王云云，段 穎，候詠微，曾涵芳，韓兆玉

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物科技學(xué)院,江蘇 南京 210095)

機體內(nèi)起主要生理作用的短鏈脂肪酸(short chain fatty acids，SCFAs)是由腸道內(nèi)厭氧微生物發(fā)酵難消化的碳水化合物而產(chǎn)生，主要包括乙酸、丙酸、丁酸等。SCFAs不僅對腸上皮細(xì)胞的生長、分化、代謝和轉(zhuǎn)運產(chǎn)生影響，而且對宿主的營養(yǎng)代謝、免疫抗病、調(diào)節(jié)腸道電解質(zhì)及微生物平衡等方面有著重要的調(diào)控作用[1-2]。研究表明，在消化道內(nèi)未降解的營養(yǎng)素經(jīng)微生物發(fā)酵產(chǎn)生的SCFAs，可刺激胃腸上皮的內(nèi)分泌細(xì)胞產(chǎn)生胃腸激素，其作用于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腦-腸軸來調(diào)控食欲[3-4]。此外，SCFAs還具有胰島素樣效應(yīng)，如乙酸可通過血腦屏障刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)中厭食神經(jīng)肽基因的表達，從而調(diào)控動物食欲[5-7]。因此，探究SCFAs及脂肪酸鹽對動物攝食及胃腸激素分泌調(diào)控機制的影響，對生產(chǎn)具有重要的指導(dǎo)意義。

采食量是動物生長發(fā)育的首要限制因素[8]，受到多種神經(jīng)遞質(zhì)和激素的影響，如神經(jīng)肽(neuropeptide,NPY)、胃饑餓素(ghrelin)、膽囊收縮素(cholecystokinin,CCK)、瘦素(leptin,LEP)等，上述物質(zhì)除ghrelin具有促進攝食作用外，其他激素均為厭食激素[9-10]。不同脂肪酸對畜禽采食量的影響結(jié)果各異，其中的機制現(xiàn)階段尚不完善[11]。研究表明，腹部皮下注射乙酸鈉可顯著降低家兔日采食量，且對家兔的組織脂代謝產(chǎn)生影響[12]。此外，靜脈灌注低濃度(1 mol/L)和高濃度(2 mol/L)乙酸鈉對水牛采食量具有顯著影響，且胰島素水平均顯著地高于對照組[13]。另外，研究發(fā)現(xiàn)在對新生犢牛靜脈灌注丙酸鈉和乙酸鈉時，血糖和血漿胰島素濃度在灌注丙酸鈉15 min后顯著升高，而乙酸鈉灌注組則無顯著性影響[14]。此外，研究表明，JAK2(janus kinase 2)/ STAT3(signal transducers and activators of transcription 3)信號通路是一條可由細(xì)胞因子激活，促使信號從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的信號傳導(dǎo)通路，其失調(diào)可導(dǎo)致機體能量穩(wěn)態(tài)的崩潰[15-16]。目前，已知的細(xì)胞因子，如LEP、生長激素(growth hormone,GH)、催乳素(prolactin，PRL)等在與相應(yīng)配體結(jié)合后可連接胞內(nèi)JAK，激活JAK2/STAT3信號通路，進入細(xì)胞核。因此JAK2/STAT3通路的激活可降低動物采食量，反之采食量則增加[17]。然而，乙酸鈉對小鼠攝食的影響及其對小鼠激素水平的影響和調(diào)控機制仍是未知的，需進一步研究。

鑒于此，本試驗探討不同質(zhì)量濃度的乙酸鈉對小鼠攝食及攝食調(diào)控因子的影響，以期為研究乙酸鹽對攝食調(diào)控的影響提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組選用60只4周齡體質(zhì)量為(27.5±2.5) g的SPF級健康昆明小鼠，打好耳標(biāo)后于標(biāo)準(zhǔn)SPF級鼠房中預(yù)飼24 h以緩解應(yīng)激反應(yīng)。預(yù)飼期結(jié)束后，將小鼠隨機分為3組，分別為對照組、試驗Ⅰ組(低濃度組)及試驗Ⅱ組(高濃度組)，每組20只。試驗期間每日8：00進行小鼠腹腔注射，對照組注射生理鹽水，試驗組分別注射0.3,0.5 kg/L的乙酸鈉溶液。每7 d進行1次體質(zhì)量統(tǒng)計，試驗期共28 d。試驗期間小鼠自由飲食，自由飲水。

1.2 樣品采集在試驗7,14,21,28 d時每組隨機取5只小鼠分別進行活體眼部采血1 mL，離心分離血清，-80℃保存待測。采集小鼠結(jié)腸、十二指腸、肝臟等組織，用PBS浸洗后，將其分為兩部分，一部分保存于液氮中用于qRT-PCR檢測，另一部分置于4%多聚甲醛中固定用于組織切片制作與觀察。

1.3 組織切片觀察將固定于4%多聚甲醛中的腸組織和肝臟組織樣品制作石蠟切片，進行HE染色，最后通過光學(xué)顯微鏡觀察組織的形態(tài)學(xué)變化。

1.4 血清生化指標(biāo)的檢測測定NPY及LEP血清生化指標(biāo)。以上指標(biāo)由酶標(biāo)儀測得，酶聯(lián)免疫試劑盒購自南京建成生物有限公司。

1.5 總RNA提取與RT-qPCR測定相關(guān)基因的表達將從各組小鼠中提取的結(jié)腸及十二指腸組織置于無菌罩內(nèi)消化3～5 min，按TRIzol試劑盒說明書提取細(xì)胞總RNA。取1 000 ng總RNA用TaKaRa試劑盒進行反轉(zhuǎn)錄成cDNA，-80℃保存?zhèn)溆?。按照SYBR Green 試劑盒檢測RNA的表達水平，反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)溶解曲線檢測特異性。用2-△△Ct法計算各基因相對表達量。引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR引物信息

2 結(jié)果

2.1 乙酸鈉對小鼠采食量、體質(zhì)量及飼料轉(zhuǎn)化率的影響由圖1可知，注射乙酸鈉后3組小鼠采食量總體呈下降趨勢，且試驗Ⅱ組更為明顯，但差異不顯著(P>0.05)。由表2可知，注射乙酸鈉對小鼠體質(zhì)量在時間和濃度上具有交互作用(P<0.05)。試驗組體質(zhì)量在21 d前均高于對照組，且試驗Ⅱ組在7 d時顯著高于對照組(P<0.05)，21 d后，試驗組體質(zhì)量均低于對照組，且21 d時試驗Ⅰ組顯著低于對照組(P<0.05)。此外，體質(zhì)量水平顯著受飼養(yǎng)時間影響(P<0.001)，可見對照組在21 d后體質(zhì)量顯著升高，而試驗Ⅱ組在14 d后顯著升高(P<0.05)。由圖2可知，乙酸鈉使小鼠飼料轉(zhuǎn)化率呈現(xiàn)出先高后低的趨勢，且各組皆在14 d達到飼料轉(zhuǎn)化率峰值；除14 d外，試驗組飼料轉(zhuǎn)化率皆低于對照組，且試驗Ⅱ組更明顯。因此，注射乙酸鈉總體降低了小鼠采食量和飼料轉(zhuǎn)化率。

注：采食量范圍為6.0～8.0 g/(只·d)。CON.對照組；Treatment Ⅰ.低濃度組；Treatment Ⅱ.高濃度組。下同

注：飼料轉(zhuǎn)化率(FCR)=增加的活體質(zhì)量(g)/消耗的飼料量(g)

表2 乙酸鈉對小鼠體質(zhì)量的影響 g/只

2.2 乙酸鈉對小鼠腸道、肝臟組織形態(tài)的影響由表3可知，乙酸鈉對小鼠小腸絨毛發(fā)育在時間和濃度上有交互作用(P<0.001)。相較于對照組，乙酸鈉在7,14,21,28 d時對小腸絨毛長度的影響呈先升高后降低再升高的趨勢。此外，小腸絨毛發(fā)育狀況顯著受飼養(yǎng)時間的影響(P<0.001)，試驗Ⅱ組在7 d時小腸絨毛長度顯著低于對照組(P<0.05)，在14,28 d時顯著高于對照組(P<0.05)。由圖3可知，乙酸鈉處理下的肝臟組織表觀發(fā)育狀況正常。因此，乙酸鈉在7 d時對小腸絨毛發(fā)育起到抑制作用，而14，28 d時起到促進作用，且在試驗Ⅱ組中更為顯著。

圖3 乙酸鈉對小腸絨毛(左)及肝臟(右)發(fā)育狀況的影響

表3 乙酸鈉對肝臟組織發(fā)育情況的影響 μm

2.3 乙酸鈉對小鼠血清NPY及LEP的影響由表4所示，乙酸鈉對小鼠血清攝食因子NPY在時間和濃度上沒有互作效應(yīng)(P>0.05)。7 d時，相較于對照組，試驗Ⅱ組NPY含量顯著高于對照組(P<0.05)。此外，乙酸鈉對血清LEP在時間和濃度上有互作效應(yīng)(P<0.05)。其中試驗Ⅰ組在14，21，28 d時LEP含量顯著低于7 d (P<0.05)，其他均無統(tǒng)計學(xué)差異。

表4 乙酸鈉對小鼠血清NPY及LEP含量影響 ng/L

2.4 乙酸鈉對小鼠結(jié)腸攝食相關(guān)基因mRNA表達的影響如圖4所示，乙酸鈉對小鼠結(jié)腸3種攝食相關(guān)基因PYY、CCK、LEP、JAK2及STAT3的mRNA相對表達量在時間和濃度上均有互作效應(yīng)(P<0.001)。在試驗各個時期，試驗Ⅰ組各mRNA表達量持續(xù)高于對照組和試驗Ⅱ組。如圖4A所示，試驗Ⅰ組PYY表達量在7 d時顯著高于對照組(P<0.05)，試驗Ⅱ組在14，28 d時顯著高于對照組(P<0.05)。如圖4B所示，試驗Ⅰ組CCK表達量在14，21 d時顯著高于對照組(P<0.05)，試驗Ⅱ組在14，28 d時顯著低于對照組(P<0.05)。如圖4C所示，試驗Ⅰ組LEP表達量在7，14 d時顯著高于對照組(P<0.05)。如圖4D～E所示，試驗Ⅰ組JAK2和STAT3表達量在7，14，21 d時皆高于對照組(P<0.05)，試驗Ⅱ組JAK2和STAT3表達量在7，14 d時顯著低于對照組但在21 d時顯著高于對照組(P<0.05)。因此，除試驗Ⅱ組在14 d左右時抑制了攝食調(diào)控因子CCK及JAK2、STAT3的mRNA表達外，乙酸鈉在4周內(nèi)總體上促進了結(jié)腸中具有抑制攝食作用的相關(guān)基因表達來抑制攝食，且在7，14，21 d時的試驗Ⅰ組中作用更為顯著。

圖4 乙酸鈉對小鼠結(jié)腸攝食因子PYY(A)、CCK(B)、LEP(C)、JAK2(D)和STAT3(E)基因mRNA表達的影響

2.5 乙酸鈉對小鼠十二指腸攝食相關(guān)基因mRNA表達的影響如圖5所示，乙酸鈉對小鼠十二指腸攝食因子PYY、CCK、LEP、JAK2及STAT3的mRNA表達量在時間和濃度中均有互作效應(yīng)(P<0.01)。在試驗各個時期，試驗Ⅰ組的各mRNA表達量在4周內(nèi)均高于對照組和試驗Ⅱ組。如圖5A所示，試驗Ⅰ組的PYY表達量在7 d時顯著高于對照組(P<0.05)。如圖5B所示，試驗Ⅰ組的CCK表達量在21 d時顯著高于對照組(P<0.05)。如圖5C所示，試驗Ⅰ組的LEP表達量在7，14，21 d時均顯著高于對照組(P<0.05)。如圖5D、E所示，相較于對照組，乙酸鈉處理在7 d時均顯著促進了JAK2和STAT3表達(P<0.05)；而14 d時試驗Ⅱ組顯著降低了JAK2和STAT3的表達(P<0.05)。因此，除試驗Ⅱ組在14 d時抑制了JAK2和STAT3的mRNA表達外，乙酸鈉在4周內(nèi)總體上促進了十二指腸中具有抑制攝食作用的相關(guān)基因表達來抑制攝食,且在7，14，21 d時的試驗Ⅰ組中作用更為顯著。

圖5 乙酸鈉對小鼠十二指腸攝食因子PYY(A)、CCK(B)、LEP(C)、JAK2(D)及STAT3(E)基因mRNA表達的影響

3 討論

乙酸可由不易被消化的碳水化合物經(jīng)腸道微生物菌群發(fā)酵產(chǎn)生[18]。在哺乳動物中，乙酸可直接通過血腦屏障進而影響動物食欲[19]。有研究表明[20]，動物的采食受大腦神經(jīng)信號的調(diào)節(jié)，如外周信號和下丘腦食欲中樞網(wǎng)絡(luò)。其中外周信號主要包括來自胃、腸道及血液中的激素及營養(yǎng)代謝物等；而下丘腦食欲中樞的調(diào)節(jié)主要指一些外周信號和食欲調(diào)節(jié)肽等通過刺激下丘腦食欲中樞而產(chǎn)生的一種采食調(diào)控行為[14]。GOSWAMI等[21]和FROST等[9]的研究表明，對小鼠腹腔注射500 mg/kg乙酸鹽后1，2 h發(fā)現(xiàn)，其采食量顯著降低；劉宇[22]在飼糧中添加0.15%的乙酸鈉發(fā)現(xiàn)，其可顯著增加斑馬魚的增重率和飼料轉(zhuǎn)化率。本試驗結(jié)果顯示，除高質(zhì)量濃度乙酸鈉(0.5 kg/L)注射在14 d時提高了小鼠飼料轉(zhuǎn)化率及腸絨毛長度外，乙酸鈉在4周內(nèi)總體上抑制了小鼠的采食量、增重率、飼料轉(zhuǎn)化率及腸絨毛發(fā)育程度，故在一定程度上證明乙酸鈉可對動物的采食情況產(chǎn)生影響。

腦-腸肽是一類在胃腸道等外周組織及中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛分布的肽類激素，與胃腸道發(fā)揮雙向調(diào)節(jié)作用，并進一步調(diào)節(jié)生理穩(wěn)態(tài)及攝食等活動[23]。先前研究表明，胃腸上皮細(xì)胞分泌的胃腸激素，如具有促進攝食效果的ghrelin及厭食效果的PYY、CCK、胰多肽(pancreatic polypeptide,PP)、胰高血糖素-1(GLP-1)等，皆可參與調(diào)節(jié)多種攝食相關(guān)的活動。CCK主要由十二指腸和空腸分泌；PYY主要由結(jié)腸、直腸分泌，兩者皆在外周組織發(fā)揮調(diào)節(jié)胃腸功能的作用[24]。此外，動物攝食后，營養(yǎng)物質(zhì)進入胃腸道從而刺激腦-腸肽的釋放，通過迷走傳入神經(jīng)元將信號傳遞給中樞神經(jīng)系統(tǒng)，神經(jīng)中樞將信號整合后經(jīng)傳出神經(jīng)到達效應(yīng)器官，以促進或抑制攝食；腦-腸軸系統(tǒng)能充分感應(yīng)機體的營養(yǎng)狀況，同時釋放的腦-腸肽及相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)共同參與對食物攝取的調(diào)節(jié)，以維持機體的能量穩(wěn)態(tài)；其既是將大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)和胃腸道聯(lián)系起來的神經(jīng)內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，也是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)與腸神經(jīng)系統(tǒng)(ENS)之間的雙向整合系統(tǒng)[25-26]。本試驗結(jié)果顯示，乙酸鈉處理在4周內(nèi)總體上促進了結(jié)腸及十二指腸中厭食激素基因PYY、LEP、CCK的mRNA表達，尤其是低質(zhì)量濃度乙酸鈉(0.3 kg/L)在7，14，21 d時顯著促進了結(jié)腸中此3種厭食激素的mRNA表達，表明乙酸鈉在一定程度上影響了胃腸激素的分泌活動。

攝食調(diào)控的機制是一個復(fù)雜的生理生化過程，對動物攝食行為和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)受到傳入到大腦中的各種反映營養(yǎng)狀態(tài)和外部環(huán)境信號的共同影響[25]。下丘腦是主要的調(diào)節(jié)攝食和能量穩(wěn)態(tài)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)，下丘腦弓狀核(arcuate nucleus,ARC)作為關(guān)鍵的攝食調(diào)控核團，通過接受外周神經(jīng)和胃腸激素的刺激信號參與對攝食的調(diào)節(jié)[27]。JAK2/STAT3信號通路是一條由細(xì)胞因子激活的、使信號快速從細(xì)胞外轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核的信號傳導(dǎo)通路，可使帶酪氨酸的蛋白活化，引發(fā)基因和蛋白質(zhì)水平的變化，在機體中普遍存在，在攝食和能量平衡的調(diào)節(jié)中占有重要地位[28]。LEP轉(zhuǎn)導(dǎo)型JAK2/STAT3信號通路是現(xiàn)階段普遍接受的攝食調(diào)控通路，其機理主要為LEP通過血腦屏障與下丘腦弓狀核的受體結(jié)合后，激活JAK2-STAT3通路，STAT3進入細(xì)胞核通過抑制神經(jīng)肽Y/刺鼠相關(guān)蛋白(AgRP/NPY)神經(jīng)元及刺激阿黑皮素原(POMC)神經(jīng)元，從而共同發(fā)揮抑制攝食作用[29-30]。本試驗結(jié)果顯示，除高質(zhì)量濃度乙酸鈉(0.5 kg/L)在14 d左右顯著抑制了結(jié)腸及十二指腸的JAK2和STAT3的mRNA表達外，乙酸鈉在4周內(nèi)總體上促進了腸道JAK2及STAT3的mRNA表達，且在7，14，21 d時的結(jié)腸中表現(xiàn)更為顯著，表明乙酸鈉在一定程度上影響了腸道中的JAK2/STAT3通路狀態(tài)。

綜上所述，腹腔注射乙酸鈉溶液在一定程度上影響了小鼠的攝食活動。相較于對照組，低質(zhì)量濃度乙酸鈉(0.3 kg/L)通過降低4周內(nèi)采食量和飼料轉(zhuǎn)化率及顯著上調(diào)7，14，21 d時腸道3種厭食激素CCK、LEP、PYY 和攝食調(diào)控因子JAK2、STAT3的mRNA表達來抑制攝食；高質(zhì)量濃度乙酸鈉(0.5 kg/L)除在14 d 左右通過促進腸絨毛發(fā)育、提高飼料轉(zhuǎn)化率及顯著下調(diào)腸道JAK2和STAT3的mRNA表達來短暫的促進攝食外，其在4周內(nèi)整體上也抑制了小鼠的攝食活動。