樊星語，胡冰琪，黃俊峰，楊 英，劉歡歡，張 浩，王 琴，周 強，陳禮文

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)感染是重要的公共健康問題，感染人體后表現(xiàn)為急、慢性乙型肝炎，肝硬化和肝細胞癌等[1]。盡管可使用有效的疫苗預(yù)防，但在全球范圍內(nèi)尚未成功根除 HBV。PTEN是重要的抑癌基因，在人類很多癌癥(如肺癌、卵巢癌、甲狀腺癌、肝癌等)中發(fā)生突變或缺失，幾乎一半的肝癌患者存在PTEN基因的缺失[2]。有研究[1]顯示，PTEN的磷酸酶活性正向調(diào)節(jié)干擾素調(diào)節(jié)因子3(IRF3)進入細胞核，發(fā)揮促進先天免疫反應(yīng)作用，且此結(jié)果在HBV感染的細胞中得到了驗證。但HBV感染后IFN-α介導的JAK/STAT信號通路與PTEN間的關(guān)系尚未完全清楚。該研究旨在分析HBV感染后PTEN下調(diào)所致的IFN-α的抗病毒活性變化機制，為研究抗HBV感染提供線索。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器HepG2細胞、HepG2.2.15細胞、HBV1.3質(zhì)粒、空白載體(pcDNA3.1)由安徽醫(yī)科大學第二附屬醫(yī)院檢驗科留存；PTEN-OE質(zhì)粒、RNA抽提試劑(TRIzol)、引物序列購自上海生工生物公司；DMEM、0.25%胰蛋白酶購自美國Gibco公司；胎牛血清(FBS)、遺傳霉素G418、雙抗(×100青-鏈霉素溶液)、PBS購自美國 HyClone公司；BCA蛋白濃度檢測試劑盒購自上海碧云天生物公司；抗PTEN、IRF9、MxA等抗體購自英國Abcam公司；抗GAPDH、山羊抗兔/鼠IgG抗體購自美國Affinity公司；LipofectamineTM3000 轉(zhuǎn)染試劑購自美國 Invitrogen 公司；poly(I ∶C)購自美國GLPBIO公司；ECL底物發(fā)光試劑盒購自美國Pierce公司；RNA反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光染料SYBR購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.2 方法

1.2.1細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 HepG2、HepG2.215細胞采用含10%FBS、1%雙抗的DMEM培養(yǎng)，其中HepG2.2.15 細胞的每100 ml培養(yǎng)基中加入320 ng遺傳霉素G418，培養(yǎng)條件為37 ℃ 、5%CO2，待細胞生長至 90% 融合時，用胰蛋白酶消化1～2 min，1 ∶3傳代培養(yǎng)。待細胞至對數(shù)生長期，將胰蛋白酶消化的細胞均勻鋪至細胞培養(yǎng)板，待細胞融合至70%～80%時使用新鮮培養(yǎng)基換液后進行轉(zhuǎn)染。按照 LipofectamineTM3000試劑使用說明轉(zhuǎn)染細胞，48 h 后收集細胞用于化學發(fā)光技術(shù)、qRT-PCR、Western blot檢測。

1.2.2poly(I ∶C)處理細胞 HepG2.2.15細胞轉(zhuǎn)染PTEN-OE/pcDNA3.1 質(zhì)粒36 h后使用新鮮培養(yǎng)基換液，以LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑向細胞中轉(zhuǎn)染適量poly(I ∶C)，12 h后收集細胞上清液和胞內(nèi)RNA、蛋白用于化學放光法、qRT-PCR和Western blot檢測。

1.2.3HBV相關(guān)指標定量檢測 向HepG2.2.15細胞中轉(zhuǎn)染PTEN-OE和pcDNA3.1質(zhì)粒，48 h后收集細胞培養(yǎng)上清液，細胞上清液中乙肝表面抗原(HBsAg)、乙肝e抗原(HBeAg)指標由雅培全自動化學發(fā)光分析儀 i4000 SR檢測。

1.2.4qRT-PCR實驗 采用TRIzol法提取細胞總RNA進行逆轉(zhuǎn)錄得到cDNA，qRT-PCR 檢測IFN-α、HBV pgRNA 的表達水平，GAPDH作為內(nèi)參。引物列表見表1,反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性2 min,95 ℃變性15 s,55 ℃退火15 s,72 ℃延伸1 min。

表1 引物序列

1.2.5Western blot實驗 用PBS沖洗后各孔加含PMSF(體積比1 ∶100)的RIPA裂解液，冰上裂解30 min后刮取細胞至EP管，離心(15 000 r/min、30 min,4 ℃)后收集上清液并使用BCA法進行蛋白定量，加入×5蛋白上樣緩沖液，沸水中煮10 min后冷卻。使用SDS-PAGE (10%分離膠+5%濃縮膠)電泳分離蛋白質(zhì)， 蛋白信息轉(zhuǎn)至PVDF膜后使用含5%脫脂牛奶的TBST溶液封閉2 h，TBST洗膜3次后加入一抗(抗-IRF-9抗體：1 ∶2 000；抗-MxA抗體：1 ∶1 000；抗-PTEN抗體：1 ∶1 000；抗-GAPDH抗體：1 ∶5 000)中4 ℃振蕩孵育過夜。根據(jù)一抗來源室溫孵育二抗(山羊抗兔/鼠 IgG抗體：1 ∶5 000)1～2 h，ECL兩種試劑1 ∶1混勻后均勻滴加在膜上，使用ECL儀曝光顯色，以GAPDH作為內(nèi)參。

2 結(jié)果

2.1 HBV感染對PTEN蛋白表達的影響HepG2細胞同時轉(zhuǎn)染HBV1.3和pcDNA3.1質(zhì)粒，48 h后提取蛋白，Western blot檢測PTEN蛋白的表達。結(jié)果顯示，瞬時轉(zhuǎn)染HBV的HepG2中，PTEN蛋白的表達較對照組降低(圖1A)；與HepG2細胞相比，穩(wěn)定表達HBV1.3基因組的HepG2.2.15細胞中PTEN蛋白的表達降低(圖1B)。因此，在HBV瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的肝癌細胞中，PTEN蛋白表達均下調(diào)。

圖1 Western blot檢測瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBV的細胞中PTEN蛋白的表達

2.2 PTEN對HBV表達的影響實驗結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，PTEN-OE組HBsAg、HBeAg表達降低(圖2),差異有統(tǒng)計學意義(F=83.351，P<0.05；F=396.415，P<0.05)；PTEN-OE組pgRNA表達降低(圖3),差異有統(tǒng)計學意義(F=643.375,P<0.05),提示PTEN下調(diào)HBV相關(guān)抗原及pgRNA的表達。

圖2 化學發(fā)光法檢測HepG 2.2.15細胞轉(zhuǎn)染后HBsAg、HBeAg的表達與空白載體pcDNA3.1組比較：*P<0.05

圖3 qRT-PCR檢測HepG2.2.15細胞轉(zhuǎn)染后HBV pgRNA的表達

2.3 PTEN對IFN-α表達的影響向HepG2.2.15細胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1和PTEN-OE，處理36 h后轉(zhuǎn)染poly(I ∶C)將實驗分為4組：pcDNA3.1組、pcDNA3.1+ poly(I ∶C)組、PTEN-OE組、PTEN-OE + poly(I ∶C)組。提取細胞內(nèi)RNA，qRT-PCR 技術(shù)檢測細胞中IFN-α mRNA的表達結(jié)果顯示，PTEN-OE和pcDNA3.1組IFN-α沒有明顯差異，PTEN+poly(I ∶C)刺激組IFN-α表達水平高于pcDNA3.1+poly (I ∶C)刺激組(圖4)，差異有統(tǒng)計學意義(F=171.549,P<0.05)

圖4 qRT-PCR檢測HepG 2.2.15細胞轉(zhuǎn)染和poly(I ∶C)刺激后IFN-α mRNA的表達與無poly(I ∶C)處理組比較：*P<0.05

2.4 PTEN對MxA、IRF-9蛋白表達的影響Western blot檢測各組細胞中MxA、IRF-9蛋白表達結(jié)果顯示，與pcDNA3.1組相比，PTEN-OE的HepG2.2.15細胞中IRF9、MxA蛋白表達增加，兩組均使用poly (I ∶C)誘導后，PTEN-OE組IRF9、MxA蛋白表達水平較空白組明顯上升(圖5)。

圖5 Western blot檢測HepG 2.2.15細胞轉(zhuǎn)染和poly(I ∶C)刺激后IRF9、MxA蛋白的表達

3 討論

HBV是一種通過血液或人體分泌物傳播的DNA病毒，進入宿主細胞后，通過HBV pgRNA的復(fù)制，產(chǎn)生松弛的環(huán)狀DNA，最終在核內(nèi)轉(zhuǎn)化為共價閉合DNA(cccDNA)，利用不同啟動子，轉(zhuǎn)錄4種mRNA、編碼9種病毒蛋白(HBsAg、 HBeAg、 HBcAg、RT等)并逆轉(zhuǎn)錄出HBV DNA[3]。慢性乙型病毒性肝炎(CHB)是HBV侵犯肝臟所致的感染，全世界有超過 2.57 億慢性感染者，約20% 的 CHB 感染者死于肝硬化、肝功能衰竭或肝細胞癌 (HCC) 的并發(fā)癥，且HBV感染與急慢性肝炎、肝硬化和HCC患者的預(yù)期壽命直接相關(guān)[4]。盡管接種疫苗可以有效預(yù)防感染， 但目前的治療方法只能控制和抑制病毒而不能治愈[5]，HBV感染仍然是全球主要的健康問題之一。

PTEN全長200 KB，于1997 年由兩個研究小組在研究染色體位置 10q23 時發(fā)現(xiàn)，在腦、前列腺和膀胱腫瘤中顯示出頻繁的缺失[6]。PTEN的主要功能是作為磷酸肌醇磷酸酶，通過負調(diào)節(jié)PI3K/AKT信號通路調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄、翻譯、細胞周期進程、誘導細胞死亡、刺激血管生成和干細胞自我更新發(fā)揮其抑癌作用[7]。多項研究[8-9]表明，PTEN在HCC表達中降低，并且與腫瘤等級、大小和腫瘤標志物表達相關(guān)。除了抑癌作用外，PTEN還調(diào)節(jié)由病毒感染激活的先天免疫應(yīng)答。有研究[10]表明，在仙臺病毒(SeV)、水泡性口炎病毒(VSV)或poly(I ∶C)的刺激下，PTEN在體內(nèi)參與誘導I型干擾素(IFN-α、IFN-β)的產(chǎn)生，在Ser97位點誘導IRF-3去磷酸化并促進其轉(zhuǎn)移進入細胞核。目前，IFN-α和核苷類似物是主要用于治療CHB的藥物[11]。HBV感染后，宿主細胞釋放IFN，所有類型的IFN(IFN Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ)與相應(yīng)受體結(jié)合激活JAK/STAT信號通路，導致STAT1和STAT2的二聚化與IRF9結(jié)合形成了干擾素刺激基因因子3(ISGF3)復(fù)合物，該復(fù)合物轉(zhuǎn)位至細胞核并與干擾素刺激反應(yīng)元件(ISRE)結(jié)合以促進干擾素刺激基因(ISG)的轉(zhuǎn)錄, 誘導細胞產(chǎn)生抗病毒蛋白(如MxA)的表達[12]。

該研究表明，在瞬時轉(zhuǎn)染和穩(wěn)定表達HBV的肝癌細胞內(nèi)，PTEN蛋白水平均下調(diào)，表明HBV感染與PTEN的表達存在一定相關(guān)性。為進一步探究PTEN的表達對HBV表達的影響，以PTEN-OE轉(zhuǎn)染穩(wěn)定表達HBV的HepG2.2.15細胞，研究表明HBV相關(guān)抗原(HBsAg、HBeAg)和HBV pgRNA表達水平下調(diào)，HBsAg是乙肝病毒外殼部分含表面抗原,標志HBV的感染，HBeAg、HBV pgRNA是提示HBV病毒復(fù)制的指標，這些結(jié)果共同表明PTEN可能參與下調(diào)HBV感染后的病毒復(fù)制，與Kim et al[9]的研究結(jié)果一致。Poly(I ∶C)是一種病毒雙鏈RNA類似物，可在體外誘導IFN的表達，發(fā)揮抗病毒作用[13]。由于細胞本身分泌的內(nèi)源性IFN-α含量較低，變化不易被觀察到，通常采用外源poly(I ∶C)同時刺激細胞以放大所研究目的基因?qū)FN-α及其信號通路的作用效果。該研究表明，PTEN單獨刺激細胞后，IFN-α水平較對照組未產(chǎn)生顯著差異，實驗組和對照組同時外加poly(I ∶C)刺激后，PTEN-OE組IFN-α水平較對照組顯著上升，且PTEN-OE促進了HepG2.2.15細胞中JAK/STAT通路中IRF9、MxA蛋白的表達。由于PTEN作為抑癌基因，在癌細胞中低表達，故該實驗只驗證了癌細胞中過表達PTEN后的結(jié)果。通過以上結(jié)果可以推斷，HBV感染可能通過下調(diào)PTEN水平發(fā)揮拮抗IFN-α介導的JAK/STAT信號通路的抗病毒作用。