趙盛男，張振旺，堯 青，劉 超

(湖北科技學(xué)院 1. 醫(yī)學(xué)部藥學(xué)院、2. 糖尿病心腦血管病變湖北省重點實驗室、3.醫(yī)學(xué)部醫(yī)藥研究院，湖北 咸寧 437100)

糖尿病肺纖維化嚴(yán)重?fù)p害患者身心健康，但目前尚無行之有效的治療，因此，明確其分子機制有重要意義。多項研究表明[1-3]，患者長期處于高糖狀態(tài)會活化成纖維細(xì)胞和肌成纖維細(xì)胞，增加膠原分泌，而促進(jìn)膠原降解的基質(zhì)金屬蛋白酶活性降低、其酶抑制劑表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致膠原降解減少，最終形成膠原合成增加和沉積，致使肺纖維化的產(chǎn)生[4-5]。而纖維化產(chǎn)生的信號主要是通過 TGF-β/Smads通路傳導(dǎo)的，在刺激作用下，TGF-β1蛋白表達(dá)增加，Ⅰ、Ⅱ型跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體活化，促進(jìn)Smad2和Smad3蛋白磷酸化，并與Smad4蛋白形成活性復(fù)合體，進(jìn)入細(xì)胞核，上調(diào)膠原等纖維化相關(guān)基因的表達(dá)，從而促進(jìn)纖維化的形成[6-7]。由此可見，膠原合成增加是糖尿病肺纖維化的基礎(chǔ)，明確高糖誘導(dǎo)膠原合成的分子機制能夠為糖尿病肺纖維化提供新的治療方向。

Fox蛋白家族是真核生物中廣泛存在的一類轉(zhuǎn)錄因子，主要與糖脂代謝、胚胎發(fā)育、細(xì)胞周期調(diào)節(jié)等功能有關(guān)，其家族中的FOXM1在TGF-β/Smads通路的信號傳導(dǎo)中有重要的調(diào)節(jié)作用。研究表明[8-10]，F(xiàn)OXM1以劑量依賴的方式抑制TIF1γ對Smad4的泛素化作用，促進(jìn)Smad4的穩(wěn)定，并且誘導(dǎo)Smad3磷酸化，維持P-Smad3/Smad4復(fù)合物的形成，驅(qū)動并加強TGF-β/Smads信號通路的傳導(dǎo)，從而促進(jìn)膠原合成，減少膠原降解，加劇纖維化發(fā)生。因此，我們推測FOXM1可能是高糖誘導(dǎo)膠原合成及糖尿病肺纖維化發(fā)生過程中的一個相關(guān)因子。

本文通過高糖刺激MRC-5細(xì)胞模擬糖尿病誘導(dǎo)的肺纖維化模型，探討高糖誘導(dǎo)膠原合成的機制及FOXM1在高糖誘導(dǎo)膠原合成過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料MRC-5為人胚肺成纖維細(xì)胞，MRC-5細(xì)胞及其專用MEM培養(yǎng)基均購于武漢普諾賽生命科技有限公司；Glucose、DMSO和Mannitol均購于Sigma公司；Thiostrepton購于MedChemExpress生物科技公司；COL Ⅰ、COL Ⅲ、TGF-β1、α-SMA、Fibronectin、MMP9、TIMP1、FOXM1、P-Smad2、Smad2和α-Tubulin抗體均購于ABclonal公司；HRP標(biāo)記二抗購于biosharp公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒和qPCR試劑盒均購于ABclonal公司；ECL試劑盒和CCK8試劑盒均購于大連美侖生物技術(shù)有限公司；DEPC水購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器超凈工作臺(蘇州凈化公司)；CO2培養(yǎng)箱(Thermo公司)；全波段多功能酶標(biāo)儀(美國Bio-Tek公司)；垂直電泳儀、電轉(zhuǎn)移槽和自動發(fā)光凝膠成像系統(tǒng)(美國Bio-Rad公司)等。

1.3 方法

1.3.1CCK8檢測增殖活性 (1)檢測不同時間點高糖對MRC-5細(xì)胞增殖活性的影響：選擇第3～5代處于對數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞接種至96孔板，24 h后換無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞過夜，按預(yù)設(shè)時間點72、48、24、12、6 h給予30 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞，每組8個復(fù)孔，最后一起給予每孔10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)細(xì)胞30 min后，在450 nm波長下用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活性。(2)檢測不同濃度葡萄糖對MRC-5細(xì)胞增殖活性的影響：選擇第3～5代處于對數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞接種至96孔板，24 h后換無血清培養(yǎng)基饑餓細(xì)胞過夜，分別給予30 mmol·L-1甘露醇及5.5、15、30、45 mmol·L-1葡萄糖培養(yǎng)細(xì)胞，每組8個復(fù)孔，24 h后給予每孔10 μL CCK8試劑，培養(yǎng)細(xì)胞30 min后，在450 nm波長下用酶標(biāo)儀檢測細(xì)胞活性。

1.3.2細(xì)胞培養(yǎng)及分組 將第3～5代處于對數(shù)生長期的MRC-5細(xì)胞于含10% FBS、1%青-鏈霉素雙抗的MEM完全培養(yǎng)基中，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液1次。細(xì)胞長滿后，傳代接種于6孔板中，MEM完全培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞至70%～80%時，換無血清培養(yǎng)基饑餓過夜，再給予不同的無血清含藥培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為以下4組：CON組(正常對照)、HM組(30 mmol·L-1甘露醇高滲對照)、HG組(30 mmol·L-1高糖)、HG+TST組(30 mmol·L-1高糖+1 μmol硫鏈絲菌素)[11]，培養(yǎng)細(xì)胞24 h后，收細(xì)胞用于后續(xù)的Western blot和qPCR檢測。

1.3.3Western blot法檢測膠原合成相關(guān)因子的表達(dá)水平 細(xì)胞給藥完成后，提取蛋白樣品，BCA法測定蛋白濃度，調(diào)整濃度一致后變性，-20 ℃保存；常規(guī)Western blot法檢測相關(guān)蛋白的表達(dá)情況：根據(jù)蛋白濃度調(diào)節(jié)上樣量至25 μg，10% SDS-PAGE凝膠電泳后，250 mA，160 min轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫?fù)u床封閉2 h，分別孵育對應(yīng)的一抗，4 ℃搖床過夜，TBST洗滌4次/10 min，室溫?fù)u床孵育相應(yīng)的HRP標(biāo)記二抗1 h，TBST洗滌3次/10 min，加入ECL顯影液顯影成像。

1.3.4qPCR法檢測膠原合成相關(guān)因子的表達(dá)水平 細(xì)胞給藥完成后，常規(guī)TRIzol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA后用熒光定量PCR試劑盒將各組細(xì)胞的cDNA進(jìn)行qPCR反應(yīng)，具體引物信息見Tab 1，以GAPDH作內(nèi)參，最終以2-ΔΔCt計算膠原合成相關(guān)目的基因的mRNA表達(dá)水平變化。

Tab 1 Primers involved in Real-time quantitative PCR

2 結(jié)果

2.1 MRC-5細(xì)胞高糖模型建立高糖(30 mmol·L-1)誘導(dǎo)培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，在不同時間檢測細(xì)胞活性。結(jié)果如Fig 1A所示：高糖誘導(dǎo)培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞24、48、72 h時，與CON組比，細(xì)胞增殖活性明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，因此選擇24 h作為高糖作用時間；由于培養(yǎng)基中葡萄糖濃度高于正常的5.5 mmol·L-1時，細(xì)胞會相應(yīng)的出現(xiàn)滲透壓改變，達(dá)到一定程度時對細(xì)胞活性有影響，因此在設(shè)置不同濃度梯度的葡萄糖誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞時，多設(shè)置了一個高滲對照HM組，結(jié)果如Fig 1B所示：與CON組比，HG的高滲對照HM組細(xì)胞增殖活性無顯著變化(P>0.05)，而葡萄糖濃度在30和45 mmol·L-1時，細(xì)胞活性較CON和HM組均有明顯下降，且差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。因此，選擇高糖誘導(dǎo)模型建立的條件是30 mmol·L-1培養(yǎng)細(xì)胞24 h。

Fig 1 MRC-5 cell activities at different time points and different glucose concentrations detected by n=8)A: The MRC-5 cell activities in different time gradients cultured by high glucose. B: The MRC-5 cell activities in different glucose concentrations or 30 mmol·L-1 mannitol after 24 h. *P<0.05, **P<0.01 vs CON; △P<0.05 vs HM

2.2 高糖促進(jìn)MRC-5膠原合成高糖(30 mmol·L-1)誘導(dǎo)培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，通過Western blot和PCR檢測膠原合成相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果如Fig 2所示：與CON相比，HG的高滲對照HM組對膠原合成相關(guān)因子的表達(dá)水平?jīng)]有影響；HG能促進(jìn)COL Ⅰ、COL Ⅲ、Fn、α-SMA、TGF-β1、P-Smad2和TIMP1的蛋白和mRNA表達(dá)，且降低MMP9的蛋白和mRNA表達(dá)，導(dǎo)致MMP9/TIMP1比值較CON組降低。

Fig 2 Collagen synthesis in MRC-5 cells induced by high glucose detected by Western blot and n=3)A-D: Western blot band graphs and corresponding results statistics of COL Ⅰ, COL Ⅲ, TGF-β1, P-Smad2, MMP9, TIMP1 and Fn, α-SMA; E-H:Col Ⅰ, Col Ⅲ, TGF-β1, MMP9, TIMP1 and Vim statistical graphs of qPCR results. *P<0.05 vs CON.

2.3 FOXM1在高糖誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞中高表達(dá)高糖(30 mmol·L-1)誘導(dǎo)培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞，通過Western blot和PCR檢測FOXM1的表達(dá)，結(jié)果如Fig 3所示，F(xiàn)OXM1蛋白在HG組的表達(dá)遠(yuǎn)較CON組高，其mRNA水平也有升高，而HG的高滲對照HM組與CON組相比沒有明顯差別。

Fig 3 The expression level of FOXM1 in MRC-5 cells induced by high glucose detected by Western blot and n=3)A: Western blot band and statistical diagram of FOXM1; B: FOXM1 qPCR statistical diagram. *P<0.05 vs CON.

2.4 抑制FOXM1降低高糖誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞膠原合成通過Western blot和qPCR檢測各組膠原合成相關(guān)因子的表達(dá)，結(jié)果如Fig 4所示：與CON組相比，HG促進(jìn)FOXM1的表達(dá)，但給予FOXM1抑制劑TST(HG+TST)干預(yù)后，F(xiàn)OXM1表達(dá)明顯比單純HG組減少(Fig 4A，F(xiàn))；同時，TST抑制了高糖對MRC-5膠原合成相關(guān)因子如COL Ⅰ、COL Ⅲ、TGF-β1、TIMP1和Fn、α-SMA的蛋白和mRNA誘導(dǎo)作用(Fig 4B-E；Fig 4G-I)，TST還促進(jìn)HG刺激后MMP9蛋白和mRNA的表達(dá)，導(dǎo)致MMP9/TIMP1比值較HG組增加；HG的高滲對照HM組對MRC-5膠原合成相關(guān)因子的蛋白及mRNA表達(dá)水平與CON組比差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

Fig 4 Expression of FOXM1 and collagen synthesis in MRC-5 cells induced by high glucose by Western blot and n=3)A: FOXM1 Western blot strip diagram and statistical diagram; B-E: COL Ⅰ, COL Ⅲ, TGF-β1, P-Smad2, MMP9, TIMP1 and Fn , α-SMA Western blot strip diagrams and corresponding results statistics; F: FOXM1 statistical graph of qPCR result; G-I: Col Ⅰ, Col Ⅲ, TGF-β1, MMP9, TIMP1 and Vim′s qPCR statistical graphs. *P<0.05 vs CON； #P<0.05 vs HG.

3 討論

糖尿病患者長期處于高糖狀態(tài)會加速膠原等細(xì)胞外基質(zhì)的合成，誘導(dǎo)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)纖維化的發(fā)生發(fā)展，而纖維化的激素治療會影響糖代謝甚至引起糖代謝紊亂，加重糖尿病的發(fā)展，說明高糖與纖維化相互影響[12-13]。纖維化的發(fā)生往往是細(xì)胞外基質(zhì)如膠原等合成增多所致，主要由TGF-β/Smads信號通路調(diào)節(jié)，在這個傳導(dǎo)過程中，F(xiàn)OXM1具有重要的調(diào)節(jié)作用[14-15]，且被證實參與心肌膠原合成及其纖維化的發(fā)生發(fā)展[16]，但其在糖尿病肺纖維化中的作用還未見報道，因此本研究通過高糖培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞模擬高糖誘導(dǎo)肺纖維化的過程，在細(xì)胞水平上探討高糖對肺細(xì)胞膠原合成的影響及FOXM1在其中的作用。

本研究顯示，30 mmol·L-1高糖誘導(dǎo)培養(yǎng)MRC-5細(xì)胞24 h時，細(xì)胞活性與CON組相比明顯下降，而HG的高滲對照HM組與CON組相比則無顯著變化，可見HG組細(xì)胞增殖活性的下降不是由其高滲透壓引起的，而是葡萄糖的作用所致，HG模型可靠。高糖促進(jìn)MRC-5細(xì)胞中膠原合成和TGF-β/Smads信號通路相關(guān)因子COL Ⅰ、COL Ⅲ、Fn、α-SMA、TGF-β1、p-Smad2和TIMP1的蛋白和mRNA表達(dá)，卻降低了降解膠原的MMP9蛋白及mRNA表達(dá)，而高滲對照HM組對上述相關(guān)因子的表達(dá)水平均未發(fā)現(xiàn)有顯著性改變，可見高糖可以促進(jìn)MRC-5細(xì)胞膠原合成，減少膠原降解，誘導(dǎo)肺纖維化相關(guān)因子的表達(dá)，且其作用與高糖產(chǎn)生的滲透壓內(nèi)環(huán)境無關(guān)，而是由其高葡萄糖作用所致。另外，我們發(fā)現(xiàn)高糖誘導(dǎo)下FOXM1的表達(dá)水平增加，為進(jìn)一步探討FOXM1的作用，我們在高糖培養(yǎng)的MRC-5細(xì)胞中加入FOXM1的抑制劑硫鏈絲菌素共培養(yǎng)細(xì)胞，結(jié)果顯示FOXM1表達(dá)較單獨的HG組明顯有被抑制，且其參與的TGF-β/Smads信號通路相關(guān)因子表達(dá)明顯下調(diào)，膠原合成相關(guān)因子也均較HG組有不同程度的改變，這與Penke等[17]證實的FOXM1是肺纖維化的一個關(guān)鍵驅(qū)動因子研究結(jié)果是一致的。而Girish等[18]報導(dǎo)的糖尿病肺纖維化是通過激活TGF-β/Smads信號通路所致，F(xiàn)OXM1又可以驅(qū)動并加強TGF-β/Smads信號通路的傳導(dǎo)[7-8]。因此，我們有理由認(rèn)為FOXM1是高糖誘導(dǎo)膠原合成過程的一個相關(guān)調(diào)節(jié)因子，且其發(fā)揮作用的機理和TGF-β信號通路有關(guān)。

綜上所述，本研究通過設(shè)立高糖的高滲對照，建立高糖模型，并對細(xì)胞給予硫鏈絲菌素處理，檢測高糖狀態(tài)下COL Ⅰ、COL Ⅲ等膠原合成因子的表達(dá)及FOXM1的表達(dá)，證實了高糖會通過TGF-β/Smads通路促進(jìn)膠原合成且加劇肺纖維化的發(fā)生發(fā)展，F(xiàn)OXM1是參與其中的一個相關(guān)調(diào)節(jié)因子。本研究為進(jìn)一步了解高糖誘導(dǎo)膠原合成以及糖尿病肺纖維化的機制提供了依據(jù)，為防治糖尿病肺纖維化提供了新思路，但本實驗只涉及了體外細(xì)胞實驗，對于FOXM1在高糖誘導(dǎo)膠原合成及纖維化中的作用還應(yīng)輔以分子生物學(xué)、動物模型實驗等加以深入研究。