衣康酸酐改性膠原制備光固化水凝膠

程玉林,李國英*

（1.四川大學制革清潔技術國家工程實驗室，四川成都 610065；2.四川大學皮革化學與工程教育部重點實驗室，四川 成都 610065）

前言

膠原水凝膠具有良好的生物相容性、低免疫原性和可生物降解性，且膠原分子含有特定的氨基酸殘基和序列能促進細胞的粘附和生長，因此廣泛應用于生物醫(yī)學領域[1-3]。膠原水凝膠的制備通常是用5 mg/mL 膠原溶液在37 ℃下培養(yǎng)3 h 自組裝成膠，且據文獻報道[4]，在1 Hz 時儲能模量僅90.57 Pa，損耗模量僅12.25 Pa。膠原水凝膠所需成膠時間過長，還存在機械性能不足的問題，極大的限制了膠原水凝膠的臨床應用潛力。

光固化具有無溶劑、快速節(jié)能和條件溫和的優(yōu)點[5]，且可對水凝膠的形成過程進行控制，開發(fā)性能和結構皆可調節(jié)的水凝膠[6]。目前制備膠原基光固化水凝膠多使用丙烯酸類修飾膠原，如Ke Yang 等[7]通過膠原甲基丙烯酰胺制備光固化水凝膠并用于軟骨再生。但丙烯酸只能從石油化工原料中獲得，具有刺激性和過敏性[8]，還有一定的毒性[9]。

衣康酸是含有一個碳碳不飽和雙鍵的二元酸，且可通過真菌發(fā)酵獲得[10]，是一種光固化材料中丙烯酸的生物基替代品[11]，主要在添加劑和橡膠涂層等領域，用于制備生物基助劑[12]和開發(fā)環(huán)保光固化涂料[13]，衣康酸制備光固化水凝膠的報道尚很欠缺。在哺乳動物體內，衣康酸是抗菌代謝物和免疫細胞代謝調節(jié)物[14-15]，具有生物相容性、可生物降解性、抗菌性[16]、抗炎性[17-18]和藥物緩釋能力[19]。這些優(yōu)異的生物性能標示著衣康酸在生物醫(yī)藥領域有巨大的潛力。S.Potorac 等人[20]制備了單衣康酸基團的改性膠原，并添加N,N,N’,N’-四甲基乙二胺和過硫酸銨與甲基丙烯酸2-羥乙酯共聚24 h 制備了半互穿網絡，并指出該支架可用于組織工程，反應所用交聯(lián)劑毒性較大，耗時長。鑒于此，本文擬用衣康酸改性膠原并通過光固化快速制備水凝膠。

由于酸酐反應活性更高，本工作選用衣康酸酐改性膠原，通過具有細胞相容性的光引發(fā)劑引發(fā)碳碳雙鍵的自由基聚合[21-22]，使聚合物溶解度降低，并形成網孔結構，最終喪失流動性而形成凝膠[23-24]，成膠示意圖如圖1。制備了不同取代度形成的光固化水凝膠以探究取代度對光固化凝膠性能的影響，并根據其性能評價了光固化水凝膠在傷口敷料中的潛在應用前景，且為實現(xiàn)光固化凝膠性能的可調控性奠定基礎。

圖1 光固化水凝膠形成機理Fig.1 Schematic of the photocurable hydrogel formation

1 實驗部分

1.1 實驗儀器和材料

凍干牛皮膠原，實驗室自制；衣康酸酐（98%+），阿達瑪斯試劑有限公司；三硝基苯磺酸（TNBS），Sigma 公司；Irgacure 2959（98%），Aldrich 化學試劑公司；營養(yǎng)瓊脂，北京奧博星生物技術有限公司；瓊脂粉，成都金山化學試劑有限公司。

TU-1900 雙光束紫外可見分光光度計，普析通用儀器有限責任公司；Nicolet iS10 傅里葉紅外光譜儀，美國賽默飛世爾科技有限公司；MCR 流變儀，安東帕公司；FD-1A-50 冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司。

1.2 膠原的改性

稱取1.5 g 膠原溶解于500 mL 的磷酸緩沖液（pH 值7.4），加入10 mL 衣康酸酐丙酮溶液在0～10℃下持續(xù)攪拌24 h 后，用截留相對分子質量為8～14 KD 的透析袋在去離子中水透析三天后冷凍干燥得到可光固化膠原。其中，膠原分子的自由氨基（牛皮膠原每1000 個氨基殘基含33 個賴氨酸和羥賴氨酸殘基[25]）與衣康酸酐物質的量比分別為1∶10、1∶30、1∶50、1∶70 和1∶90，制備得到的樣品依次記為A、B、C、D 和E。

1.3 可光固化膠原的表征

1.3.1 取代度測定

通過三硝基苯磺酸（TNBS）法[26]測定膠原游離氨基的取代程度，具體方法為：將牛皮膠原與可光固化膠原分別溶解在0.01 mol/L 的鹽酸溶液中配置為2 mg/mL 的溶液，取250 μL 入消解管，加入1 mL磷酸緩沖液（pH 值為8），避光加入1 mL 0.1%的TNBS 溶液，搖晃均勻后在50 ℃暗反應30 min。反應結束后加入2 mL 4 mol/L 的HCl 溶液，置于暗處，冷卻30 min 后測定混合液在340 nm 處吸光度（OD），并根據以下公式計算自由氨基含量：

自由氨基含量=OD可光固化膠原/OD牛皮膠原×100%

1.3.2 傅里葉紅外光譜測定

為測定可光固化膠原的結構，將凍干的牛皮膠原和可光固化膠原海綿分別與溴化鉀研磨均勻并壓成薄片，用傅里葉紅外光譜儀在400～4000 cm-1范圍內進行掃描，掃描次數(shù)32 次。

1.4 光固化凝膠的制備

以磷酸緩沖液（pH 值7.4）為溶劑，可光固化膠原質量濃度10 mg/mL，并加入0.2%的Irgacure 2959，充分溶解后離心脫泡得到預制液。分別稱取A～E 樣品預制液2 g 于24 孔板（孔直徑為2 cm）中，用紫外光（6 W，365 nm）照射3 min 得到光固化水凝膠，分 別 標 記 為Gel-A、Gel-B、Gel-C、Gel-D 和Gel-E。

1.5 凝膠的成膠能力與凝膠形貌測定

1.5.1 膠凝時間測定

稱取1 g 凝膠預制液于3 mL 取樣瓶中，置于紫外光源下照射，利用傾斜法測定并記錄不同官能化程度的可光固化膠原樣品的凝膠時間。

1.5.2 凝膠的形貌觀察

將凍干后的光固化水凝膠噴金處理后，在加速電壓20 kV 下通過電子顯微鏡觀察樣品的形貌。

1.6 凝膠的流變測量

使用流變儀測定水凝膠的機械性能，將待測水凝膠放至流變儀的不銹鋼平行板（直徑20 cm）上，設置板間間隙2 mm，在溫度為20 ℃，應變?yōu)?%的條件下，進行動態(tài)頻率掃描，記錄頻率范圍為0.01～10 Hz 的儲能模量（G'）和損耗模量（G'''）。

1.7 凝膠的溶脹性能

水凝膠的溶脹比在37 ℃條件下測定，將凍干的凝膠海綿稱重后浸泡在20 mL 磷酸緩沖液（pH值6.5），每2 h 對凝膠稱量，直到凝膠重量不變，每個樣品進行三個平行實驗，并根據公式（1）計算溶脹度后取平均值：

溶脹度=W凝膠/W海綿-1 （1）

1.8 體外抗菌實驗

選取金黃色葡萄球菌（S.aureus）和大腸桿菌（E.coli）驗證不同樣品的抗菌特性，具體操作為：取10 μL 菌液（1×107cfu/mL）于營養(yǎng)瓊脂平板上，涂布均勻，將水凝膠（高度=5 mm，直徑=10 mm）紫外殺菌30 min 后放置在平板中央，在37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h后使用游標卡尺測量抑制區(qū)域直徑。用未添加水凝膠的瓊脂板作為空白對照組，且每個樣品進行三次平行實驗，并計算抑制區(qū)的平均直徑。

2 結果與討論

2.1 酸酐用量對自由氨基含量的影響

衣康酸酐主要與膠原側鏈上的ε- 氨基發(fā)生?；磻猍27]，氨基作為親核基團進攻酸酐中羰基的碳原子形成酰胺鍵與羧基，而衣康酸酐分子中1 號與2 號碳原子存在p-Π 共軛，因此氨基更傾向于攻擊4 號碳原子，主要反應原理見圖1。圖2 為自由氨基含量隨衣康酸酐用量的變化關系。如圖2 所示，樣品A～E 的自由氨基含量分別89.5%、43.0%、29.6%、22.9%和17.2%，即其取代度分別為10.5%、57.0%、70.4%、77.1%和82.8%。隨著衣康酸酐用量增加，自由氨基含量減少，直到自由氨基與衣康酸酐物質的量比為1∶50 自由氨基含量下降趨勢明顯減緩。因為受自由氨基總量限制，當衣康酸酐用量增加到一定程度后，能參加反應的自由氨基數(shù)量減少，自由氨基含量下降趨勢減緩，這初步說明成功在膠原側鏈上接枝了衣康酸基團。

圖2 牛皮膠原（Col）與可光固化膠原（A、B、C、D 和E）自由氨基含量Fig.2 Free amino content of bovine collagen (Col) and photocurable collagen (A, B, C, D and E)

2.2 可光固化膠原的紅外光譜分析

紅外光譜中酰胺Ⅲ帶與1450 cm-1處的吸收率（A）比值可評價膠原三股螺旋結構完整性[28-29]，明膠的比值僅為0.59，而膠原的比值遠高于明膠[30]。牛皮膠原及可光固化膠原的紅外光譜圖如圖3，Col 與A～E 的A 酰 胺Ⅲ/A1450 值 依 次 為0.996、0.806、0.821、0.863、0.863 和0.875，比值均大于0.59，說明可光固化膠原保留了一定程度的三股螺旋結構。相比于牛皮膠原紅外光譜，官能化膠原的光譜在3432 cm-1附近的吸收峰發(fā)生略微紅移，且波峰變寬，這是因為衣康酸酐消耗了氨基，生成了酰胺鍵，故而氨基中伯胺中N-H 的伸縮震動（3440 cm-1附近）減弱，而仲酰胺N-H 伸縮震動（3300 cm-1附近）增強；同時，1405 cm-1處峰吸收強度明顯增加，這歸因于CH2=CR1R2結構中C-H 鍵的彎曲振動[31]。紅外圖譜的這些變化進一步證明衣康酸酐成功的接枝到膠原上，得到了可光固化膠原。

圖3 牛皮膠原與可光固化膠原的紅外光譜圖Fig.3 IR spectra of Col and photocurable collagen

2.3 光固化凝膠的成膠能力與形態(tài)表征

多孔結構敷料非常有利于吸收分泌物和保持水分，光固化凝膠的實物圖與微觀結構圖如圖4 所示，結果顯示，所有樣品都能在180 s 內快速成膠，Gel-A、Gel-B、Gel-C、Gel-D 和Gel-E 的平均孔徑分別為1.25、1.12、0.89、0.74 和0.44 mm，可見，隨著取代度增加，凝膠固化所需時間變長，同時凝膠孔徑逐漸變小。因為逐漸凝膠化使鏈段移動性降低，只能與臨近位點發(fā)生反應，且可光固化膠原分子內存在的大量游離羧基還會產生排斥而不利于固化反應[32]；另一方面，羧基使可光固化膠原溶解度增加而難以形成凝膠。而取代度增加導致反應位點變多，凝膠的交聯(lián)度變大從而獲得了更小孔徑也更致密的凝膠網絡。因此，可以通過調節(jié)膠原與酸酐的比例來調整可光固化膠原的成膠能力與凝膠孔徑結構。

圖4 光固化凝膠的宏觀照片（左）和放大倍數(shù)為20 的SEM圖像（右）（對應可光固化膠原的取代度：Gel-A=10.5%；Gel-B=57.0%；Gel-C=70.4%；Gel-D=77.1%；Gel-E=82.8%，下同）Fig.4 Macro photos (left) and SEM images with magnification of 20 (right) of the photocurable hydrogel(corresponding substitution degree of photocurable collagen:GEL-A=10.5%;Gel-B=57.0%;GEL-C=70.4%,Gel-D=77.1%;gel-E=82.8%,the same below)

2.4 凝膠的力學性能

傷口敷料通常需要一定的強度和柔韌性，圖5顯示了光固化凝膠的動態(tài)流變測量曲線。儲能模量和損耗模量分別反映了聚合物的彈性與粘性特性的耗散能量[33]。在頻率低于1 Hz 時，每個樣品的儲能模量與損耗模量都變化不大，說明樣品在0.01～1 Hz 范圍內機械性能穩(wěn)定；同時儲能模量明顯大于損耗模量，說明樣品具有彈性性質。相對于不同取代度可光固化膠原制備的光固化凝膠，其儲能模量與損耗模量都先增加后減小，樣品Gel-C 的儲能模量與損耗模量最大，其抵抗形變與流動的能力最強。Gel-D 與Gel-E 的儲能模量與彈性模量下降，主要是因為聚合物中羧基使其溶解度增加，交聯(lián)固化作用小于溶解流動作用。

圖5 光固化凝膠的力學性能（a）儲能模量（G’）、（b）損耗模量（G’’）和（c）損耗角正切值（tanθ）與頻率的函數(shù)Fig.5 Mechanical properties of photocurable hydrogel(a)Storage modulus(G'),(b)loss modulus(G")and(c)loss tangent(tan θ)as a function of frequency

頻率為1 Hz 時凝膠的儲能模量、損耗模量和損耗角正切值見表1。在1 Hz 時，Gel-C 的儲能模量為358.07 Pa，損耗模量為45.93 Pa，分別為膠原水凝膠[4]的3.95 和3.75 倍。Gel-C 相對于Gel-A 的儲能模量與彈性模量分別增加了1.80 與1.26 倍，儲能模量變化大于彈性模量，說明光固化反應對于凝膠彈性影響更大。損耗角正切值（tanθ）為損耗模量與儲能模量的比值，該值大于1時表示主要為粘性行為（類似于液體），該值小于1時主要為彈性行為（類似于固體）[34]，表1 中所有樣品的損耗角正切值小于0.19，表明凝膠具有較好的彈性。在所有樣品中，Gel-C 的tanθ數(shù)值最小，彈性最好且強度高，有利于保護傷口不受外力傷害。

表1 頻率為1 Hz 時儲能模量（G'）、損耗模量（G''）和損耗角正切（tanθ）的數(shù)值Tab.1 Values of storage modulus (G'), loss modulus (G'')and loss tangent (tanθ) at a frequency of 1 Hz

2.5 凝膠的溶脹分析

通常人類的體溫為37 ℃，皮膚pH 值在6.5 左右，光固化凝膠在該條件下的溶脹情況如圖6 所示。光固化凝膠的溶脹主要歸因于羧基，羧基在pH值低于或高于等電點時分別呈正電和負電性，使凝膠快速吸水，但吸水至一定程度時會受到凝膠孔隙的制約，因而最終達到溶脹平衡。結果顯示，所有凝膠在前期快速溶脹，且在溶脹4 h 后趨于平衡，不同交聯(lián)度的凝膠溶脹性能先增加后減小。說明在一定取代度范圍內，光固化凝膠的溶脹性隨著衣康酸基團取代度升高而明顯增加但交聯(lián)過于致密反而會使溶脹性能降低。溶脹24 h 后，質量體積濃度5%的明膠甲基丙烯酰胺光交聯(lián)水凝膠的溶脹率為15 左右[35-36]，而Gel-C 的溶脹率高達37.65，吸水能力強，有利于吸收傷口滲出液[37]。

圖6 光固化凝膠在磷酸緩沖液中的溶脹情況（a）溶脹度與時間的曲線；（b）凝膠24 h 后的溶脹度Fig.6 Swelling of photocured hydrogel in phosphate buffer(a)Curve of swelling degree versus time;(b)Swelling degree after 24 h

2.6 體外抗菌性能分析

傷口敷料需要具備一定的抗菌能力。陰離子聚合物殺菌機理是聚合物的負電荷趨使聚合物中疏水部分靠近細菌[38]，進而通過疏水作用擾動和破壞細胞膜而起到殺菌作用[39]。衣康酸基團使光固化凝膠具有陰電性，為驗證其抗菌性能，測量了光固化凝膠的抑菌圈直徑，結果如圖7。光固化凝膠交聯(lián)度越高，對金黃色葡萄球菌（S.aureus）抑菌圈直徑越大，而凝膠對大腸桿菌（E.coli）未顯示出抑制效果。因為抑菌效果與衣康酸含量呈正相關[40]，且S.aureus和E.coli 的細胞壁不同，E.coli 含外壁膜和肽聚糖內層，而S.aureus 的僅有多孔肽聚糖層，使疏水片段更容易插入[41]。

圖7 光固化凝膠的抑菌圈直徑Fig.7 Diameter of bacteriostatic zone of photocurable hydrogel

3 結論

通過調節(jié)衣康酸基團的取代度，可以調節(jié)光固化凝膠性能：隨著衣康酸基團取代度增加，光固化凝膠的交聯(lián)度增加，孔徑變?。荒z的儲能模量和損耗模量與溶脹性隨交聯(lián)度增加先增加后減少，抗菌性與衣康酸基團含量呈正相關。綜合性能最佳的光固化凝膠為Gel-C，此時凝膠自由氨基含量為29.6%（即取代度為70.4%），儲能模量和損耗模量分別為358.07 Pa 和45.93 Pa，且溶脹率高達37.65。該光固化凝膠可快速成膠，且擁有高溶脹性和一定的抗菌性，有望用于制備傷口敷料。