王 成,趙 剛,孔亞林,蒲 猛,戴競耀,劉承利△

空軍特色醫(yī)學(xué)中心：1.肝膽外科；2.外科學(xué)教研室，北京 100142

隨著生物科技的發(fā)展，以聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為主的核酸試驗(yàn)應(yīng)用越來越廣泛[1]，實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制和生物安全是PCR技術(shù)初學(xué)者應(yīng)掌握的重要內(nèi)容[2]。不論是中學(xué)、大學(xué)實(shí)驗(yàn)課的學(xué)生還是實(shí)驗(yàn)技術(shù)方面的初學(xué)者對避免核酸污染等質(zhì)量控制的意識(shí)均不強(qiáng)。由于PCR耗時(shí)較長,注意力不易集中[3]，容易受核酸污染，必須設(shè)計(jì)空白對照才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)假陽性結(jié)果[4]，但枯燥的理論講解學(xué)生不易接受，教學(xué)效果不好。以問題為基礎(chǔ)(PBL)教學(xué)法是一種基于“問題”為中心的教學(xué)模式，是目前國際上較為流行的一種教學(xué)法。案例選擇和問題設(shè)計(jì)是PBL教學(xué)法的主要切入點(diǎn)，對初學(xué)者理解抽象問題非常有幫助。本文圍繞在一次PCR教學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)空白對照管中有核酸污染的實(shí)例，遂把PBL教學(xué)法應(yīng)用于枯燥的對照重復(fù)試驗(yàn)，理清了發(fā)現(xiàn)和判定核酸污染來源的過程，學(xué)生們反映教學(xué)效果很好，理解較為深刻。

1 資料與方法

1.1 學(xué)生情況及試驗(yàn)事件 小班教學(xué)，學(xué)生5人，教學(xué)過程發(fā)現(xiàn)空白對照管有核酸擴(kuò)增，于是采用PBL教學(xué)法[5]，以實(shí)例為引導(dǎo)，設(shè)計(jì)教學(xué)試驗(yàn)，結(jié)合實(shí)際圖表，啟發(fā)學(xué)生分層思維，最終引導(dǎo)學(xué)生們找到污染源。

1.2 一般資料 組織來源為6份液氮凍存的SD大鼠肝臟組織。大鼠來源的Yes 相關(guān)蛋白(YAP)引物兩種，分別由美國Invitrogen和中國上海生工公司設(shè)計(jì)合成，均具有較好的特異性。

1.3 儀器與試劑 熒光定量PCR儀為Roche Light Cycle (2.0)系統(tǒng)，軟件版本3.5。采用Trizol 總RNA試劑提取總RNA，取材器械、凍存管及雙蒸水(ddH2O)均經(jīng)1%二乙基焦碳酸酯水處理。反轉(zhuǎn)錄試劑盒(DRR03S)及熒光定量PCR試劑盒(DRR041S)均購自TaKaRa寶生物工程大連有限公司。

1.4 方法 PBL教學(xué)法采用案例選擇、問題設(shè)計(jì)、思維導(dǎo)圖、情景教學(xué)等，以實(shí)例為線索，以學(xué)生為主導(dǎo)。

1.5 試驗(yàn)技術(shù)方法 RNA 提取應(yīng)用Trizol、氯仿、異丙醇提取，75%乙醇洗滌RNA沉淀。應(yīng)用凝膠電泳法(瓊脂糖)鑒定RNA未被降解，以紫外分光光度計(jì)對RNA樣品進(jìn)行純度分析和定量。反轉(zhuǎn)錄合成cDNA按試劑盒配制反應(yīng)體系。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用Light Cycler 數(shù)據(jù)分析軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析處理。直觀比較Ct值[6]，Ct值越大，起始模板數(shù)越低。

2 結(jié) 果

2.1 以實(shí)例為引導(dǎo)，使學(xué)生直觀認(rèn)識(shí)什么是核酸污染 PCR擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)束后發(fā)現(xiàn)“空白對照管”的反應(yīng)曲線清晰可見，說明該反應(yīng)體系內(nèi)有核酸擴(kuò)增，可推斷空白對照管反應(yīng)體系內(nèi)存在核酸污染。通過反應(yīng)曲線圖學(xué)生們對“假陽性”有了直觀認(rèn)識(shí)。

2.2 問題出在哪里？引導(dǎo)學(xué)生自問自答 空白對照管中含有3種成分：ddH2O、引物及PCR試劑，其中ddH2O的配制、分裝、加樣過程操作較多，比較容易污染，而且ddH2O較引物和PCR試劑更容易獲取，應(yīng)作為首先排除對象。

2.3 與學(xué)生一道設(shè)計(jì)驗(yàn)證試驗(yàn) 選用新的ddH2O作為對照，重復(fù)試驗(yàn)，同時(shí)原ddH2O同步參與重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)反應(yīng)條件不變，引物不變，挑選擴(kuò)增曲線較好的7號(hào)樣品作為cDNA模板，觀察在含新ddH2O的反應(yīng)體系中是否有核酸擴(kuò)增，結(jié)果見表1。通過比較PCR結(jié)束后的Ct值可比較反應(yīng)體系的起始模板核酸量，Ct值越大，核酸量越小。

表1 重復(fù)試驗(yàn)1

2.4 ddH2O污染的可能性很小 學(xué)生們一致認(rèn)為，B管和D管均無模板，但均有核酸擴(kuò)增，Ct值差別不大(即起始模板數(shù)差別不大)，所以2個(gè)反應(yīng)體系均有核酸污染，且污染程度相近。因B、D這2管分別為不同的ddH2O，2次配制的ddH2O均有污染的可能性較小。特別是B、D這2管的Ct值相近，污染程度相同，故暫不考慮污染源是ddH2O。另外，學(xué)生們認(rèn)為，A管和C管有相等數(shù)量模板，ddH2O不同，因Ct值差別不大，說明起始模板數(shù)差別不大，同樣說明2次配制的ddH2O無明顯差別。因此，前、后2次ddH2O均被污染的可能性均很小，綜合分析后考慮為ddH2O以外的試劑有污染。

2.5 教員思維引導(dǎo)，學(xué)生制訂方案 教員提示：試驗(yàn)所用引物一般來自2家公司，每次所用引物是經(jīng)過分裝的。學(xué)生們思考后認(rèn)為，分裝引物過程存在污染的可能，如需驗(yàn)證引物污染，可以選取未開封、未分裝的原引物。另外，可選用另一家公司的引物同時(shí)做對照，發(fā)現(xiàn)原引物出廠時(shí)已被污染。進(jìn)一步重復(fù)試驗(yàn)，試驗(yàn)條件不變，目的是驗(yàn)證原分裝引物中是否有核酸污染。見表2。 Ct值很大說明起始模板的核酸量很小，Ct值為0.00，說明反應(yīng)體系內(nèi)不含核酸模板。

表2 重復(fù)試驗(yàn)2

2.6 引物1(首次試驗(yàn)分裝后的引物)為污染源 學(xué)生們逐條分析：H管含標(biāo)準(zhǔn)模板，擴(kuò)增同前，提示引物2可用。F管、G管無擴(kuò)增，說明ddH2O、PCR試劑、引物1′(新開封的引物1原裝液)及引物2(另一家引物公司設(shè)計(jì)及制備的引物)均無核酸污染。E管反應(yīng)體系未加入cDNA模板但仍有核酸擴(kuò)增，考慮引物1有污染，結(jié)合E管擴(kuò)增曲線Ct值遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于有標(biāo)準(zhǔn)模板擴(kuò)增的H管，說明起始模板數(shù)很小，這符合試驗(yàn)中引物加樣量較小的實(shí)際情況。全體學(xué)生一致認(rèn)為，分裝引物1內(nèi)的核酸污染是污染源，推測是引物分裝或加樣過程中污染。

3 討 論

在分子生物學(xué)教學(xué)實(shí)踐中，有關(guān)PCR中核酸污染的內(nèi)容是一個(gè)難點(diǎn)。在理論層面，學(xué)生們基本掌握核酸污染方式中最重要的是氣溶膠污染[7]，因此，包括PCR在內(nèi)的核酸試驗(yàn)被要求在生物安全柜內(nèi)進(jìn)行操作。在污染源分型上亦不難理解，常見污染類型包括:(1)標(biāo)本污染，包括收集標(biāo)本的容器污染，標(biāo)本密封不嚴(yán)造成交叉污染及核酸提取過程中吸樣槍污染。(2) PCR試劑污染[8]，包括加樣槍、容器、ddH2O等溶液被PCR核酸模板污染。(3)PCR產(chǎn)物污染，有報(bào)道PCR產(chǎn)物污染離心機(jī)，導(dǎo)致氣溶膠顆粒在離心機(jī)氣流作用下進(jìn)入到未蓋嚴(yán)的離心管中[9-10]。本文通過激發(fā)學(xué)生的逆向思維分析，主動(dòng)了解污染類型及污染可能來源，使孤立的試驗(yàn)方法變得系統(tǒng)，使試驗(yàn)教學(xué)更生動(dòng)、高效，增強(qiáng)了學(xué)生的主動(dòng)性，提高了學(xué)習(xí)效率。

教學(xué)中常常強(qiáng)調(diào)PCR污染的監(jiān)測可通過對照試驗(yàn)來實(shí)現(xiàn)，陰性對照尤為重要，每次PCR務(wù)必做陰性對照，包括不加模板的空白對照、不加引物的空白對照及模板和引物均不加僅有試驗(yàn)試劑的空白對照等。但學(xué)生們沒有切身感受，常有僥幸心理，為了減少試驗(yàn)步驟、節(jié)省時(shí)間會(huì)省略部分甚至全部陰性對照的配制。本研究就是沒有設(shè)置無引物的對照，所以導(dǎo)致無法在發(fā)現(xiàn)假陽性的第一時(shí)間判斷污染的來源。

本教學(xué)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)空白對照有DNA擴(kuò)增，污染來源不明，當(dāng)無法準(zhǔn)確判斷污染源時(shí)需進(jìn)一步設(shè)計(jì)對照試驗(yàn)，以找出污染源。進(jìn)一步的試驗(yàn)仍需要設(shè)立空白對照，根據(jù)下一步試驗(yàn)結(jié)果確定或排除某類污染源，最后通過試驗(yàn)驗(yàn)證污染源。引物污染較隱蔽，對試驗(yàn)結(jié)果的影響容易被忽視，只有設(shè)立良好的空白對照，才能及時(shí)發(fā)現(xiàn)假陽性和判定假陽性的來源。引物污染具有不易被發(fā)現(xiàn)的特殊性[11-12]，由于擔(dān)心原裝引物內(nèi)有污染，試驗(yàn)中學(xué)生們拓展思維，應(yīng)用了2個(gè)不同的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，一個(gè)是新開封的引物原裝液，另一個(gè)是另一家引物公司設(shè)計(jì)及制備的引物，從2個(gè)層級搜尋污染源，最終發(fā)現(xiàn)是分裝的引物內(nèi)有核酸污染，可能是在分裝過程或使用過程中被污染。這期間，學(xué)生參與了試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案，對設(shè)計(jì)過程及試驗(yàn)過程均透徹理解。

教學(xué)中教員進(jìn)一步強(qiáng)調(diào)，鑒于核酸污染的發(fā)生率較高，并且所導(dǎo)致的后果嚴(yán)重，PCR實(shí)驗(yàn)室內(nèi)應(yīng)采取相應(yīng)的措施防范污染。一些單位參照美國PDCA[P策劃(P)、實(shí)施(D)、檢查(C)、處置(A)]質(zhì)量管理循環(huán)體系，在控制實(shí)驗(yàn)室污染方面已經(jīng)取得明顯效果[13]。另外，通過加強(qiáng)PCR分析前的質(zhì)量控制[14]、對實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測，均有利于提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性[15]。以上諸多措施均是避免PCR污染的有效方法，但如果不設(shè)空白對照卻無法發(fā)現(xiàn)污染源，如果空白對照不夠全面，亦無法判定污染來源?？瞻讓φ盏脑O(shè)立是PCR發(fā)現(xiàn)和判定假陽性的關(guān)鍵，是避免試驗(yàn)結(jié)果受核酸污染影響的重要手段。

PBL教學(xué)法的目的是提高學(xué)生發(fā)現(xiàn)問題、解決問題的能力，因此，設(shè)計(jì)問題要緊密結(jié)合PCR的實(shí)際，由淺入深、層層推進(jìn)，讓學(xué)生能夠思路清晰、邏輯清楚地完成實(shí)驗(yàn)流程，從而解決試驗(yàn)中的問題。本文應(yīng)用PBL教學(xué)法加實(shí)例教學(xué)，把復(fù)雜的

PCR污染問題逐步轉(zhuǎn)化為層次分明、邏輯清楚的科學(xué)問題，突破傳統(tǒng)教學(xué)模式。在試驗(yàn)教學(xué)過程中，教師由知識(shí)的傳授者轉(zhuǎn)變?yōu)檫壿嫹治龅囊龑?dǎo)者，通過學(xué)生自主學(xué)習(xí)和理解解決疑難問題。