葉晨旭, 宋轉轉, 張文秀, 吳濤宇, 劉 鶴, 邢連喜, 蘇曉紅,*

(1. 西北大學生命科學學院, 西安710069; 2. 陜西省珍稀瀕危動物保育重點實驗室, 西安710069)

社會性昆蟲由于個體之間的分化和相互合作而構成了復雜的品級結構，“分工合作”是社會性昆蟲在生態(tài)學上高度進化的一個重要因素。在所有的社會性昆蟲中，白蟻具有最復雜和顯著的品級分化。白蟻在卵期并不包含品級的某種特殊因素，品級分化現(xiàn)象是在卵期以后的發(fā)育過程中出現(xiàn)的。品級分化調(diào)節(jié)因素有3個方面：環(huán)境因素、作用于個體之間的信息素和內(nèi)分泌調(diào)節(jié)因素(Elliott and Stay, 2008; Korb, 2015)。白蟻通常有兵蟻、工蟻和生殖蟻3個品級，品級的分化最終是由基因表達差異決定的(Yeetal., 2019)；不同品級甚至在表皮結構和表皮蛋白相關基因表達都有顯著差異，這些差異與品級的功能相適應(Suetal., 2016; Rasheedetal., 2019)。散白蟻屬Reticulitermes卵孵化后經(jīng)過2個齡期幼蟻發(fā)育途徑向兩個方向分化: 一個是若蟻途徑(生殖型途徑)，長翅成蟲就是由此途徑產(chǎn)生并經(jīng)過婚飛配對建立新巢成為原始蟻王和蟻后，也可形成翅芽型補充生殖蟻(brachypterous neotenic reproductives)和擬成蟲型補充生殖蟻(adultoid neotenic reproductives)；另一個是工蟻途徑,工蟻發(fā)育有3種可能：維持工蟻、經(jīng)過2次蛻皮成為兵蟻或成為無翅芽型補充生殖蟻(Elliott and Stay, 2008; Korb and Hartfelder, 2008; Korb, 2015; Suetal., 2015)。因此，僅有工蟻的蟻群可以自行產(chǎn)生補充生殖蟻(neotenic reproductives, NRs)和兵蟻發(fā)育為成熟蟻群。散白蟻雄性工蟻不需要轉化成為形態(tài)明顯的補充生殖蟻就能直接參與交配，而雌性工蟻經(jīng)歷2次蛻皮才能轉化成為雌性補充生殖蟻(Fujita and Watanabe, 2010; Leniaudetal., 2011; Suetal., 2017)。已有的研究證實白蟻巢中的信息素誘導個體內(nèi)保幼激素(juvenile hormone, JH)合成水平的動態(tài)變化，JH通過調(diào)控品級相關基因的表達促進工蟻向兵蟻和補充生殖蟻的轉化(Korb and Hartfelder， 2008; Oguchietal., 2020)。

雌性工蟻向補充生殖蟻轉化最主要的特征是性腺發(fā)育的恢復，然而工蟻卵巢的發(fā)育一直是不清楚的。已有的報道僅是表明工蟻的性腺發(fā)育受抑制，對工蟻生殖發(fā)育缺乏深入研究，尤其雌性工蟻必須經(jīng)過蛻皮轉化成補充生殖蟻之后才能啟動生殖力，這個過程非常復雜。因此，需要對雌工蟻從低齡發(fā)育到老齡，以及老齡工蟻轉化成補充生殖蟻這個過程中卵巢和卵母細胞發(fā)育過程進行完整研究，只有這樣才能闡明工蟻生殖能力的改變是如何發(fā)生的。棲北散白Reticulitermessperatus雌性工蟻向補充生殖蟻轉化卵巢長度約增加了4倍(Fujita and Watanabe, 2010)；對尖唇散白蟻Reticulitermesaculabialis生殖蟻、工蟻和兵蟻卵子發(fā)生比較研究表明三者之間卵母細胞發(fā)育程度有顯著性差異(朱蓉等, 2009; 王云霞等, 2011)。卵母細胞發(fā)育無疑是決定生殖力水平變化的關鍵因素，3齡雌性工蟻發(fā)育到6齡(老齡)工蟻，再轉化為補充生殖蟻的過程中，卵巢以及生殖細胞發(fā)育是如何與其品級的功能相適應的目前還不清楚。

散白蟻屬是世界上分布最廣的白蟻類群之一，在生態(tài)穩(wěn)定和社會經(jīng)濟中具有重要作用(Jongepieretal., 2018)。我國有白蟻4科44屬476種，其中散白蟻屬有111種(黃復生等, 2000; 程冬保和楊兆芬, 2014)。散白蟻種群擴張能力強與雌性工蟻向補充生殖蟻轉化發(fā)育有直接關系。為了揭示雌性工蟻發(fā)育和生殖力改變過程中的性腺發(fā)育，我們研究了圓唇散白蟻Reticulitermeslabralis雌性工蟻從3齡-4齡-5齡-6齡(老齡)-轉化成補充生殖蟻發(fā)育過程中的卵巢和卵母細胞動態(tài)變化；在圓唇散白蟻若蟻向3類生殖蟻轉化的轉錄組中篩選出與卵母細胞生長期相關的基因，并利用這些基因在工蟻向補充生殖蟻轉化發(fā)育過程中的表達變化，揭示工蟻向補充生殖蟻轉化過程中卵母細胞從滯育到恢復生長發(fā)育的起點。

1 材料與方法

1.1 白蟻培養(yǎng)

實驗所用的圓唇散白蟻R.labralis采自陜西省西安市，將帶有蟻巢的木頭帶回實驗室，放置于塑料培養(yǎng)箱內(nèi)(80 cm×50 cm×40 cm)室溫培養(yǎng)；培養(yǎng)箱中的巢群在實驗中作為原巢，從原巢取得的工蟻稱為原巢工蟻。6齡及6齡以上齡期的工蟻為老齡工蟻，圓唇散白蟻的老齡工蟻主要為6齡。從原巢中取老齡工蟻和兵蟻組成隔離群，每個隔離群由50頭老齡工蟻和2頭兵蟻組成，共設置100個隔離群，隔離群中的工蟻稱為“隔離工蟻”。每個隔離群都飼養(yǎng)在鋪有潮濕松木屑的玻璃培養(yǎng)皿中(直徑90 mm)。每天觀察和記錄隔離工蟻發(fā)育情況。在隔離群中，約3周以后出現(xiàn)由雌性工蟻分化的前補充生殖蟻(pre-neotenic reproductives, pre-NRs)，4周以后出現(xiàn)雌性無翅型補充生殖蟻。

1.2 工蟻以及工蟻向補充生殖蟻轉化過程中的卵巢發(fā)育觀察

在原巢中采集3-5齡和老齡工蟻；在隔離群中收集培養(yǎng)20 d的工蟻、前補充生殖蟻、轉變2 d的補充生殖蟻和膨腹的補充生殖蟻。在PBS溶液中解剖個體取得完整卵巢，利用顯微數(shù)碼照相系統(tǒng)VHX-5000(基恩士公司，日本)拍照并測量每個卵巢的長度和寬度(n=10)，卵巢長度包括卵原區(qū)、生長區(qū)和卵黃區(qū)，在卵巢最寬處測量的值計為卵巢寬度; 測量各發(fā)育時期卵巢管基部的卵母細胞長徑用來表示卵母細胞大小(n=10)。卵巢的長度和寬度以及卵母細胞大小均用平均值±標準差表示。

1.3 工蟻向補充生殖蟻轉化過程中的卵母細胞和濾泡細胞發(fā)育觀察

將原巢雌性工蟻、在隔離群中培養(yǎng)20 d的雌性工蟻、前補充生殖蟻、轉變2 d的補充雌性生殖蟻和膨腹的補充生殖蟻個體常規(guī)石蠟切片法切片，切片厚度7 μm，蘇木精-伊紅染色(haematoxylin and eosin staining)。利用數(shù)碼顯微照相系統(tǒng)觀察卵母細胞發(fā)育和濾泡細胞形態(tài)，測量濾泡細胞層厚度(n=10), 濾泡細胞層厚度用平均值±標準差表示。

1.4 基因的篩選

末齡若蟻卵子發(fā)生處于卵母細胞生長期，經(jīng)過一次蛻皮成為翅芽型補充生殖蟻、擬成蟲型補充生殖蟻或有翅成蟲之后, 卵母細胞開始進入卵黃形成期。雌性工蟻恢復生殖能力必須啟動卵母細胞發(fā)育至末齡若蟻水平，具有與末齡若蟻相似的卵母細胞形態(tài)特征和卵母細胞發(fā)育相關基因表達模式。我們已經(jīng)測定了圓唇散白蟻末齡若蟻、以及由末齡若蟻分化的翅芽型補充生殖蟻、擬成蟲型補充生殖蟻和有翅成蟲轉錄組(Suetal., 2016)。利用轉錄組數(shù)據(jù)庫對若蟻和由末齡若蟻分化的生殖蟻的卵母細胞發(fā)育相關基因表達水平進行比較分析，篩選出在末齡若蟻中的表達水平顯著高于轉化初期生殖蟻的與卵母細胞生長期發(fā)育相關的基因，這些基因調(diào)控卵母細胞在生長期的發(fā)育。

1.5 qRT-PCR測定卵母細胞生長相關基因在工蟻向補充生殖蟻轉化中的表達水平

1.5.1RNA提取及反轉錄：在液氮中分別研磨1.3節(jié)樣品至粉末狀，提取RNA；對RNA進行純度檢測合格后，進行下一步反轉錄。選取10 μL體系，RNA溶液8 μL，加入PrimeScriptTMRT Master Mix 2 μL，37℃反轉錄15 min，85℃反轉錄酶失活反應5 s，獲得cDNA文庫。

1.5.2引物的篩選：通過BLASTX軟件設計所選基因的引物序列(表1)，內(nèi)參基因確定為β-action，配置5 μL梯度PCR實驗反應體系: Master Mix 2.5 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.2 μL, ddH2O 1.9 μL, cDNA 0.2 μL。梯度PCR溫度范圍為55±5℃，分為12個溫度梯度。反應后通過瓊脂糖凝膠電泳實驗，篩選出可用引物，確定最適退火溫度。

表1 qRT-PCR引物序列Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

1.5.3qRT-PCR反應：選用Roche LightCycler?480熒光定量PCR反應儀器， PCR反應體系(20 μL): SYBR Premix Ex TaqTMⅡ 10 μL, 上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μL, ROX 0.4 μL, ddH2O 6 μL, cDNA 2 μL。反應程序: 95℃ 30 s; 95℃ 5 s, 60℃ 30 s, 40個循環(huán)；融解曲線模式95℃ 5 s, 60℃ 1 min；降溫50℃ 30 s。每樣品有3個生物重復和3次技術重復。

1.6 數(shù)據(jù)分析

qRT-PCR反應的基因相對表達水平用 2-ΔΔCt方法計算。用R語言中的aov()函數(shù)對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析，通過Tukey HSD()函數(shù)進行多重比較得到各樣本均值差異的成對檢測，P<0.05為顯著性差異；最后用multcomp包中的glht()函數(shù)對結果進行可視化。

2 結果

2.1 工蟻向補充生殖蟻轉化的形態(tài)學變化

圓唇散白蟻工蟻身體為淺麥黃色(圖1: A)；前補充生殖蟻(pre-NRs)身體為乳白色，腹部長度較工蟻的略長(圖1: B)，并且pre-NRs的第7腹片長度明顯變長，覆蓋于第8和9腹板上，與末齡若蟻的第7腹片形態(tài)非常相似，后緣為圓形，弧度非常明顯。NRs身體深麥黃色，頭頂上有縱的深棕色色素沉積帶；中、后胸背板無翅或翅芽(圖1: C)。剛變的NRs，腹部細長，從腹部前端向尾部逐漸變窄，第7腹板也呈明顯的圓弧狀并覆蓋于第8和9腹板上。4周以后，NRs腹部開始明顯膨脹，表明卵母細胞內(nèi)卵黃積累形成(圖1: D)。在實驗過程中，隔離群內(nèi)未發(fā)現(xiàn)有雄性NRs出現(xiàn)。

2.2 工蟻以及工蟻向補充生殖蟻轉化過程中的卵巢發(fā)育

圓唇散白蟻工蟻從3齡(W3), 4齡(W4), 5齡(W5)到老齡工蟻(W6)發(fā)育過程中，隨著齡期增加卵巢長度和寬度逐漸增加，每增加一個齡期，卵巢長度增加約100 μm；工蟻從3齡發(fā)育到老齡階段卵巢長度增加了約1倍。雖然相鄰齡期之間卵巢寬度沒有顯著性差異，卵巢寬度增加不顯著，但是老齡工蟻W6卵巢寬度是W3的約1.5倍，從低齡向老齡發(fā)育過程中卵巢寬度在逐漸增加。隔離20 d的老齡工蟻與原巢老齡工蟻卵巢長度和寬度沒有顯著性差異，但是當隔離群中的雌性工蟻經(jīng)過1次蛻皮轉化成pre-NRs之后，卵巢極度變大。pre-NRs卵巢長度和寬度分別是工蟻的約2倍和3倍，卵巢長度增加近1 mm，寬度增加約150 μm。pre-NRs經(jīng)過1次蛻皮轉化成補充生殖蟻，NRs的卵巢與pre-NRs的卵巢相比，長度和寬度都沒有顯著增加。 NRs膨腹之后，雖然卵巢長度沒有顯著增加，但是寬度顯著增加，膨腹補充生殖蟻(physogastric neotenic reproductives, phy-NRs) 卵巢寬度是剛變NRs的約2倍(圖1: E-J; 圖2)。

圖1 圓唇散白蟻雌性工蟻、前補充生殖蟻和補充生殖蟻的形態(tài)Fig. 1 Morphology of the female workers, pre-neotenicreproductives and neotenic reproductivesof Reticulitermes labralisA: 工蟻Workers; B: 前補充生殖蟻Pre-neotenic reproductives; C: 補充生殖蟻身體細長，頭部有深色色素條紋(箭頭指示) Neotenic reproductives had the elongated abdomens and their heads had dark brown pigmentation stripes (indicated by the arrow); D: 膨腹補充生殖蟻(箭頭指示)Physogastric neotenic reproductives (indicated by the arrow); E: 3齡工蟻的卵巢Ovary of the 3rd instar workers; F: 老齡工蟻的卵巢Ovary of the late instar workers; G: 隔離20 d工蟻的卵巢Ovary of isolated workers for 20 d; H: 前補充生殖蟻的卵巢Ovary of pre-neotenic reproductives; I: 補充生殖蟻的卵巢Ovary of neotenic reproductives; J: 膨腹補充生殖蟻卵巢有具卵黃的卵母細胞(箭頭指示)Ovary of physogastric neotenic reproductives had vitellogenic oocytes (indicated by the arrow).

圖2 圓唇散白蟻工蟻各齡期以及工蟻向補充生殖蟻轉化過程中的卵巢發(fā)育Fig. 2 Ovarian development of workers at each instar andduring the differentiation of workers into neotenicreproductives of Reticulitermes labralis圖數(shù)據(jù)為平均值±標準差；相同顏色柱子上不同字母表示有顯著性差異(P<0.05, Tukey HSD檢驗)。Data in the figure are represented as mean±SD, and different letters above bars with the same colour indicate significant differences (P<0.05, Tukey HSD test). W3-6: 分別為3-6齡工蟻3rd-6th instar workers, respectively; IW: 隔離工蟻Isolated workers; pre-NR: 前補充生殖蟻Pre-neotenic reproductives; NR: 補充生殖蟻Neotenic reproductives; phy-NR: 膨腹補充生殖蟻Physogastric neotenic reproductives.

2.3 工蟻向補充生殖蟻轉化過程中卵母細胞和濾泡細胞的發(fā)育

隔離20 d的圓唇散白蟻工蟻與原巢工蟻的卵母細胞和濾泡細胞發(fā)育水平?jīng)]有顯著性差異，它們的卵母細胞仍是在生長期，卵母細胞長徑?jīng)]有顯著增加(P>0.05)，濾泡細胞層比較薄(約1.20 μm)(圖3: A, B)。隔離工蟻轉化為pre-NRs之后，pre-NRs的卵母細胞和濾泡細胞層的發(fā)育水平仍然沒有顯著改變，卵母細胞停滯在生長期，卵母細胞長徑和濾泡細胞層厚度也沒有顯著增加(P>0.05)(圖3: C)。Pre-NRs蛻皮轉化成NRs之后，卵母細胞雖然還處于生長期，但是卵母細胞長徑和濾泡細胞層厚度顯著增加(P<0.05)，濾泡細胞為柱狀形；NRs卵母細胞長徑和濾泡細胞層厚度分別是Pre-NRs的約2倍和3倍(圖3: D)。雖然末齡若蟻的卵母細胞也發(fā)育至生長期，濾泡細胞層厚度與NRs相比沒有顯著性差異(P>0.05)，但是其卵母細胞長徑是NRs的約2倍，剛轉化的NRs卵母細胞發(fā)育程度低于末齡若蟻(圖3: F)。隨著NRs卵母細胞進入卵黃期，由于卵黃的積累，卵母細胞迅速增大，膨腹NRs卵母細胞長徑是剛變NRs的約5倍(圖3: E; 圖4)。

圖3 圓唇散白蟻雌性工蟻向補充生殖蟻轉化的卵母細胞發(fā)育Fig. 3 Oocyte development during the differentiation of female workers into neotenic reproductives of Reticulitermes labralisA: 在原巢工蟻中，卵母細胞被一層薄的濾泡細胞層包圍In the workers in the parental nest, the oocytes were surrounded by a thin layer of follicle cells; B: 在隔離 20 d工蟻中，卵母細胞被一層薄的濾泡細胞層包圍In the workers isolated for 20 d, the oocytes were surrounded by a thin layer of follicle cells; C: 在前補充生殖蟻中，卵母細胞被一層薄的濾泡細胞層包圍In the pre-neotenic reproductives, the oocytes were surrounded by a thin layer of follicle cells; D: 在補充生殖蟻中，卵母細胞被一層厚的濾泡細胞層包圍In the neotenic reproductives, the oocytes were surrounded by a thicker layer of follicle cells; E: 在膨腹補充生殖蟻中，卵黃發(fā)生末期的卵母細胞被一層薄的濾泡細胞層包圍 In the physogastric neotenic reproductives, the oocytes during late vitellogenesis were surrounded by a thin layer of follicle cells; F: 末齡若蟻的卵母細胞被一層厚的濾泡細胞層包圍 In the last instar nymphs, each oocyte was surrounded by a thicker layer of follicle cells. FC: 濾泡細胞層 Layer of follicle cells; Oo: 卵母細胞 Oocytes; YC: 卵黃Yolk.

圖4 圓唇散白蟻雌性工蟻向補充生殖蟻轉化的卵母細胞大小(A)和濾泡細胞層厚度(B)變化Fig. 4 Changes in the size of oocytes (A) and the thickness of the layer of follicle cells (B) during the differentiationof female workers into neotenic reproductives of Reticulitermes labralis圖數(shù)據(jù)為平均值±標準差；柱上不同字母表示有顯著性差異(P<0.05, Tukey HSD檢驗)。Data in the figure are represented as mean±SD, and different letters above bars indicate significant differences (P<0.05, Tukey HSD test). W: 工蟻 Workers; IW: 隔離工蟻Isolated workers; pre-NR: 前補充生殖蟻Pre-neotenic reproductives; NR: 補充生殖蟻Neotenic reproductives; phy-NR: 膨腹補充生殖蟻Physogastric neotenic reproductives; Ny: 末齡若蟻Last instar nymphs.

2.4 調(diào)控卵母細胞生長期發(fā)育的相關基因

在我們的圓唇散白蟻雌性末齡若蟻向擬成蟲型補充生殖蟻、翅芽型補充生殖蟻和有翅成蟲轉化的轉錄組數(shù)據(jù)庫中(Suetal., 2016)，根據(jù)末齡若蟻與這3種類型的生殖蟻的基因差異表達分析和卵母細胞發(fā)育調(diào)控通路篩選出與卵母細胞生長期發(fā)育相關的6個基因表達，它們是celldivisioncycleprotein20(Unigene0019375),cyclin-dependentkinase1(Unigene0020991),G2/mitotic-specificcyclin-B3(Unigene0014235),G2/mitotic-specificcyclin-A(Unigene0004987),aurorakinaseA(Unigene0007871)和serine/threonine-proteinkinasepolo(Unigene0000840)。AurorakinaseA(Unigene0007871)的序列與內(nèi)華達古白蟻Zootermopsisnevadensis的相近，其余5個基因序列與堆砂白蟻Cryptotermessecundus的相近。這6個基因在雌性末齡若蟻的表達水平顯著高于擬成蟲型補充生殖蟻、翅芽型補充生殖蟻和有翅成蟲(原始生殖蟻)的。末齡若蟻的卵母細胞處于生長期(即卵子發(fā)生的第2階段), 末齡若蟻經(jīng)過1次蛻皮分化為擬成蟲型補充生殖蟻、翅芽型補充生殖蟻和有翅成蟲之后,卵母細胞進入卵黃形成期(即卵子發(fā)生的第3階段)。轉錄組數(shù)據(jù)顯示這6個基因在末齡若蟻中高表達，而在3種類型的生殖蟻中相對表達水平比較低(圖5)，表明這些基因與卵母細胞生長期的發(fā)育有關。

圖5 圓唇散白蟻6個與卵母細胞生長期發(fā)育相關的基因在末齡若蟻和生殖蟻中的差異表達熱圖Fig. 5 Heat map of the differential expression of six genesinvolved in oocyte development at the growth stage ofthe last instar nymphs and reproductives ofReticulitermes labralisLN: 末齡若蟻Last instar nymphs; AN: 擬成蟲型補充生殖蟻Adultoid neotenic reproductives; BN: 翅芽型補充生殖蟻Brachypterous neotenic reproductives; AR: 有翅生殖蟻Alate reproductives.

2.5 與卵母細胞生長期發(fā)育相關基因在工蟻向補充生殖蟻轉化過程中的表達

qRT-PCR的測定數(shù)據(jù)顯示圓唇散白蟻工蟻經(jīng)過pre-NRs轉化為NRs之后，調(diào)控卵母細胞生長期發(fā)育的6個基因在NRs中的表達水平大幅度增加;雖然有3個基因表達水平在pre-NRs中顯著高于在工蟻中的,但是增加幅度比較小。工蟻轉化為pre-NRs之后，celldivisioncycleprotein20,cyclin-dependentkinase1和serine/threonine-proteinkinasepolo表達水平?jīng)]有顯著性增加；pre-NRs轉化為NRs之后，表達水平顯著性增加并且增加幅度很大，這3個基因在NRs的表達水平分別是pre-NRs中的約62, 34和106倍。G2/mitotic-specificcyclin-B3,G2/mitotic-specificcyclin-A和aurorakinaseA這3個基因在pre-NRs表達水平顯著高于工蟻中的，分別是工蟻的約3, 3和2倍，增加幅度比較?。晦D化為NRs之后，這3個基因表達水平增加幅度很大，在NRs的表達水平分別是pre-NRs中的91, 36和57倍(圖6)。

圖6 qRT-PCR分析圓唇散白蟻卵母細胞生長期發(fā)育相關基因在工蟻、前補充生殖蟻和補充生殖蟻中的相對表達水平Fig. 6 Relative expression levels of genes involved in oocyte development at the growth stage in workers,pre-neotenic reproductives and neotenic reproductives of Reticulitermes labralis detected by qRT-PCRA: cell division cycle protein 20; B: cyclin-dependent kinase 1; C: G2/mitotic-specific cyclin-B3; D: G2/mitotic-specific cyclin-A; E: aurora kinase A; F: serine/threonine-protein kinase polo. 圖中數(shù)據(jù)為平均值±標準差；柱上不同字母表示有顯著性差異(P<0.05, TukeyHSD檢驗)。Data in the figure are represented as mean±SD, and different letters above bars indicate significant differences (P<0.05, Tukey HSD test). W: 工蟻Workers; pre-NR: 前補充生殖蟻Pre-neotenic reproductives; NR: 補充生殖蟻Neotenic reproductives.

3 討論

我們研究發(fā)現(xiàn)工蟻從低齡到老齡的發(fā)育過程中卵巢沒有停止生長，但是最終工蟻卵巢發(fā)育程度低于末齡若蟻，表明雌性工蟻性腺發(fā)育的停滯發(fā)生在老齡期。研究認為蟻后和蟻王利用信息素傳遞它們的生殖地位從而阻止工蟻性腺發(fā)育，只有蟻后和蟻王死亡或繁育能力不足的時候，工蟻才會轉化成補充生殖蟻開始具備生殖能力(Korb, 2018)。蜜蜂工蜂發(fā)育的初期具有正常的卵巢，但在以后的發(fā)育中卵巢細胞程序化死亡，導致卵巢管數(shù)量從150～200條減少至幾條，而且本質(zhì)上是不育的。蜂后信息素抑制了工蜂卵巢發(fā)育，當缺乏蜂后抑制時，工蜂卵巢發(fā)育被激活(Capella and Hartfelder, 1998; Van Eeckhoven and Duncan, 2020)。山林原白蟻Hodotermopsissjostedi雄性補充生殖蟻的存在會加速雌性工蟻向補充生殖蟻轉化(Oguchietal., 2020)。然而散白蟻的生殖策略比較復雜, 在棲北散白蟻R.speratus野外巢群中雌性補充生殖蟻的數(shù)量多于雄性補充生殖蟻，可能與雄性工蟻參與生殖有關(Fujita and Watanabe, 2010)。我們已有的研究也表明雖然圓唇散白蟻R.labralis雄性老齡工蟻精巢的直徑顯著小于生殖蟻精巢直徑, 然而工蟻能夠產(chǎn)生正常的精子(Suetal., 2015)；雄性工蟻能夠與雌性生殖交配并且提供正常的精子，表明雄性工蟻和雌性工蟻在生殖途徑和生殖能力方面是不同的(Suetal., 2017)。雌性兵蟻個體終生不能生殖是雌性工蟻個體轉化為兵蟻之后失去生殖可塑性的顯著表現(xiàn)，經(jīng)歷2次蛻皮轉變成兵蟻之后卵巢極度退化，這種退化是不可逆的。本研究發(fā)現(xiàn)剛轉化的補充生殖蟻卵巢長度是工蟻卵巢長度的近3倍(圖2)，表明雌性工蟻生殖能力的恢復需要經(jīng)歷復雜的過程和調(diào)控。

卵母細胞發(fā)育恢復是生殖能力恢復的標志，我們的研究發(fā)現(xiàn)只有工蟻轉化成補充生殖蟻之后，卵母細胞才能恢復發(fā)育，并且卵母細胞發(fā)育啟動受濾泡細胞支持和調(diào)控。散白蟻生殖蟻卵巢管內(nèi)卵子發(fā)生分為3個時期：卵母細胞分化期、卵母細胞生長期和卵母細胞卵黃形成期(朱蓉等, 2009)。雖然圓唇散白蟻工蟻和若蟻一樣都發(fā)育到了卵母細胞生長期，但是若蟻卵母細胞直徑是工蟻的約6倍，工蟻卵母細胞發(fā)育明顯被抑制(圖4: A)，這種抑制與包圍卵母細胞的濾泡細胞退化有關。當工蟻轉化成補充生殖蟻之后，濾泡細胞層厚度會增加，卵母細胞變大。通常昆蟲的卵母細胞移入生長區(qū)之后大量吸收營養(yǎng)物質(zhì)，體積迅速增大；果蠅卵母細胞在生長期體積急劇增大是由于從滋養(yǎng)細胞獲得了細胞質(zhì)成分(Kolahietal., 2009)。果蠅卵子發(fā)生過程中濾泡細胞的屏障功能可以被重塑，濾泡細胞的形態(tài)和生理發(fā)生動態(tài)變化；在卵黃發(fā)生期濾泡細胞旁通透性發(fā)生改變，打開濾泡細胞旁通道讓卵黃蛋白通過(Duhartetal., 2017; Isasti-Sanchezetal., 2021)。散白蟻卵母細胞被卵泡細胞所包圍(無滋養(yǎng)細胞)，其發(fā)育依賴濾泡細胞支持，顯然工蟻卵母細胞發(fā)育的停滯和恢復受濾泡細胞調(diào)控。我們的研究表明濾泡細胞發(fā)育啟動是非生殖品級向生殖品級轉化生殖力開始恢復的主要標志。

工蟻隔離前和隔離后，卵巢長度和卵母細胞發(fā)育水平?jīng)]有顯著性變化，表明隔離工蟻必須經(jīng)過蛻皮完成品級形態(tài)的轉化才能恢復生殖能力。白蟻品級的轉化是通過環(huán)境中的信息素改變個體內(nèi)激素水平最終誘導基因表達來實現(xiàn)的；保幼激素以及保幼激素通路在低等白蟻品級非遺傳多型性分化中起關鍵調(diào)控作用(Korb, 2015; Jongepieretal., 2018)；用保幼激素類似物可以抑制雌性工蟻向生殖蟻分化，低水平保幼激素可以促進雌性工蟻向補充生殖蟻分化(Oguchietal., 2020)。近年還發(fā)現(xiàn)失去蟻后信息素抑制，工蟻的磷脂酰肌醇信號通路、鈣信號通路、Ras信號通路、I3K-Akt 信號通路等信號通路相關基因顯著上調(diào)，可能參與調(diào)控雌性工蟻向補充生殖蟻轉化的信號傳導(Yeetal., 2019)。我們的研究證實去掉蟻后抑制,工蟻的卵巢和卵母細胞并不能恢復發(fā)育，而是啟動了向補充生殖蟻轉化的調(diào)控通路。

我們對圓唇散白蟻末齡若蟻和末齡若蟻轉化的3種類型生殖蟻的比較轉錄組進行了分析，發(fā)現(xiàn)了6個與卵母細胞第一次減數(shù)分裂前期相關的基因在末齡若蟻中表達水平顯著高于剛轉化的生殖蟻中的(圖5和6)，這可能是由于末齡若蟻生長期的卵母細胞正在啟動和進行減數(shù)分裂的過程，而轉化初期的生殖蟻卵母細胞準備進入卵黃積累階段(卵子發(fā)生的最后階段)。已有的研究表明cell division cycle 20(CDC20) 作為細胞分裂周期蛋白可以激活后期促進復合物/環(huán)小體(anaphase-promoting complex/cyclosome, APC/C)，觸發(fā)細胞分裂中期到后期的轉變，啟動姐妹染色單體分離(Jinetal., 2010; Lara-Gonzalezetal., 2019)。cyclin-dependent kinase 1作為細胞周期蛋白依賴激酶直接參與細胞周期調(diào)控,激發(fā)細胞周期各期的順利進行(Shi and Feng, 2021)；細胞周期蛋白 Cyclin 是調(diào)控真核生物細胞周期有絲分裂及減數(shù)分裂過程的一個十分重要的蛋白家族，G2/mitotic-specific cyclin-B3(Cyclin-B3) 是有絲分裂染色體分離啟動的一個關鍵的調(diào)控因子(Garridoetal., 2020)；G2/mitotic-specific cyclin-A(Cyclin -A)在DNA復制啟動中起作用，也是DNA復制過程中核小體組裝所必需的；在果蠅卵巢中調(diào)控生殖干細胞的發(fā)育和分化(Seimetal., 2003; Liuetal., 2017)。aurora kinase A對細胞中心體的成熟、紡錘體組裝和染色體凝集過程有調(diào)節(jié)作用，是有絲分裂中必需的激酶，在動物卵母細胞成熟和激活過程中起著關鍵性的作用(Doyleetal., 2014; Nguyen and Schindler, 2017)；serine/threonine-protein kinase polo (polo kinase)為polo激酶，與減數(shù)分裂恢復過程中的協(xié)調(diào)事件有關，對紡錘體形成有著重要的作用；敲除小鼠polo基因?qū)е聹p數(shù)分裂在同源染色體分離之前停止，導致小鼠不能生育(Little and Jordan, 2020)。我們認為這些與末齡若蟻卵母細胞生長期發(fā)育相關的基因表達也可能與工蟻個體卵母細胞發(fā)育的抑制和啟動有關系。

我們研究發(fā)現(xiàn)這6個基因在工蟻和前補充生殖蟻的表達水平較低，而當轉化為補充生殖蟻之后全部高表達，表明卵母細胞發(fā)育的恢復和減數(shù)分裂啟動從補充生殖蟻開始；而在末齡若蟻向生殖蟻轉化的過程中，卵母細胞減數(shù)分裂啟動從末齡若蟻開始。當卵母細胞進入生長期時，細胞核正處于第1次減數(shù)分裂的前期，卵母細胞合成和積累大量物質(zhì)并進行DNA復制，這個時期對卵母細胞的成熟、受精和胚胎發(fā)育具有非常重要的意義。celldivisioncycle20表達水平低的雌性小鼠沒有或很少生育后代，主要是由于卵母細胞減數(shù)分裂Ⅰ期染色體分離滯后和染色體錯配所致(Jinetal., 2010)；celldivisioncycle20在調(diào)節(jié)果蠅卵母細胞減數(shù)分裂中也很重要，突變可導致細胞有絲分裂中期和后期缺陷(Chuetal., 2001)。cyclin-dependentkinase1可以調(diào)控減數(shù)分裂的恢復和進程(Santamariaetal., 2007; Lietal., 2019)；cyclin-B3作為一種有絲分裂周期蛋白在卵母細胞的減數(shù)分裂成熟過程中起作用;敲除cyclinB3基因的小鼠不育，用青蛙、斑馬魚和果蠅的cyclin B3可以使cyclin B3缺陷小鼠卵母細胞的減數(shù)分裂恢復(Guanetal., 2019; Karasuetal., 2019)；G2/mitotic-specificcyclin-A在日本沼蝦Macrobrachiumnipponense卵巢不同發(fā)育階段的表達水平與卵巢成熟程度呈正相關，與卵原細胞的增殖和卵母細胞的形成有關(Zhouetal., 2021)；aurorakinaseA在有絲分裂由G2進入M期形成紡錘體后表達水平增高達到峰值，在動物卵母細胞成熟和激活過程中起著關鍵性的作用(Dutertreetal., 2002)；serine/threonine-proteinkinasepolo在G2期和M期表達水平較高，表達水平低時會導致卵母細胞減數(shù)分裂的阻滯(Little and Jordan, 2020)。工蟻轉化的補充生殖蟻與若蟻轉化的補充生殖蟻不僅外部形態(tài)有顯著差異，而且卵母細胞發(fā)育水平不同，若蟻轉化的補充生殖蟻可以直接進入卵子發(fā)生的最后一個階段即卵黃形成期，而工蟻轉化的補充生殖蟻卵子發(fā)生將恢復第二階段的發(fā)育即卵母細胞生長期。因此，可以推測若蟻轉化的補充生殖蟻比工蟻轉化的補充生殖蟻產(chǎn)卵要早。雖然Cyclin-B3,Cyclin-A和aurorakinaseA在前補充生殖蟻的表達水平顯著高于工蟻中的，但是表達水平的增高程度與補充生殖蟻中的相比還很低；另外，工蟻蛻皮轉化成前補充生殖蟻之后，卵母細胞和濾泡細胞形態(tài)結構沒有顯著改變。因此，這6個基因在工蟻、前補充生殖蟻和補充生殖蟻表達水平比較明確了雌性工蟻向補充生殖蟻轉化過程中卵母細胞發(fā)育的恢復是從轉化為補充生殖蟻開始的。