槲皮素包合物的制備與水溶性研究

盤振杰，楊敏芬，郭洋洋，張貞發(fā)，王 強(qiáng)

（廣西民族師范學(xué)院 化學(xué)與生物工程學(xué)院，廣西 崇左 532200）

槲皮素（Quercetin）作為一種在植物中分布比較廣泛的天然膳食類黃酮化合物[1]，是一種黃色針狀結(jié)晶體，化學(xué)名為3,3’,4’5,7-五羥基黃酮，具有抑菌、防炎、抗癌、減緩氧化、止咳祛痰、平緩血壓等生理功能和藥理作用[2-5]。β-環(huán)糊精（β-Cyclodextrin，β-CD）及其衍生物具有特殊的結(jié)構(gòu)和兩親性，據(jù)此彌補(bǔ)β-CD本身水溶性低、鍵合能力差和生物利用度低等缺陷，可提高β-CD在水溶液中的溶解度[6-9]。本研究通過β-CD合成其衍生物，并對槲皮素進(jìn)行包合得到包合物，增強(qiáng)槲皮素的生物活性；用紅外光譜（Infrared Radiation，IR）、掃描電子顯微鏡（Scanning Electron Microscope，SEM）對其進(jìn)行表征，通過紫外線（Ultraviolet，UV）測定包合物結(jié)合常數(shù)和水溶性。

1 實(shí)驗(yàn)方案及方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

儀器：集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（DF-101S）、隔膜真空泵、電熱鼓風(fēng)干燥箱（DHG-9140A）、紫外-可見分光光度計(jì)（UV-6102S）、傅里葉變換紅外光譜儀等；試劑：β-CD、丙酮、對甲苯磺酰氯、1,3-丙二胺、N,N’-雙(3-氨丙基)乙二胺、槲皮素、甲苯磺酸鹽（Tosylate，實(shí)驗(yàn)室制得）等。

1.2 N,N’-雙(3-氨丙基)乙二胺修飾β-CD（H1）的合成

量取10 mL N,N’-雙(3-氨丙基)乙二胺與2.00 g Tosylate混合并溶解，升溫至75 ℃，反應(yīng)8 h，冷卻后將上述反應(yīng)液緩慢滴加到丙酮中，出現(xiàn)大量白色絮狀物，抽濾后得到固體，置于真空干燥箱中，50 ℃干燥得到粉末，即H1，產(chǎn)率約為18.15%。用相同的方法合成H2，產(chǎn)率約為17.55%。

1.3 H1/槲皮素包合物的制備

稱取26.91 mg H1，用3 mL水溶解；將19.31 mg槲皮素溶于3 mL無水乙醇。將兩種溶液置于反應(yīng)器中，在45 ℃條件下緩慢攪拌4～6 h。反應(yīng)液置于真空干燥箱中干燥，得到固體。用水溶解固體，溶液用0.45 μm纖維素膜過濾，得到濾液。濾液放在真空干燥箱中45 ℃烘干，得到的褐色固體即H1/槲皮素包合物。用相同的方法制得H2/槲皮素包合物，固體為褐色。

1.4 客體-槲皮素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的繪制

采用UV建立客體-槲皮素的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，配制一系列濃度梯度的槲皮素乙醇溶液，再測定其吸光度（Absorbance，Abs）。稱取1.50 g槲皮素，用少量乙醇溶解于小燒杯中，轉(zhuǎn)移定容（溶劑為無水乙醇）到10 mL容量瓶中，得到5.0×10-4mol/L標(biāo)準(zhǔn)溶液。取7個(gè)5 mL容量瓶，分別加入不同量上述標(biāo)準(zhǔn)溶液并用無水乙醇定容，得到濃度分別為0.8×10-5、1.6×10-5、2.4×10-5、3.2×10-5、4.0×10-5、4.8×10-5、5.6×10-5mol/L的槲皮素溶液，分別測其Abs。

1.5 結(jié)合常數(shù)的測定

采用紫外光譜法分別測定并計(jì)算H1、H2與槲皮素之間的穩(wěn)定常數(shù)。配制10 mL 0.5 mmol/L的H1溶液；稱取6.50 mg，用4 mL水溶解，再加6 mL無水乙醇定容于10 mL容量瓶中，得到0.5 mmol/L的H1溶液；同上所述步驟得H2溶液。取10支干燥的5 mL容量瓶，每個(gè)瓶中都加入200 μL上述槲皮素標(biāo)準(zhǔn)溶液，再依次加入不同體積的主體溶液，用無水乙醇與水的混合溶液（V無水乙醇∶V水=3∶2）定容，配制成一定濃度梯度的主-客體乙醇水溶液，濃度分別為0.6×10-5、1.2×10-5、1.8×10-5、2.4×10-5、3.0×10-5、3.6×10-5、4.2×10-5、4.8×10-5、5.4×10-5、6.0×10-5mol/L，再分別測其Abs。

1.6 包合物水溶性的測定

采用飽和水溶液法測定包合物的水溶性，取過量槲皮素放入裝有100 μL蒸餾水的帶蓋小離心管中，蓋好蓋子充分振蕩；再稱取過量H1/槲皮素包合物和H2/槲皮素包合物分別溶于100 μL水中，振蕩后恒溫放置2 h，分別制得飽和溶液；放置一段時(shí)間，分別取一定量的上層清液，定容于5 mL容量瓶中（溶劑為水），稀釋到一定濃度梯度的溶液即待測液，分別用紫外-可見分光光度計(jì)測待測液的Abs。

2 結(jié)果與討論

2.1 紅外光譜分析

將烘干的KBr研磨成粉末，壓片后制作成基底，再在干燥的實(shí)驗(yàn)環(huán)境中將樣品與KBr粉末碾磨均勻（比例約為1∶100），壓成半透明的薄片，在500～4 500 cm-1內(nèi)進(jìn)行掃描，得到槲皮素、H1和H1/槲皮素包合物的紅外吸收光譜圖（見圖1上）。a的主要特征吸收峰出現(xiàn)在3 357、1 667、1 616、1 534、1 272 cm-1處，b的主要特征吸收峰出現(xiàn)在3 365、2 949、1 686、1 463、1 202、1 125、1 075、628 cm-1處，H1與槲皮素包合物（c）的特征吸收峰中和了以上兩種物質(zhì)的特征吸收峰，兩種物質(zhì)的吸收峰大致相同，峰的強(qiáng)度有所差異，原因是所處環(huán)境不同，吸收強(qiáng)度不同。由此證明，H1和槲皮素已經(jīng)形成了包合物。同理，H2和槲皮素也形成了包合物（見圖1下）。

圖1 紅外光譜

2.2 掃描電鏡分析

從圖2所示的電鏡掃描圖中，可清晰地觀察到各物質(zhì)的表面形態(tài)。其中，A為槲皮素、B為H1、C為H1/槲皮素包合物、D為H2、E為H2/槲皮素包合物。A槲皮素呈表面光滑的細(xì)長條狀；B呈表面粗糙的顆粒狀；C呈表面光滑的碎片狀；D呈表面凹凸不平的粗糙顆粒狀；E呈表面光滑細(xì)膩的塊狀。由此可見，無論是H1還是H2，與槲皮素包合后，表面變得更加光滑平整，這可能是槲皮素與H1或H2相互作用引起的。

圖2 掃描電鏡

2.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)曲線分析

配制好的槲皮素乙醇溶液濃度分別為0.8×10-5、1.6×10-5、2.4×10-5、3.2×10-5、4.0×10-5、4.8×10-5、5.6×10-5mol/L，在室溫下掃描槲皮素的Abs（掃描波長λ在300～500 nm），結(jié)果見圖3。由圖3可知，在同一波長下測得的Abs先隨著槲皮素乙醇溶液濃度的增大而增大，并在376 nm附近出現(xiàn)最高峰，因此，取λ=376 nm處的Abs繪制標(biāo)準(zhǔn)工作曲線，曲線方程為：y=0.232 6x+0.022 3（R2=0.998 5）。

圖3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

2.4 H/槲皮素的結(jié)合常數(shù)分析

客體在300～550 nm波長范圍內(nèi)有紫外吸收，而H1和H2在此區(qū)間幾乎沒有吸收，因此，選取固定的槲皮素濃度（2.0×10-5mol/L），只改變H1的濃度進(jìn)行測定。在無水乙醇和水的混合溶液（V無水乙醇∶V水=3∶2）中加入H1，紫外吸收光譜和擬合線性曲線如圖4所示。圖4中的插圖為[H]0[G]0/ΔA對[H]0繪制的擬合曲線，兩者呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，表明H1與槲皮素的包合比為1∶1；隨著H1的濃度不斷增加，槲皮素的吸光度也不斷增大，吸收峰由376 nm遷移到385 nm，發(fā)生輕微紅移，可能是槲皮素與H1包合后產(chǎn)生p-π電子躍遷引起的[10]，由此說明H1與槲皮素形成了包合物。

圖4 紫外吸收光譜和結(jié)合常數(shù)擬合曲線

H1與槲皮素的包合比例為1∶1，因此，H1與槲皮素的反應(yīng)過程滿足下列公式[11]：

式中：[H]0表示H1的初始濃度，[G]0表示槲皮素的初始濃度，α為紫外光譜的敏感因子，ΔA為H1的相對紫外吸收強(qiáng)度。用[G]0[H]0/ΔA對[H]0作圖，得到如圖4所示的線性擬合曲線。由圖4可看出，H1與槲皮素呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。H1與槲皮素之間的結(jié)合常數(shù)KS可以由擬合曲線的斜率與截距得出。經(jīng)計(jì)算得到：KS/1=3.88×105。同理可得：H2與槲皮素的結(jié)合常數(shù)KS/2=3.11×105。

2.5 包合物水溶性分析

用紫外-可見分光光度計(jì)測待測液的Abs，根據(jù)室溫下客體的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線：y=0.105 1x－0.000 1（R2=0.999 4）計(jì)算得到，客體在水中的溶解度S=0.02 mg/mL，H1與槲皮素包合物在水中的溶解度S1=1.50 mg/mL，增容了75倍左右；H2與槲皮素的包合物在水中的溶解度S2=1.12 mg/mL，增容了56倍左右。

3 結(jié)語

首先，通過飽和水溶液合成2種修飾β-CD，通過IR、UV、SEM進(jìn)行表征；其次，采用紫外光譜測定了H1、H2與槲皮素的結(jié)合常數(shù)，計(jì)算出H1/H2與槲皮素之間的結(jié)合常數(shù)KS，KS/1=3.88×105，KS/2=3.11×105；最后，采用飽和水溶液法比較兩種包合物的水溶性。實(shí)驗(yàn)證明，H1與槲皮素的包合物增容了75倍左右，H2與槲皮素的包合物增容了56倍左右。原因可能是修飾β-CD中的氨基有效提高了CD對槲皮素的包合能力。H1比H2鏈上多兩個(gè)“N”，增加了識(shí)別位點(diǎn)，提高了長鏈對槲皮素的包合能力，所以H1的溶解度和溶解性均大于H2。