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      夷陵綿羊KISS1 基因多態(tài)性及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析

      2022-07-13 11:21:58王明晶潘冬梅顏軼男代春鵬劉桂瓊
      中國畜牧雜志 2022年7期
      關(guān)鍵詞:夷陵產(chǎn)羔外顯子

      王明晶,潘冬梅,顏軼男,代春鵬,劉桂瓊*

      (1.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院,湖北武漢 430070;2 湖北致清和農(nóng)牧有限公司,湖北宜昌 443100)

      青春期啟動受下丘腦-垂體-性腺軸(Hypothalamic Pituitary Gonadal,HPG)內(nèi)分泌系統(tǒng)的調(diào)控,腫瘤轉(zhuǎn)移抑制基因()是HPG 軸上游的重要調(diào)控激素,參與啟動青春期。1996 年,Lee 等發(fā)現(xiàn)基因具有抑制腫瘤轉(zhuǎn)移的作用。基因的編碼產(chǎn)物是kisspeptin,與其受體GPR54 結(jié)合通過/系統(tǒng)發(fā)揮功能?;蚓幋a的前體物質(zhì)可以水解為Kisspeptin54、Kisspeptin14、Kisspeptin13和Kisspeptin10。Kisspeptins 的羧基末端都有10 肽片段Arg-Phe-NH2(-RF amide)序列(即第45 位酪氨酸與54 位苯丙氨酸之間的酰胺化肽段),該片段與受體結(jié)合并激活受體,因此Kisspeptin-10 是kisspeptin結(jié)合和激活其受體GPR54 的區(qū)域,也是具有生物活性的最小序列。師美紅等發(fā)現(xiàn)小鼠卵巢次級卵泡的kisspeptin 表達減少,降低卵泡對FSH 的敏感性,使血清中FSH 水平升高,從而募集大量的初級卵泡,最終可能使卵母細胞耗竭,這表明基因的表達可能通過影響卵母細胞質(zhì)量影響胚胎的產(chǎn)生。基因的多態(tài)性對羊產(chǎn)羔數(shù)的影響是國內(nèi)外研究的熱點,張圓等發(fā)現(xiàn)濟寧青山羊基因G296C 位點GG 型產(chǎn)羔數(shù)高,而曹貴玲等則發(fā)現(xiàn)CC 型母山羊的產(chǎn)羔數(shù)高于其他2 種基因型的母羊。Mahmoud 等發(fā)現(xiàn)基因內(nèi)含子1 的T121A 位點與產(chǎn)羔數(shù)有顯著相關(guān),其中TT基因型母羊發(fā)情期雌二醇17的水平較高,推測該位點可能通過影響雌二醇分泌影響山羊的產(chǎn)羔數(shù)。黔北麻羊和貴州黑山羊群體基因內(nèi)含子1 的G277C 位點和T486A 位點與產(chǎn)羔數(shù)有關(guān),G277C 位點的GG 基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)最高,T486A 位點的TT、TA 基因型個體的產(chǎn)羔數(shù)均顯著高于AA 基因型個體。安雪姣等發(fā)現(xiàn)基因的多態(tài)性與小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù)無關(guān),但季節(jié)性發(fā)情綿羊群體基因g.1317523C>T位點的基因型頻率和基因頻率與常年發(fā)情綿羊群體差異顯著,推測該位點可能與綿羊的季節(jié)性繁殖有關(guān)。杜丹丹發(fā)現(xiàn)湖羊基因的g.37C>T、g.38G>A、g.89G>A、g.4783C>G、g.5117T>C 位點的等位基因頻率在高繁組與低繁組間差異顯著,推測這些位點可能與綿羊的高產(chǎn)性狀有關(guān),但其所選擇樣本量較少。夷陵綿羊是以東弗利生羊、小尾寒羊和湖羊3 個品種雜交選育而成的綿羊群體,其突出特點是產(chǎn)多羔,因此本研究以該群體為研究對象,檢測其基因序列,尋找該群體基因的多態(tài)位點,分析其與產(chǎn)羔性狀的關(guān)系,為進一步研究基因?qū)d羊繁殖性狀的作用提供參考。

      1 材料與方法

      1.1 實驗動物 采集湖北致清和農(nóng)牧有限公司292 只成年經(jīng)產(chǎn)母羊的血樣5 mL,用乙二胺四乙酸二鉀(EDTA2K dipotassium edetate,EDTA-2K)抗凝,樣品-20℃保存。記錄母羊二胎以上的產(chǎn)羔數(shù),計算母羊的平均產(chǎn)羔數(shù)。

      1.2 綿羊基因的PCR 擴增 酚-氯仿抽提法提取綿羊基因組DNA,OD/OD值在1.6~1.8 之間,測定濃度 并稀釋至50 μg/μL,-4 ℃保存。用Primer-BLAST 設(shè)計引物擴增綿羊基因序列(序列號:NC_040263.1)的3 個外顯子(引物序列見表1)。PCR 反應(yīng)體系:1 μLDNA(50 μg/μL),上下游引物(100 umol/L)各1 μL,10 μL MIX,7 μL 蒸餾水。擴增程序:94℃預(yù)變性5 min,94℃變性30 s,退火30 s,72℃ 1 min,30 個循環(huán),72℃延伸10 min。第3 外顯子GC 含量高,因此選用高保真酶和降落PCR 程序進行擴增。根據(jù)北京全式金生物技術(shù)有限公司的高保真酶試劑盒說明在25 μL 的PCR 反應(yīng)體系中添加7.5 μL 的GC Enhancer。降落擴增程序的退火溫度為65~55℃,每1 個循環(huán)退火溫度降1℃,再55℃退火溫度下20 個循環(huán)。PCR 擴增產(chǎn)物送天一輝遠生物科技有限公司測序。

      表1 KISS1 基因引物序列

      1.3 基因頻率計算、連鎖分析、單倍型構(gòu)建及其與產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)分析 比對擴增個體基因序列和參考序列,確定SNP 位點,綿羊基因參考序列第1 外顯子第1 位堿基位為+1。計數(shù)基因各多態(tài)位點的基因型,計算基因型頻率和基因頻率。用Haploview 對基因各多態(tài)位點進行連鎖分析和單倍型構(gòu)建。用SPSS 中單因素方差分析對基因型和單倍型組合與個體產(chǎn)羔數(shù)進行差異顯著分析,分析模型如下:

      其中:Y為個體表型記錄;為群體均值;G為各位點的基因型或單倍型效應(yīng);E為隨機誤差。

      2 結(jié)果

      2.1 夷陵綿羊基因的PCR 擴增 以夷陵綿羊基因組DNA 為模板擴增基因外顯子,擴增產(chǎn)物用2% 瓊脂糖凝膠電泳檢測,結(jié)果見圖1。由圖1 可知,PCR 擴增產(chǎn)物條帶明亮、無雜帶,說明基因引物特異性較好,片段大小與引物設(shè)計擴增的片段大小一致,說明擴增的DNA 片段是目的片段。

      圖1 夷陵綿羊KISS1 基因外顯子擴增片段

      2.2基因SNP 位點信息 將瓊脂糖凝膠電泳檢測的PCR 產(chǎn)物測序,用SeqMan 軟件分析292 只綿羊基因外顯子序列的多態(tài)性,共檢測到14 個SNPs位 點,即g.18C>T、g.21A>G、g.61C>T、g.62G>A、g.113G>A、g.191C>G、g.205G>C、g.3410G>A、g.5666C>T、g.5760C>G、g.5760C>T、g.5765C>T、g.5768G>A、g.5894G>T、g.5906T>C(圖2)。

      圖2 夷陵綿羊KISS1 基因多態(tài)性

      表2 是這些突變位點在基因中的位置、等位基因及對應(yīng)氨基酸信息,由表2 可知,除g.18C>T、g.21A>G 和g.5760C>G/T 外,其余11 個SNPs 位點為非同義突變。在11 個非同義突變中,g.61C>T、g.62G>A位點突變導(dǎo)致編碼的精氨酸密碼子突變?yōu)榻K止密碼子。

      表2 夷陵綿羊KISS1 基因SNP 位點

      2.3基因SNP 位點的基因頻率 g.5765C>T 與g.5894G>T 位點在夷陵綿羊群體中只檢測到2 種基因型,g.5765C>T 位點主要是CC 基因型,g.5894G>T 位點主要是GG 基因型。在這些基因突變位點中,g.21A>G位點參考基因序列堿基的基因頻率較低,其余位點參考基因序列堿基的基因頻率都很高。由表3 可知,夷陵綿羊基因的g.61C>T、g.62G>A、g.113G>A、g.205G>C 位點偏離哈代-溫伯格平衡(<0.05)。

      表3 KISS1 基因SNP 位點等位基因頻率

      2.4基因SNP 位點的連鎖分析 對14 個SNPs位點進行連鎖不平衡分析,結(jié)果表明g.18C>T、g.21A>G位點構(gòu)成連鎖區(qū)塊1(Block1),g.61C>T 和g.113G>A位點構(gòu)成連鎖區(qū)塊2(Block2),g.191C>G 和g.205G>C位點構(gòu)成連鎖區(qū)塊3(Block3)(圖3)。Blolck1、Blolck2 和Blolck3 的分別為0.562、0.986、0.966,因此Blolck2 和Blolck3 呈現(xiàn)連鎖不平衡。

      圖3 夷陵綿羊KISS1 基因SNP 位點的連鎖圖譜

      分別對3 個連鎖區(qū)塊構(gòu)建單倍型,用Blolck1 的g.18C>T 和g.21A>G 共2 個位點在綿羊群體中構(gòu)建了7 種單倍型組合,分別是:CCGG、CTAG、CCAG、CTAA、TTAA、CCAA 和CTGG,分別占總數(shù)的57.6%、24.0%、8.83%、4.59%、2.12%、1.41% 和1.41%。用Blolck2 的g.61C>T 和g.113G>A 共2 個位點在綿羊群體中構(gòu)建了4 種單倍型組合,分別是:CCGG、CTGA、TTAA 和CTAA,其中單倍型組合CCGG 為主要單倍型組合,占總數(shù)的75.4%,CTGA 和TTAA 則分別占20.4%和3.87%,CTAA 的頻率最低,為0.352%。用Blolck3 的g.191C>G 和g.205G>C 共2 個位點在 綿羊群體中構(gòu)建了5 種單倍型組合,分別是:CCGG、CGGC、GGCC、CGGG 和CGCC,分別占 總數(shù)的66.7%、27.0%、5.32%、0.709% 和0.355%,其中單倍型CCGG 為主要單倍型。

      2.5基因SNP 位點及其單倍型對夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)的影響 在11 個非同義突變中,g.18C>T、g.21A>G、g.61C>T、g.62G>A、g.113G>A、g.191C>G、g.205G>C、g.3410G>A、g.5666C>T、g.5760C>G、g.5768G>A、g.5894G>T、g.5906T>C 的多態(tài)性與夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)沒有關(guān)聯(lián)。基因和g.5765C>T 位點的多態(tài)性與夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析結(jié)果見表4。g.5765C>T 位點只有2 種基因型,其中CC 基因型母羊產(chǎn)羔數(shù)比CT基因型高0.45 頭(<0.05)。

      表4 KISS1 基因SNP 位點基因型與綿羊產(chǎn)羔數(shù)的關(guān)聯(lián)性分析

      由于樣本的部分單倍型數(shù)量較少,因此在進行關(guān)聯(lián)分析時,只選取樣本含量大于10 的單倍型組合與綿羊產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析。Block1、Blolck2 和Blolck3 中的單倍型與產(chǎn)羔數(shù)均無顯著相關(guān)。

      3 討論

      綿羊繁殖力是影響其經(jīng)濟效益的重要指標(biāo),夷陵綿羊選育自四季發(fā)情、繁殖力強的湖羊,且湖羊血統(tǒng)占50%,故具有與湖羊相近的繁殖性能,平均產(chǎn)羔率達200% 以上,因此研究影響夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)的分子標(biāo)記對于綿羊多胎資源的開發(fā)利用及生產(chǎn)實踐有重要意義?;蛟诰d羊的下丘腦、垂體、卵巢等組織器官中表達,但基因的SNP 位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)無顯著關(guān)聯(lián)。且基因在卵巢中的表達量隨日齡和發(fā)情周期而改變,并且發(fā)情期母羊卵巢基因的表達量極顯著高于發(fā)情后期、間情期和發(fā)情前期,因此基因可能在母羊發(fā)情排卵中發(fā)揮功能。

      在山羊基因的多態(tài)性與產(chǎn)羔數(shù)的研究中,發(fā)現(xiàn)影響產(chǎn)羔數(shù)的位點主要位于基因的內(nèi)含子,在綿羊的相關(guān)研究中,主要對基因多態(tài)與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)進行了關(guān)聯(lián)分析,其結(jié)果不一致。安雪姣等發(fā)現(xiàn)基因的SNP 位點與小尾寒羊產(chǎn)羔數(shù)無顯著關(guān)聯(lián),Chu 等則發(fā)現(xiàn)小尾寒羊基因G1035A位點顯著影響小尾寒羊的產(chǎn)羔數(shù),而湖羊基因該位點只存在G 等位基因,因此該位點不影響湖羊的產(chǎn)羔數(shù),該位點與本研究的g.3410G>A 位點相同,也與本研究夷陵綿羊的產(chǎn)羔數(shù)無關(guān),可能的原因是本研究所用群體的湖羊血統(tǒng)占50%。本研究選擇基因為候選基因,研究該基因SNP 與綿羊產(chǎn)羔數(shù)之間的關(guān)聯(lián),發(fā)現(xiàn)夷陵綿羊基因外顯子上有14 個SNPs 位點,其中11 個SNPs 位點為非同義突變位點,g.5760C>G/T位點有3 個復(fù)等位基因,之前沒有相關(guān)研究結(jié)果,該位點突變位于密碼子的第3 位堿基,不改變編碼的氨基酸。杜丹丹在基因的外顯子區(qū)域篩查到g.37C>T、g.38G>A、g.89G>A 和g.3556G>A 位點,且這些位點的等位基因頻率可能與綿羊產(chǎn)羔數(shù)有關(guān),這4 個位點與本研究的g.61C>T、g.62G>A、g.113G>A 和g.3410G>A為同一位點,擴大樣本后將這些SNPs 位點與產(chǎn)羔數(shù)進行關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn),這4 個SNPs 位點的多態(tài)性與綿羊的產(chǎn)羔數(shù)之間沒有關(guān)聯(lián)。本研究發(fā)現(xiàn)g.5765C>T 位點與產(chǎn)羔數(shù)顯著關(guān)聯(lián),其中CC 基因型為優(yōu)勢基因型,且CC 基因型母羊的產(chǎn)羔數(shù)顯著高于CT 型母羊,該位點位于CDS 區(qū),發(fā)生非同義突變后,使原編碼的脯氨酸(Pro)改變?yōu)榱涟彼幔↙eu),因此該位點對夷陵綿羊繁殖性狀的選育具有一定的指導(dǎo)意義。

      4 結(jié)論

      夷陵綿羊基因存在14 個SNPs 位點,這些位點形成3 個連鎖區(qū)塊,這14 個SNPs 位點中僅g.5765C>T 與產(chǎn)羔數(shù)顯著相關(guān),因此g.5765C>T 位點可能是影響夷陵綿羊產(chǎn)羔數(shù)的主效位點,可作為綿羊選育的輔助標(biāo)記。

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