鳳凰單叢茶果皮與種皮提取液的體外抑菌作用研究

李 剛，吳清韓，劉志聰，吳銳冰

（1.韓山師范學院 生命科學與食品工程學院，廣東 潮州 521041；2.廣東省粵東藥食資源功能物質(zhì)與治未病研究重點實驗室，廣東 潮州 521041）

茶樹是山茶科山茶屬灌木或喬木.蒴果圓球形，直徑2.5-3厘米，2-3室，每室有種子1-2 個，果皮厚木質(zhì)（圖1A），果實成熟后裂開，種子（茶籽）脫落（圖1B），種子外層木質(zhì)狀殼為種皮）（圖1C）［1］.我國茶樹栽培歷史悠久，分布廣泛，種質(zhì)資源豐富［2］.鳳凰單叢茶是廣東省潮州市鳳凰鎮(zhèn)茶農(nóng)經(jīng)鳳凰水仙選育而來的優(yōu)異單株，以其單株（叢）采收、單株（叢）加工而得名［3］，文中簡稱鳳凰茶.近年來，鳳凰茶的經(jīng)濟效益帶動了當?shù)氐慕?jīng)濟發(fā)展，提高了人民的生活水平.但調(diào)查發(fā)現(xiàn)，當前鳳凰茶茶農(nóng)、茶葉生產(chǎn)企業(yè)對茶樹的種植、茶葉加工、茶葉產(chǎn)品創(chuàng)新開發(fā)等方面關注較多，而茶樹果實所具有的潛在經(jīng)濟效益卻未得到關注及進一步開發(fā)利用.加之鳳凰單叢茶主要沿習單株種植、單株采摘、單株制茶的傳統(tǒng)制茶工藝，且鳳凰茶樹主要以異花傳粉，茶農(nóng)為了保證茶葉品質(zhì)如初，鳳凰茶樹的繁殖方式主要以扦插代替有性繁殖，進一步導致茶果需求更為減少，茶樹果實除極少數(shù)用于繁殖以外，其余大部分自然脫落，造成資源浪費.

圖1 茶樹果實及種子

目前關于茶樹果實的利用偏向于油茶種子的綜合利用［4］；樊興土等研究了茶果的主要化學成分及其在成熟過程中的變化規(guī)律［5］；張衛(wèi)明等研究了茶果粗脂肪與粗皂甙的積累，報道了茶果在成熟過程中粗皂甙及粗脂肪的積累情況［6］；鄭德勇等研究發(fā)現(xiàn)，茶樹果實中含有角鯊烯、甾醇、生育酚等微量的活性物質(zhì)［7］；而關于鳳凰茶茶果的研究較少.唐裕芳等發(fā)現(xiàn)，鳳凰茶果含有大量多縮戊糖、鞣質(zhì)、黃酮及黃酮苷類等成分，經(jīng)加工后可利用于化工、醫(yī)藥、農(nóng)業(yè)等行業(yè)［8］.因此鳳凰茶樹果實的綜合開發(fā)利用具有一定的價值.

鳳凰茶產(chǎn)業(yè)的順利發(fā)展，離不開有機茶園的建設.但是茶園農(nóng)藥的不合理使用一直是困擾有機茶園建設的一個問題.茶作為重要植物資源，茶葉的抑菌作用已經(jīng)廣為人知，因此本研究以茶樹果皮和種皮為研究對象，研究其抑菌效果，為茶樹果皮和種皮的綜合應用，為開發(fā)新型殺菌劑建設生態(tài)茶園具有重要意義.

本實驗通過研究鳳凰單叢茶果皮與種皮體外抑菌作用，分析其醇提取液對大腸桿菌（Escherichia coli）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）的抑制效果，以此來彌補鳳凰單叢茶的研究空缺，使茶果變廢為寶，為植物源除草劑的開發(fā)及茶果的綜合利用及生態(tài)茶園建設提供參考依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料：鳳凰茶果，采自廣東省潮州市鳳凰山，洗凈后人工剝離果皮與種皮，55 ℃烘干備用.

供試菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌由韓山師范學院微生物實驗室提供.

培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基.

試劑：氯化鈉、鹽酸、氫氧化鈉等均為分析純，牛肉膏、蛋白胨、瓊脂粉均為生物化學試劑，以上試劑由韓山師范學院植物研究所提供.

儀器：旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，高壓蒸汽滅菌鍋，單人單面超凈工作臺，培養(yǎng)箱，烘箱，pH 試紙，玻璃棒，漏斗，燒杯，培養(yǎng)皿，濾膜過濾器等.

1.2 方法

1.2.1 鳳凰茶果皮與種皮醇提取液的制備及其濃度的確定

分別稱取鳳凰茶果皮20.15 g，種皮20.18 g，剪碎后研磨，各加入150 mL 70%乙醇溶液，浸泡過夜（10 h-12 h），濾過液4 ℃冰箱保存，濾渣分別用150 mL 蒸餾水浸泡過夜（10 h-12 h），濾出液與之前相應醇提取液混合，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮至10 mL，分別制得鳳凰茶果皮和種皮醇提取液.將提取液置4℃保存待用.濾渣烘干稱重，然后分別計算醇提取液的濃度［9］.

計算公式：提取液濃度（g/L）=［原材料質(zhì)量（g）-濾渣質(zhì)量（g）］/濃縮液體積（L）.

1.2.2 培養(yǎng)基制備

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基和牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基按照《微生物試驗手冊》制備［10］.

1.2.3 菌懸液的制備

將大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌3 種供試細菌菌種分別接于牛肉膏蛋白胨斜面培養(yǎng)基上，37 ℃恒溫培養(yǎng)24 h 后，分別挑取3 種供試細菌單克隆菌落各接種于牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（30 mL）中，置37 ℃恒溫搖床培養(yǎng)12 h得到相應細菌培養(yǎng)液［11］.

1.2.4 抑菌實驗

抑菌圈大小測定：牛津杯法.吸取100 μL供試細菌液加于無菌牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基中，涂布棒涂布均勻.取無菌牛津杯垂直置于培養(yǎng)基上，輕輕按壓，使牛津杯與培養(yǎng)基結合緊密，每皿4 個.將鳳凰茶果皮與種皮醇提取液分別用無菌水按三倍稀釋法稀釋成相應濃度的溶液，醇溶液做為對照.分別加200 μL 鳳凰茶果皮與種皮提取液于牛津杯中，每個培養(yǎng)皿中滴加一種濃度的鳳凰茶果皮或種皮醇提取液，每組3 個重復實驗.平板在室溫下放置20 min 后置于37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，取出測定抑菌圈直徑大小，計算三次重復實驗的平均值，抑菌圈平均直徑≤6 mm（牛津杯直徑），則對應濃度已無抑菌效果，據(jù)此比較各濃度的抑菌效果［12-14］.

最低抑菌濃度（MIC50）測定：采用平板稀釋法，將鳳凰茶果皮與種皮醇提取液分別用無菌水按三倍稀釋法稀釋成相應濃度的溶液，加各濃度的提取液0.5 mL于牛肉膏蛋白胨平板培養(yǎng)基中，各平板加入待測菌液0.2 mL，涂布均勻，37 ℃倒置培養(yǎng)36 h后統(tǒng)計菌落數(shù)，重復3次.以只加菌懸液為對照組.根據(jù)平板菌落數(shù)計算抑菌率.

抑菌率＝（對照皿菌落數(shù)－試驗皿菌落數(shù)）/對照皿菌落數(shù)×100%，以抑菌率50%提取液濃度計算MIC50結果［15-16］.用統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)顯著性差異.

1.3 數(shù)據(jù)與統(tǒng)計

數(shù)據(jù)統(tǒng)計使用SPSS11.5軟件，對抑菌試驗結果進行方差分析，不同試驗菌及不同濃度提取液之間的差異顯著性均采用LSD法進行多重比較.繪圖使用office 2007.

2 結果與分析

2.1 鳳凰茶果皮與種皮提取液濃度

取同質(zhì)量的果皮與種皮，經(jīng)醇提、濃縮后，發(fā)現(xiàn)種皮濾渣質(zhì)量明顯高于果皮，表明果皮中有更多的次生物質(zhì)被提取.獲得的果皮與種皮的提取液濃度有明顯差異，果皮提取液的濃度（456.89 g/L）明顯高于種皮提取液（249.10 g/L）（表1）.

表1 鳳凰茶果皮與種皮提取液濃度

2.2 抑菌圈的測定結果與分析

采用牛津杯法測定了鳳凰茶果皮與種皮提取液的抑菌效果，結果發(fā)現(xiàn)：鳳凰茶果皮提取液對3 種供試細菌均有抑制作用（最小有效抑菌濃度為5.64 g/L），且抑菌作用隨提取液濃度的增加而顯著增強.果皮提取液對3 種供試細菌的抑菌效果依次為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌.當果皮醇提取液濃度在456.89 g/L 時，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達22.67 mm、18.33 mm、15.00 mm，抑菌效果明顯；當提取液濃度為5.64 g/L時，對金黃色葡萄球菌仍有抑菌效果.

與果皮提取液相似，鳳凰茶種皮提取液對3 種供試細菌也有明顯抑制作用，且抑菌作用隨提取液濃度的增加而顯著增強.種皮提取液對3 種供試細菌的抑菌效果依次為金黃色葡萄球菌＞大腸桿菌＞枯草芽孢桿菌，與鳳凰茶果皮提取液相同.種皮提取液濃度在249.10 g/L 時，其對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌的抑菌圈直徑分別達25.00 mm、24.67 mm、17.33 mm，具有很強的抑菌效果.雖然種皮提取液在高濃度的抑菌作用明顯，但其最小有效抑菌濃度為27.68 g/L，而果皮提取液為5.64 g/L，其抑菌作用弱于果皮提取液（圖2）.

圖2 鳳凰茶種皮提取液（A）和果皮提取液（B）對供試細菌的抑菌圈直徑

2.3 最低抑菌濃度（MIC50）的測定

采用三倍稀釋法測定了鳳凰茶果皮與種皮提取液對3種細菌的最低抑菌濃度（MIC50），結果表明，鳳凰茶果皮和種皮提取液對金黃色葡萄球菌的MIC50分別為5.64 g/L和9.23 g/L，對大腸桿菌的MIC50分別為5.64 g/L和9.23 g/L，對枯草芽孢桿菌的MIC50為16.92 g/L和27.68 g/L.總體分析，鳳凰茶果皮提取液的抑菌作用要強于種皮提取液.兩種提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯抑菌作用，且抑菌效果相似，分別為對金黃色葡萄球菌最強，大腸桿菌次之，其次為枯草芽孢桿菌（表2）.

表2 鳳凰茶果皮提取液及種皮提取液對供試細菌的MIC50

3 討論

研究結果發(fā)現(xiàn)鳳凰茶果皮及種皮對金黃色葡萄球菌，大腸桿菌和枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌效果，且對金黃色葡萄球菌的抑菌效果強于枯草芽孢桿菌.本文探討的鳳凰茶果皮及種皮對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的抑菌作用為鳳凰單叢茶茶果的抑菌價值提供了依據(jù)，為鳳凰茶果皮和種皮的綜合利用開發(fā)提供了思路.基于這樣的抗菌理念，可以賦予鳳凰茶茶果新的利用價值，鳳凰茶果在潮汕地區(qū)資源豐富，若能以其為原料進行植物源抗菌劑的開發(fā)，可廣泛用于食品、醫(yī)藥等行業(yè)，也可以作為植物源殺菌劑用于有機茶園的管理，將為鳳凰茶的綜合開發(fā)利用開拓廣闊的前景.

本實驗將鳳凰茶果果皮與種皮分開作為材料，旨在探究鳳凰茶果果皮與種皮抑菌作用的區(qū)別及有效成分的差異，鳳凰茶果果皮與種皮均具有明顯的抑菌作用，但二者又有所不同，茶果果皮的抑菌效果要強于種皮，為了深入研究其抑菌效果，后續(xù)工作準備對提取液進行成分分離，并對有抑菌活性的物質(zhì)進行結構分析和鑒定，闡明其抑菌機制，進一步為鳳凰茶的綜合利用提供理論依據(jù).