曹小漢， 鄧賢會(huì)， 毛惠敏， 殷丹丹， 閆 歡， 萬文陽， 任莉萍

(阜陽師范大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 阜陽 236037)

荷花(Nelumbonucifera)為蓮科蓮屬多年生挺水植物,是我國(guó)十大傳統(tǒng)名花中唯一的水生花卉。荷花在我國(guó)有3 000多年的栽培歷史,具有很高的觀賞價(jià)值、藥用價(jià)值及文化價(jià)值[1-3]。荷花喜靜水,多分布于淡水湖泊集中分布的地區(qū),耐鹽能力差[4];喜溫,不耐寒,栽植季節(jié)的氣溫在18 ℃以上[5];喜光,極不耐蔭,弱光下生長(zhǎng)緩慢開花遲[6]。

轉(zhuǎn)錄因子通過激活或抑制下游靶基因的表達(dá),在生物的生長(zhǎng)發(fā)育、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。SBP(SQUAMOSA promoter binding protein)轉(zhuǎn)錄因子為植物所特有,又被稱為SPL(SQUAMOSA promoter binding protein llike)蛋白,該家族具有高度保守的SBP結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域由74個(gè)氨基酸構(gòu)成,保守結(jié)構(gòu)域包含3個(gè)特征性結(jié)構(gòu),其中有2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),還有1個(gè)核定位信號(hào)結(jié)構(gòu)[7-8]。研究表明,SBP轉(zhuǎn)錄因子參與葉片發(fā)育、花的形成、發(fā)育階段轉(zhuǎn)變、果實(shí)成熟、植物育性以及激素、光周期、生物和非生物等各種脅迫響應(yīng)[9]。水稻共有19個(gè)SBP基因,OsSPL16調(diào)控水稻谷粒的形狀、大小和品質(zhì)[10],OsSPL14在營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)階段通過與miR156相互作用調(diào)控水稻分蘗[11]。柑橘CclSBP7促進(jìn)開花且參與開花過程[12];菠蘿中SBP基因家族響應(yīng)冷、熱、鹽和干旱等非生物脅迫[13]。

自SBP蛋白首次在金魚草中發(fā)現(xiàn)后[14],SBP轉(zhuǎn)錄因子家族已經(jīng)先后在擬南芥[15]、水稻[16]、小麥[17]、大麥[18]、谷子[19]、狼尾草[20]、茶樹[21]、楊樹[8]、黑胡椒[7]等多個(gè)物種中進(jìn)行了全基因組水平的鑒定和分析,而荷花SBP基因家族的研究尚未見報(bào)道。本研究在全基因組水平上利用生物信息學(xué)手段對(duì)荷花SBP基因家族進(jìn)行鑒定、基本理化性質(zhì)分析、保守結(jié)構(gòu)域分析、系統(tǒng)進(jìn)化分析、染色體定位分析、順式作用元件分析及組織表達(dá)模式分析,為闡明荷花SBP基因家族成員在調(diào)控生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫應(yīng)答等方面的生物學(xué)功能提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

荷花SBP蛋白序列來源于荷花基因組數(shù)據(jù)庫the Nelumbo Genome Database;擬南芥SBP蛋白序列來源于數(shù)據(jù)庫TAIR。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

從Pfam數(shù)據(jù)庫下載SBP保守結(jié)構(gòu)域的HMM-Hidden Markov Model文件PF03110,采用HMMER 3.0軟件鑒定SBP蛋白。利用SMART預(yù)測(cè)荷花SBP蛋白的保守結(jié)構(gòu)域;利用DNAMAN軟件篩除重復(fù)序列,最終獲得荷花所有的SBP基因家族成員。

利用Expasy計(jì)算蛋白質(zhì)分子量和理論等電點(diǎn)、不穩(wěn)定性指數(shù)、親水性總平均值。利用在線網(wǎng)站Softberry對(duì)荷花SBP蛋白進(jìn)行亞細(xì)胞定位。

使用Clustal X軟件對(duì)荷花SBP蛋白進(jìn)行多序列比對(duì),并將結(jié)果提交GeneDoc 2.7進(jìn)行優(yōu)化;利用TBtools對(duì)SBP基因家族的基因結(jié)構(gòu)進(jìn)行可視化;利用MEME分析荷花SBP保守基序;利用MEGA 7.0軟件(鄰接法,Bootstrap設(shè)為1 000次)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹;利用Plant CARE在線數(shù)據(jù)庫鑒定啟動(dòng)子區(qū)的順式作用元件。從荷花基因組數(shù)據(jù)庫獲取轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù),生成10組荷花不同發(fā)育階段的組織特異性表達(dá)數(shù)值;對(duì)同一組織的多個(gè)樣品數(shù)據(jù)取均值后采用log2(FPKM+1)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行轉(zhuǎn)換,用TBtools軟件創(chuàng)建熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 荷花NnSBP基因家族的鑒定及理化性質(zhì)分析

基于荷花基因組數(shù)據(jù)庫,最終鑒定出20個(gè)荷花SBP基因,分別命名為NnSBP1～NnSBP20(表1)。理化性質(zhì)分析表明,SBP蛋白長(zhǎng)度為189～1 085 aa;對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量為21 404.02～120 066.40 Da,平均值為65 734.98 Da;SBP蛋白的等電點(diǎn)為5.81～9.38,均值為8.14,表明家族中80%的SBP蛋白呈弱堿性(表1)。總平均疏水性為-1.165～-0.322,該家族成員均為親水性蛋白。不穩(wěn)定指數(shù)在45.94～80.69之間,說明該家族成員均為不穩(wěn)定蛋白(Instability Index>40)。經(jīng)亞細(xì)胞定位預(yù)測(cè),16個(gè)荷花SBP蛋白定位于細(xì)胞核,另外4個(gè)蛋白定位在細(xì)胞外。

表1 荷花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族基因基本信息

2.2 荷花SBP基因家族的進(jìn)化分析

為了解荷花SBP蛋白與擬南芥SBP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系,首先將荷花SBP蛋白序列和擬南芥SBP蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì),然后利用MEGA 7.0對(duì)構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。根據(jù)進(jìn)化樹亞組的分類標(biāo)準(zhǔn),若進(jìn)化樹中成員位于同一聚類分支,則被認(rèn)為具有較近的親緣關(guān)系,即視為同一個(gè)亞組。結(jié)果表明,20個(gè)荷花SBP蛋白共分為8個(gè)亞組。Group 6亞族成員個(gè)數(shù)最多,有8個(gè)成員,包括4個(gè)荷花SBP蛋白和4個(gè)擬南芥SBP蛋白;其次是Group 1亞族,包括4個(gè)荷花SBP蛋白和2個(gè)擬南芥SBP蛋白;Group 4亞族和Group 5亞族各包括4各成員;Group 2亞族、Group 3亞族和Group 8亞族各包括3個(gè)成員(圖1)。

圖1 荷花SBP蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

2.3 荷花SBP轉(zhuǎn)錄因子家族的蛋白質(zhì)保守基序分析

通過對(duì)荷花SBP蛋白進(jìn)行多序列比對(duì),利用GeneDoc對(duì)比對(duì)結(jié)果進(jìn)行作圖,結(jié)果表明所有荷花SBP蛋白序列均包含3個(gè)保守結(jié)構(gòu)域,2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu)和1個(gè)核定位信號(hào)(圖2)。利用MEME在線分析20個(gè)荷花SBP蛋白序列,共鑒定出10種不同的保守基序(圖3)。參照系統(tǒng)進(jìn)化樹分類,不同分支的SBP蛋白含有Motif的數(shù)目和種類差異較大(圖3 B):Group 6成員中NnSBP3和NnSBP4僅包含3種基序;Group 1、Group 2、Group 7和Group 6(NnSBP1和NnSBP17)包含4種基序;Group 3含有5種保守基序;Group 8含有7種保守基序;Group 4和Group 5含有10種保守基序。

2.4 荷花SBP基因家族在染色體上的分布

從基因組數(shù)據(jù)庫下載荷花SBP基因染色體定位信息,繪制染色體定位分布圖。結(jié)果表明,荷花SBP基因在染色體上的分布不均勻,20個(gè)基因分布于8條染色體上,染色體3上分布5個(gè)基因,分布最多;染色體1和4,分布4個(gè)基因;染色體6分布3個(gè)基因,染色體2、5、7、8均各分布1個(gè)基因。

圖2 荷花SBP蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析

圖3 荷花SBP轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進(jìn)化及保守基序分析

圖4 荷花SBP基因的染色體定位

2.5 荷花SBP基因的順式作用元件分析

啟動(dòng)子序列分析表明,荷花SBP基因家族啟動(dòng)子元件共分為5個(gè)類型,分別為光響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、分生組織表達(dá)元件、相關(guān)激素響應(yīng)元件、脅迫響應(yīng)元件(表2)。激素響應(yīng)元件種類較多,包括赤霉素響應(yīng)元件、茉莉酸甲酯響應(yīng)元件、脫落酸響應(yīng)元件、生長(zhǎng)素響應(yīng)元件和水楊酸響應(yīng)元件,說明它們可能通過響應(yīng)不同的激素信號(hào),在荷花生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中起不同的調(diào)控作用。

表2 荷花SBP基因順式作用元件分析

2.6 荷花SBP基因家族的表達(dá)分析

為了進(jìn)一步分析荷花SBP基因在發(fā)育過程中的作用,對(duì)荷花SBP基因在不同組織(種皮、子葉、根莖、節(jié)間、葉柄、成熟花托、花瓣、授粉心皮、成熟雄蕊)的表達(dá)情況進(jìn)行聚類分析(圖5)。根據(jù)圖5可以將荷花SBP基因在不同組織中的表達(dá)情況大致分為四類:第一類基因(NnSBP4、NnSBP7、NnSBP10、NnSBP13、NnSBP16)在每種組織中都表現(xiàn)為較高表達(dá)水平;第二類基因(NnSBP2、NnSBP6、NnSBP12、NnSBP15、NnSBP18、NnSBP19、NnSBP20)在各類組織中都表現(xiàn)為較低表達(dá)水平;第三類基因(NnSBP9、NnSBP11、NnSBP14)在多種組織中都表現(xiàn)為較高表達(dá)水平;第四類基因(NnSBP1、NnSBP3、NnSBP5、NnSBP8、NnSBP17)僅在少數(shù)組織中表現(xiàn)為較高表達(dá)水平。有趣的現(xiàn)象是,除了NnSBP2外的所有NnSBPs在成熟花托和授粉心皮中均表現(xiàn)為較高表達(dá)水平。

圖5 荷花SBP基因在不同組織中表達(dá)分析

3 結(jié)論與討論

植物SBP轉(zhuǎn)錄因子不僅參與植物成花途徑、生長(zhǎng)發(fā)育的的調(diào)控[22],還在植物響應(yīng)非生物脅迫方面發(fā)揮著重要作用,包括過量的銅離子脅迫、鹽脅迫、溫度和干旱脅迫[23-24],另外,還對(duì)花青素的生物合成產(chǎn)生負(fù)調(diào)控作用[25-26]。因此,在全基因組水平上對(duì)荷花SBP基因家族進(jìn)行生物信息學(xué)及表達(dá)模式分析,為深入探討SBP基因家族成員在荷花生長(zhǎng)發(fā)育及脅迫響應(yīng)的調(diào)控功能研究中提供理論基礎(chǔ)。

目前,許多重要植物已經(jīng)開展了SBP基因家族的研究,擬南芥、水稻和番茄的SBP轉(zhuǎn)錄因子家族成員較少,不到20個(gè),而茶樹、獼猴桃等成員則較多,多于20個(gè)[27]。本研究在全基因水平上共鑒定出20個(gè)荷花SBP基因。荷花SBP蛋白的等電點(diǎn)介于5.81～9.38之間,表明大部分NnSBP蛋白富含堿性氨基酸,可能會(huì)在酸性亞細(xì)胞環(huán)境發(fā)揮作用,這與杜仲[27]、黃瓜[28]、大麥[18]的SBP成員蛋白性質(zhì)基本一致。所有荷花NnSBP蛋白均含有的2個(gè)鋅指結(jié)構(gòu),推測(cè)其能特異識(shí)別SQUAMOSA (SQ-UA)啟動(dòng)子,而位于C端的核定位信號(hào)區(qū)域則能夠指導(dǎo)蛋白進(jìn)入細(xì)胞核行使功能。從系統(tǒng)發(fā)育分析中可知,荷花和擬南芥的SBP成員可以分為8個(gè)類,相同類型的基因具有相似的基因結(jié)構(gòu)和基序。通過順式作用元件分析發(fā)現(xiàn),除了光響應(yīng)元件、分生組織表達(dá)元件外還包括多個(gè)激素響應(yīng)元件和脅迫響應(yīng)元件,說明它們可能通過響應(yīng)不同的激素信號(hào),在植物生長(zhǎng)發(fā)育和脅迫響應(yīng)中具有重要的調(diào)控作用,這與谷子[19]、茶樹[29]預(yù)測(cè)結(jié)果一致。