劉亞磊,賈新林,陳思潤,徐盛玉
(四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)研究所,四川成都 611130)
我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部規(guī)定2020 年7 月1 日起飼料生產(chǎn)企業(yè)停止生產(chǎn)含有促生長類藥物飼料添加劑(中藥類除外)的商品飼料。飼料端禁止抗生素使用對我國養(yǎng)殖業(yè)和飼料行業(yè)來說都是一個(gè)挑戰(zhàn),隨著動(dòng)物的抵抗能力降低,發(fā)病率增高,治療性抗生素用量的增加會(huì)使養(yǎng)殖業(yè)面臨巨大壓力。近年來,人們不斷尋找抗生素替代品。金屬離子抗菌產(chǎn)品具有性價(jià)比高、質(zhì)量穩(wěn)定、廣譜抗菌性、不易產(chǎn)生耐藥性等優(yōu)勢。鎵(Gallium,Ga)離子已被美國食品藥物管理局(Food and Drug Administration,F(xiàn)DA)批準(zhǔn)應(yīng)用于醫(yī)藥領(lǐng)域。鎵離子不僅對腫瘤治療有積極作用,且具有抗菌活性,此外還具有抗炎、免疫調(diào)節(jié)、抗高鈣和鎮(zhèn)痛的作用,因此各種鎵制劑越來越多地用于抗菌和臨床的研究。目前已知鎵離子的抗菌作用主要與細(xì)菌鐵代謝有關(guān),但是鎵離子抗菌作用的具體機(jī)制和分子靶點(diǎn)并不明確。目前養(yǎng)殖業(yè)面臨嚴(yán)峻挑戰(zhàn),而鎵離子有顯著的抗菌活性,探究鎵離子能否作為替抗產(chǎn)品應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)具有重要意義。本文綜述了鎵離子的抗菌作用及機(jī)制研究進(jìn)展,為鎵離子抗菌劑作為替抗產(chǎn)品應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)提供參考。
1875 年,法國化學(xué)家布瓦博得朗(Paul Emile Lecoq de Boisbaudran)首次發(fā)現(xiàn)了鎵元素,其原子序數(shù)為31,原子量為69.723,位于第四周期第IIIA 族。鎵是第一個(gè)先由理論預(yù)測而后在自然界中被發(fā)現(xiàn)證實(shí)的化學(xué)元素,動(dòng)物必需的微量元素中并沒有鎵,也沒有發(fā)現(xiàn)鎵有生理功能。Dudley 等對大鼠注射乳酸鎵(Gallium Lactate),發(fā)現(xiàn)鎵可被腸道微量地吸收,然后進(jìn)入到骨、肝臟和腎臟中,鎵主要通過尿液排出體外。低劑量注射乳酸鎵并不會(huì)對機(jī)體產(chǎn)生毒害作用,目前并沒有文獻(xiàn)表明鎵有生殖毒性。
鎵化合物作為抗癌藥物很早就被應(yīng)用到臨床研究,隨著新型鎵制劑的研發(fā),其抗癌效果也更加顯著。硝酸鎵(Gallium Nitrate)是多發(fā)性骨髓瘤、骨質(zhì)疏松癥的有效治療藥物;鎵還可以通過影響T 細(xì)胞和巨噬細(xì)胞發(fā)揮抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用,也可通過影響破骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞發(fā)揮抗高鈣血的作用。另外,鎵可參與細(xì)菌鐵代謝而具有抗菌活性。
微生物的生存和生長需要鐵,鐵可參與蛋白質(zhì)合成、DNA 合成、三羧酸循環(huán)、氧化應(yīng)激反應(yīng)、電子傳遞等重要的生物學(xué)過程。而鎵之所以能夠?qū)?xì)菌的鐵代謝產(chǎn)生影響,主要是因?yàn)殒壟c鐵的化學(xué)性質(zhì)有相似性。鎵和鐵的八面體離子半徑分別為0.620、0.645 ?,四面體離子半徑分別為0.47、0.49 ?,電子親和值分別為30.71、30.65 eV。細(xì)菌生物系統(tǒng)不能區(qū)分鎵和鐵,因此鎵可以有效地被細(xì)菌所攝取,并參與細(xì)菌的生化過程。Fe還原為Fe是許多細(xì)胞代謝過程中的關(guān)鍵步驟,與鐵不同的是,鎵在生理?xiàng)l件下不能被還原,因此,鎵能破壞細(xì)菌氧化還原過程,抑制其基本功能,最后達(dá)到殺菌效果。
2.1 鎵離子體外抗菌作用 2000 年以前關(guān)于鎵抗菌的研究并未取得明顯的進(jìn)展,隨著鎵離子的作用得到重視,人們對鎵離子的抗菌效果做了更廣泛深入的研究,發(fā)現(xiàn)很多鎵化合物具有良好的抗菌活性。對鎵化合物體外抗菌的研究發(fā)現(xiàn)其對一種或幾種致病菌具有抑制作用。本文對近幾年有關(guān)鎵化合物體外抗菌的一些最新成果進(jìn)行總結(jié),包括鎵化合物在不同生長培養(yǎng)基條件下對不同細(xì)菌的抑制濃度、對寄生蟲的抑制濃度(表1)以及人工合成的鎵離子材料的抑菌作用(表2)。
表1 鎵化合物對不同細(xì)菌的體外抑制濃度
表2 鎵離子材料抑菌作用
以上研究表明,很多鎵化合物在體外對病原蟲及多種細(xì)菌有良好的抑制作用,并且培養(yǎng)基不同其抑制效果也有所不同,特別是培養(yǎng)基中鐵含量顯著影響鎵的抑制濃度,因此鎵發(fā)揮抗菌作用與細(xì)菌鐵代謝有關(guān)。另外,很多人工合成的鎵離子材料也對細(xì)菌具有良好的殺滅效果,說明鎵離子在體外的抗菌效果非常顯著。
2.2 鎵離子體內(nèi)抗菌作用 鎵不僅在體外具有良好的抗菌效果,在動(dòng)物體內(nèi)同樣具有抗菌效果(表3)。在一些感染了細(xì)菌的動(dòng)物模型中,鎵很好地發(fā)揮了抗菌作用。研究發(fā)現(xiàn),對肺部感染了銅綠假單胞菌的小鼠和人注射硝酸鎵,小鼠存活率提高,肺和血液中銅綠假單胞菌數(shù)量減少,對人體也有積極的治療作用。Lawless 等研究發(fā)現(xiàn)將鎵涂抹于馬遠(yuǎn)端肢體創(chuàng)傷面上可減少愈合時(shí)間,并減少生物負(fù)載和旺盛肉芽組織,同時(shí)降低了創(chuàng)傷面細(xì)菌數(shù)量。大蠟螟幼蟲感染銅綠假單胞菌后注射鎵可提高其存活率,增加血細(xì)胞的產(chǎn)生,顯著提高了抗菌活性。鎵也可通過抑制金黃色葡萄球菌并在短期內(nèi)誘導(dǎo)纖維組織生長,從而對大鼠骨髓炎有治療效果。在兔雅司病模型中,外用麥芽酸鎵可顯著抑制皮損發(fā)展,降低接種部位梅毒螺旋體。納米鎵可穿透秀麗隱桿線蟲殺死銅綠假單胞菌和鮑曼不動(dòng)桿菌,從而延長秀麗隱桿線蟲的存活時(shí)間,并且納米鎵對幼蟲并沒有明顯的負(fù)面影響。在大鼠創(chuàng)面植入載鎵真皮支架對銅綠假單胞菌有明顯的預(yù)防作用,且具有良好的生物相容性。
表3 鎵化合物在動(dòng)物體內(nèi)的抗菌作用
以上研究表明,很多鎵化合物對感染細(xì)菌的動(dòng)物模型具有良好的治療效果,說明鎵離子在體內(nèi)的抗菌效果同樣顯著。但是不同研究使用的鎵化合物劑量有很大差異,而且?guī)缀跞亲⑸浠蛲庥面?,說明鎵的使用還沒有明確的劑量,注射或外用的方式可能更有利于鎵發(fā)揮作用。值得注意的是,目前鎵在畜禽上的應(yīng)用較少,可能原因是鎵并沒有被人們所熟知,鎵作為比稀土還要稀缺的戰(zhàn)略金屬成本較高,另外考慮到鎵的安全性以及排放等問題,因此鎵沒有得到廣泛應(yīng)用。盡管如此,鎵離子的優(yōu)勢依然明顯,在畜禽上合理使用鎵具有廣闊前景。
2.3 其他 一些最新的研究表明,鎵不僅對細(xì)菌有抑制作用,而且對真菌也有較好的抑制作用。通過分析抑菌圈直徑,有研究發(fā)現(xiàn)鎵葉酸配合物()除了對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌和金黃色葡萄球菌等細(xì)菌有殺滅作用,對黃曲霉()和白色念珠菌()等真菌同樣具有殺滅作用。硝酸鎵對煙曲霉菌()有抑制作用,MIC=32 mg/L;對不同種類的念珠菌也有抑制作用,MIC=16~256 mg/L。一些鎵基材料如鎵基生物活性玻璃及其高分子水凝膠復(fù)合材料均對白色念珠菌有良好的抑制效果。
以上研究表明,鎵對細(xì)菌、真菌、病原蟲均有抑制作用,因此鎵作為抗菌藥物應(yīng)用于動(dòng)物生產(chǎn)以及臨床具有很大的潛力。
鎵離子發(fā)揮抗菌作用主要是由于其干擾細(xì)菌的鐵代謝,對細(xì)菌產(chǎn)生不利影響。鐵是細(xì)菌生長必需的營養(yǎng)物質(zhì),在宿主體內(nèi),鐵主要與轉(zhuǎn)鐵蛋白(Transferrin)、乳鐵蛋白(Lactoferrin)或血紅素(Heme)結(jié)合,游離的鐵離子非常少,這些蛋白質(zhì)為入侵的細(xì)菌創(chuàng)造了一個(gè)限鐵環(huán)境,使細(xì)菌難以獲得鐵,從而抑制細(xì)菌生長。然而細(xì)菌也進(jìn)化出幾種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來滿足自身需要,而鎵離子正是通過參與細(xì)菌的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),進(jìn)一步影響細(xì)菌的正常生長代謝,如使細(xì)菌鐵依賴酶失活、產(chǎn)生氧化應(yīng)激,從而起到殺菌作用。
3.1 鎵參與細(xì)菌鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)使細(xì)菌鐵缺乏 細(xì)菌可通過鐵載體(Siderophores)轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)來獲取鐵,由于細(xì)菌不能有效地區(qū)分鎵和鐵,因此鎵離子便可以參與上述3 種鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),從而順利被細(xì)菌所攝取進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),導(dǎo)致細(xì)菌鐵缺乏。其參與過程主要是通過一些受體蛋白以及在轉(zhuǎn)運(yùn)體提供能量的條件下進(jìn)行(圖1)。
3.1.1 鎵可與細(xì)菌鐵載體結(jié)合 鐵載體是細(xì)菌合成和分泌的一種小分子有機(jī)物,作為一種鐵螯合劑可以強(qiáng)力結(jié)合Fe,對細(xì)菌的生長起著至關(guān)重要的作用。鐵載體能夠和宿主體內(nèi)的轉(zhuǎn)鐵蛋白、乳鐵蛋白等鐵結(jié)合蛋白競爭Fe,從而形成Fe-鐵載體復(fù)合物,這種復(fù)合物與細(xì)菌細(xì)胞外膜上的鐵載體受體蛋白(Outer-Membrane Receptors,OMRs)相結(jié)合,然后通過TonB 系統(tǒng)被細(xì)菌攝取進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)(圖1),F(xiàn)e進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)后被還原為Fe,F(xiàn)e與鐵載體的親和力低,從而被釋放。分子建模研究表明,鎵可與鐵載體緊密結(jié)合,并且鎵與鐵載體結(jié)合的能力甚至優(yōu)于鐵,因此鎵與鐵載體結(jié)合降低了未結(jié)合金屬離子的鐵載體濃度,抑制了細(xì)菌鐵攝取。另外,鎵與鐵載體有很高的親和力,有利于細(xì)菌受體的識別,從而避開細(xì)菌的防御系統(tǒng),以鎵-鐵載體復(fù)合物的形式被細(xì)菌所攝取,由于鎵離子并不能被還原,因此可擾亂細(xì)菌的代謝。此外也可以直接設(shè)計(jì)鎵鐵載體復(fù)合物,可以更高效地針對細(xì)菌鐵載體轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)對細(xì)菌產(chǎn)生抑制,研究發(fā)現(xiàn),人工合成的鎵鐵載體復(fù)合物其對結(jié)核分歧桿菌(s)的抗菌效果比硝酸鎵提高了1 倍。
圖1 細(xì)菌鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)及鎵參與細(xì)菌鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)
3.1.2 鎵可與轉(zhuǎn)鐵蛋白和乳鐵蛋白結(jié)合 轉(zhuǎn)鐵蛋白是血漿中主要的含鐵蛋白質(zhì),動(dòng)物體消化吸收的鐵和紅細(xì)胞降解釋放的鐵都是由轉(zhuǎn)鐵蛋白運(yùn)載。乳鐵蛋白是一種鐵結(jié)合糖蛋白,屬于轉(zhuǎn)鐵蛋白家族,同樣參與鐵的轉(zhuǎn)運(yùn)。細(xì)菌可以通過轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合蛋白(Transferrin Binding Proteins,TBPs)或乳鐵蛋白結(jié)合蛋白(Lactoferrin Binding Proteins,LBPs)來獲取宿主轉(zhuǎn)鐵蛋白或乳鐵蛋白中的鐵,整個(gè)攝取系統(tǒng)由TonB 系統(tǒng)提供能量(圖1)。Nikoleta 等采用分子建模工具探索鎵在原子水平上的抗菌機(jī)制,結(jié)果表明,雖然轉(zhuǎn)鐵蛋白對鎵有很高的親和力,但是轉(zhuǎn)鐵蛋白優(yōu)先與鐵結(jié)合,并且鎵不能置換出轉(zhuǎn)鐵蛋白中的鐵。值得注意的是,鎵和鐵在與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合位點(diǎn)的競爭中,鎵雖然不能勝過鐵,但是轉(zhuǎn)鐵蛋白只有1/3 的結(jié)合位點(diǎn)被鐵占據(jù),因此鎵仍然可以與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合。鎵與轉(zhuǎn)鐵蛋白結(jié)合形成復(fù)合物后,被細(xì)菌TBPs 結(jié)合,然后轉(zhuǎn)鐵蛋白中的鎵透過細(xì)胞質(zhì)膜被運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞內(nèi),鎵便可以參與細(xì)菌的代謝,而且鎵還可以抑制鐵的釋放。
3.1.3 鎵化合物干擾細(xì)菌血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng) 在宿主體內(nèi),大多數(shù)的鐵離子以血紅素的形式存在。血紅素又稱亞鐵原卟啉(Ferroprotoporphyrin),是一種鐵卟啉(Iron Porphyrin)化合物,參與血紅蛋白和肌紅蛋白的組成,每個(gè)血紅素含一個(gè)亞鐵離子。細(xì)菌擁有高效的血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng),通過外膜上的血紅素受體與ABC 轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白可將血紅素或血紅蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)中,然后被血紅素氧化酶(heme oxygenase,HO)或血紅素降解蛋白(hemedegrading protein)降解,從而獲得鐵離子(圖1)。由于細(xì)菌高效的血紅素獲取系統(tǒng),一些類似血紅素的卟啉類化合物已經(jīng)被用作抗菌劑。卟啉與鐵以外的金屬絡(luò)合物可以干擾細(xì)菌的血紅素獲取系統(tǒng),從而具有抗菌活性。由于鎵具有與鐵相似的化學(xué)特性,因此鎵具有多方面的優(yōu)勢,如鎵能夠更好地與卟啉絡(luò)合,絡(luò)合物能更容易被細(xì)菌識別,從而被細(xì)菌所攝取干擾其代謝。鎵與卟啉的絡(luò)合物中最具代表性的便是原卟啉鎵,具有良好的抗菌活性。
3.2 鎵進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后誘導(dǎo)細(xì)菌死亡 鎵離子進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞后可降低鐵依賴酶的活性,使DNA 合成降低;通過影響細(xì)胞色素破壞電子傳遞鏈;產(chǎn)生氧化應(yīng)激,影響細(xì)菌正常形態(tài),最終導(dǎo)致細(xì)菌的死亡(圖2)。
圖2 鎵誘導(dǎo)細(xì)菌死亡的途徑
3.2.1 鎵使細(xì)菌鐵依賴酶活性降低或失活 細(xì)菌的繁殖較快,代謝也很旺盛,因此細(xì)菌對鐵的需求很高,相關(guān)的鐵依賴酶的活力也很高,鎵的代謝干擾對細(xì)菌的殺傷力也很高。鎵干擾細(xì)菌攝取鐵導(dǎo)致細(xì)菌鐵缺乏,進(jìn)一步使鐵依賴酶的活性降低甚至失活,特別是核糖核苷酸還原酶(Ribonucleotide Reductase,RR)。在RR 催化下,核糖核苷酸(Ribotide)被還原為脫氧核糖核苷酸(Deoxynucleotide),RR 是DNA 合成和修復(fù)的關(guān)鍵酶和限速酶,因此對于細(xì)菌繁殖至關(guān)重要。在細(xì)菌缺鐵的情況下,導(dǎo)致RR 的M2 亞基活性受到抑制,最終使RR 失活,DNA 的合成被阻止。分子建模研究發(fā)現(xiàn),鎵可以取代RR 金屬結(jié)合位點(diǎn)上的鐵,從而導(dǎo)致酶抑制,鎵還可以與RR 的底物二磷酸核苷(nucleoside diphosphates,NDPs)結(jié)合形成復(fù)合物,而RR 不能識別這種復(fù)合物,從而降低了底物水平,導(dǎo)致RR 饑餓,DNA 合成被阻止(圖2)。細(xì)菌攝取鎵同樣會(huì)影響其他的鐵依賴酶,比如過氧化物酶(Peroxidase)、過氧化氫酶(Catalase)、含鐵超氧化物歧化酶(Iron-Containing Superoxide Dismutase)、烏頭酸酶(Aconitase)等,鐵缺乏導(dǎo)致這些酶的活性被抑制,與這些酶有關(guān)的代謝反應(yīng)也會(huì)被抑制。
3.2.2 鎵可破壞細(xì)菌電子傳遞鏈 含鐵硫簇(Iron-Sulfur Cluster)的蛋白質(zhì)在三羧酸循環(huán)(Citric Acid Cycle)和電子傳遞鏈(Electron Transport Chain)中非常重要,而鎵很可能與這些蛋白質(zhì)相互作用,從而影響細(xì)菌的呼吸和能量代謝。細(xì)胞色素是一類以血紅素作為輔基的電子傳遞蛋白,通過血紅素輔基中鐵原子的還原態(tài)(Fe)和氧化態(tài)(Fe)之間的可逆變化傳遞電子,參與細(xì)菌的氧化還原反應(yīng)。原卟啉鎵體外培養(yǎng)細(xì)菌結(jié)果表明,原卟啉鎵很可能通過血紅素轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)與細(xì)胞色素結(jié)合,導(dǎo)致細(xì)胞色素不能傳遞電子,從而破壞細(xì)菌的電子傳遞鏈(圖2)。
3.2.3 鎵可使細(xì)菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激 鎵可以誘導(dǎo)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)的產(chǎn)生,使細(xì)菌產(chǎn)生氧化應(yīng)激,致使DNA 氧化損傷,包括鏈斷裂和核苷酸修飾,其中SOS 相關(guān)基因SulA 表達(dá)上調(diào),其產(chǎn)物與細(xì)菌處于分裂狀態(tài)時(shí)隔膜形成的關(guān)鍵蛋白FtsZ 結(jié)合,抑制FtsZ 蛋白組裝,影響Z 環(huán)的形成,最后阻止細(xì)菌分裂(圖2)。
3.3 其他 硝酸鎵可以破壞細(xì)菌的細(xì)胞膜,阻止細(xì)胞膜生成,鎵與慶大霉素(Gentamycin)聯(lián)合使用可以完全消除銅綠假單胞菌被膜的形成。用硝酸鎵處理的銅綠假單胞菌中與應(yīng)激反應(yīng)、DNA 損傷/ 修復(fù)、鐵硫簇和血紅素儲(chǔ)存相關(guān)的蛋白豐度增加,而與群體感應(yīng)、鞭毛運(yùn)動(dòng)和細(xì)胞氧化還原相關(guān)的蛋白豐度降低。鎵可與鐵競爭某些含鐵蛋白質(zhì)的金屬結(jié)合位點(diǎn),不同的培養(yǎng)基會(huì)對鎵在體外的抗菌活性產(chǎn)生影響,而培養(yǎng)基中鐵含量至關(guān)重要。限鐵條件會(huì)增強(qiáng)鎵的抗菌效果,而在培養(yǎng)基中添加鐵會(huì)降低鎵的抑菌作用,在感染細(xì)菌的動(dòng)物模型中添加鐵同樣會(huì)降低鎵的治療效果。因此,鎵的抗菌機(jī)制和鐵緊密相關(guān),在鐵含量較少的情況下能發(fā)揮更大的作用。
體內(nèi)和體外試驗(yàn)表明,鎵類化合物具有明顯的抗真菌、抗細(xì)菌活性。鎵和鐵具有相似性,可通過細(xì)菌的鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi),從而干擾細(xì)菌代謝,最終達(dá)到殺菌目的。但是鎵的抗菌機(jī)制并未明確,因此鎵的抗菌效果及機(jī)制的研究有待進(jìn)一步深入。
目前以細(xì)菌營養(yǎng)和新陳代謝為目標(biāo)的抗菌策略正受到越來越多的關(guān)注,鎵具有明顯的抗菌效果,鎵離子抗菌劑是多靶點(diǎn)藥物,所以,細(xì)菌不易對鎵產(chǎn)生耐藥性。此外合理劑量的鎵對宿主并無毒害作用。目前養(yǎng)殖業(yè)都是集約化養(yǎng)殖,飼料端禁止抗生素使用后,豬的細(xì)菌性疾病發(fā)病率會(huì)增加,導(dǎo)致生產(chǎn)效率降低,由于鎵在畜禽上的應(yīng)用較少,因此鎵對畜禽等動(dòng)物的抗菌、免疫、調(diào)節(jié)作用及機(jī)制的研究有待開展及深入,從而在一定理論的指導(dǎo)下為鎵在畜禽上的應(yīng)用提供相應(yīng)數(shù)據(jù)支撐。鎵已在臨床上用于癌癥的治療,未來其在動(dòng)物生產(chǎn)上的應(yīng)用具有廣闊的前景。