(guān)機(jī)制調(diào)節(jié)腎纖維化[15]。

在蒙醫(yī)基礎(chǔ)和臨床上，蒙藥大黃-3湯多數(shù)用于口服給藥，外用藥時(shí)一般用于蒙醫(yī)尼如哈( 類似中藥灌腸)[16]。大黃-3湯其成分中大黃具有下泄，清熱解毒，助消化之功效；堿面具有防止大便干燥之功效；訶子具有解毒之功效。大黃含有多種生物活性成分，其中大黃素、大黃鞣質(zhì)、樂丹寧、大黃酸蒽醌葡萄糖苷及大黃蒽醌是目前被認(rèn)為對(duì)CRF起治療作用的主要成分[17]?，F(xiàn)代藥理研究表明大黃主要通過對(duì)氮質(zhì)代謝、免疫能力、脂質(zhì)代謝及自由基、參與腎臟代償性肥大、腎小球系膜細(xì)胞功能的影響發(fā)揮作用能延緩CRF[18]。

腎臟是排泄許多水溶性、非揮發(fā)性藥物及其代謝物的重要器官。腎臟疾病能改變藥代動(dòng)力學(xué)過程，如(1)減慢藥物消除速，延長(zhǎng)半衰期；(2)改變藥物代謝的速度或途徑；(3)減少藥物與血漿蛋白結(jié)合，增加血漿游離型藥物的濃度；(4)改變分布容積等。這些改變常常導(dǎo)致藥物作用的增強(qiáng)以及不良反應(yīng)的增加。為避免不良反應(yīng)的發(fā)生，腎病時(shí)給藥法必須進(jìn)行調(diào)整，或減少藥量，或延長(zhǎng)給藥間隔時(shí)間。本研究在造模成功后連續(xù)給藥治療6周，停藥19周，再連續(xù)給藥6周，共治療31周。本研究結(jié)果表明，大黃-3湯能明顯降低Scr和BUN水平、抑制腎小球系膜細(xì)胞異常增殖和腎小管上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)化并明顯改善CRF大鼠腎組織PCNA、α-SMA、E-cadherin、Smad2、Smad3蛋白及CK18、Vimentin、TGF-β1、FN mRNA表達(dá)。提示大黃-3湯可能其抑制系膜細(xì)胞異常增殖、腎小管間質(zhì)纖維化、延緩慢性腎衰進(jìn)展可能與抑制 TGF-β1/Smad信號(hào)通過激活有關(guān)。