王芬芬,王秀芳,胡劍浩,王銀娟

王芬芬,王秀芳,胡劍浩,王銀娟,紹興文理學院附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 浙江省紹興市 312000

0 引言

胃癌是臨床常見的一種惡性腫瘤,其具有復發(fā)率高與死亡率高等特點,化療、放療等治療手段具有毒副作用,患者易產(chǎn)生耐藥性與抵抗性從而降低治療效果,患者預后較差.從天然植物中提取的活性成分具有抗腫瘤作用,研究表明,部分中醫(yī)藥具有抗胃癌作用.山竹又稱山竹子,山竹果皮中含有多種氧雜蒽酮衍生物,其具有抗腫瘤、抗氧化等作用,研究表明,山竹果皮提取物可抑制非小細胞肺癌細胞增殖、遷移及侵襲.但山竹果皮中總氧雜蒽酮與胃癌相關研究報道相對較少.微小RNA(miRNA)可通過調(diào)控細胞增殖及轉(zhuǎn)移等過程而發(fā)揮作用,研究表明,miR-338-3p在胃癌組織中表達下調(diào),并可能參與胃癌發(fā)生及發(fā)展過程.但miR-338-3p是否可作為山竹果皮中總氧雜蒽酮治療胃癌的潛在靶點尚未可知.因此,本研究主要探討山竹果皮中總氧雜蒽酮是否可通過調(diào)控miR-338-3p的表達而影響胃癌細胞生物學行為.

1 材料和方法

1.1 材料 山竹果皮粉末(扶風斯諾特生物科技有限公司);人胃癌細胞AGS(寧波明舟生物科技有限公司);Trizol試劑、Lipofectamine? 3000 Transfection Reagent(美國Invitrogen);反轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR試劑(美國Thermo Fisher);miR-NC、miR-338-3p mimics、anti-miR-NC、anti-miR-338-3p(廣州銳博生物);MTT試劑、Transwell小室、Matrigel基質(zhì)膠(北京索萊寶科技有限公司);兔抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2(matrix metalloproteinases-2,MMP2)、基質(zhì)金屬蛋白酶-9(matrix metalloproteinases-9,MMP9)抗體與二抗(美國Abcam);腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)檢測試劑盒(上海酶聯(lián)生物).

1.2 方法

1.2.1 提取山竹果皮中總氧雜蒽酮:稱取50 g山竹果皮粉末,加入85%乙醇500 mL,室溫孵育24 h,過濾后提取上清液,旋蒸至少量,采用乙酸乙酯萃取,吸取上清液,經(jīng)過硅膠柱,采用正己烷和乙酸乙酯(5:1)洗脫,液體烘干后得到山竹果皮中總氧雜蒽酮99.6 mg,加入DMSO溶解后置于冰箱內(nèi)備用,將山竹果皮中總氧雜蒽酮稀釋至100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L.

1.2.2 實驗分組:AGS細胞加入含有不同濃度(100 μmol/L、200 μmol/L、400 μmol/L)山竹果皮中總氧雜蒽酮的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為低劑量組、中劑量組、高劑量組.同時將正常培養(yǎng)的AGS細胞記為NC組.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將miR-NC、miR-338-3p mimics分別轉(zhuǎn)染至AGS細胞,分別記為miR-NC組、miR-338-3p組.采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將anti-miR-NC、anti-miR-338-3p分別轉(zhuǎn)染至AGS細胞,轉(zhuǎn)染成功后加入含有濃度為400 μmol/L山竹果皮中總氧雜蒽酮的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h,分別記為高劑量組+anti-miR-NC組、高劑量組+anti-miR-338-3p組.

1.2.3 MTT檢測細胞增殖:收集各組AGS細胞加入MTT溶液20 μL,于培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,棄上清,每孔加入150 μL DMSO,避光振蕩孵育5 min,應用酶標儀檢測各孔在490 nm處的吸光度值(A).

1.2.4 Transwell實驗檢測細胞遷移與侵襲:遷移實驗:取各組AGS細胞接種于上室,取600 μL含有10%胎牛血清的培養(yǎng)液加入下室,培養(yǎng)24 h,多聚甲醛固定20 min,0.1%結晶紫染液染色15 min,于顯微鏡下統(tǒng)計遷移細胞數(shù).侵襲實驗:小室包被Matrigel基質(zhì)膠稀釋液后固定5 h,后續(xù)實驗步驟同細胞遷移實驗.

1.2.5 ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β的水平:收集各組AGS細胞培養(yǎng)上清液,采用ELISA法檢測TNF-α、IL-6、IL-1β的水平,嚴格按照試劑盒說明書進行操作.

1.2.6 qRT-PCR檢測miR-338-3p的表達水平:采用Trizol試劑分別提取各組AGS細胞總RNA,應用紫外分光光度計測定RNA濃度.反轉(zhuǎn)錄合成cDNA,以cDNA為模板進行qRT-PCR擴增,應用ABI StepOnePlus熒光定量PCR儀檢測miR-338-3p相對表達量.

1.2.7 Western blot檢測MMP2、MMP9蛋白表達量:提取各組AGS細胞總蛋白,BCA法檢測蛋白濃度.取40 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳,轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h,加入1:1000稀釋的MMP2、MMP9一抗與內(nèi)參β-actin抗體(1:2000)稀釋液,4 ℃孵育過夜,加入1:3000稀釋的二抗稀釋液后室溫孵育2 h,應用Quantity One軟件對蛋白條帶進行定量.

采用SPSS 21.0統(tǒng)計學軟件分析數(shù)據(jù),計量資料以mean±SD表示,兩組間比較采用獨立樣本檢驗,多組間比較采用單因素方差分析,以＜0.05為差異具有統(tǒng)計學意義.

2 結果

2.1 不同濃度山竹果皮中總氧雜蒽酮對AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響 與NC組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組細胞MMP2、MMP9蛋白水平和細胞活力降低(＜0.05),遷移及侵襲細胞數(shù)減少(＜0.05),圖1,表1.

圖1 不同濃度山竹果皮中總氧雜蒽酮對AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響. A:Western Blot檢測MMP2、MMP9蛋白的表達;B:Transwell檢測AGS細胞遷移和侵襲;與NC組比較,aP＜0.05;NC:對照組;MMP-2:基質(zhì)金屬蛋白酶-2;MMP-9:基質(zhì)金屬蛋白酶-9;β-actin:β肌動蛋白;aP＜0.05,與對照組比較.

表1 不同濃度山竹果皮中總氧雜蒽酮對AGS細胞增殖、遷移和侵襲的影響(mean±SD,n=9)

2.2 不同濃度山竹果皮中總氧雜蒽酮對AGS細胞炎癥反應的影響 與NC組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組TNF-α、IL-6、IL-1β的水平降低(＜0.05),表2.

表2 不同濃度山竹果皮中總氧雜蒽酮對AGS細胞炎癥反應的影響(mean±SD,n=9)

2.3 不同濃度山竹果皮中總氧雜蒽酮對miR-338-3p表達的影響 與GES-1細胞比較,AGS細胞中miR-338-3p表達量降低;與NC組比較,低劑量組、中劑量組、高劑量組miR-338-3p的表達量升高(＜0.05),表3,表4.

表3 miR-338-3p在正常胃黏膜上皮細胞GES-1和胃癌AGS細胞中的表達(mean±SD,n=9)

表4 不同濃度山竹果皮中總氧雜蒽酮對miR-338-3p表達的影響(mean±SD,n=9)

2.4 miR-338-3p抑制胃癌細胞細胞AGS增殖、遷移和侵襲以及細胞炎癥反應 與miR-NC組比較,miR-338-3p組細胞MMP2、MMP9蛋白水平和細胞活力降低(＜0.05),遷移及侵襲細胞數(shù)減少(＜0.05),TNF-α、IL-6、IL-1β的水平降低(＜0.05),圖2,表5.

圖2 miR-338-3p抑制胃癌細胞細胞AGS遷移和侵襲.A:Western Blot檢測MMP2、MMP9蛋白的表達;B:Transwell檢測AGS細胞遷移和侵襲;MMP-2:基質(zhì)金屬蛋白酶-2;MMP-9:基質(zhì)金屬蛋白酶-9;β-actin:β肌動蛋白;與miR-NC組比較,aP＜0.05.

表5 miR-338-3p抑制胃癌細胞細胞AGS增殖、遷移和侵襲以及細胞炎癥反應(mean±SD,n=9)

2.5 anti-miR-338-3p可以逆轉(zhuǎn)山竹果皮中總氧雜蒽酮對胃癌細胞細胞AGS增殖、遷移、侵襲以及炎癥反應的影響 與高劑量組+anti-miR-NC組比較,高劑量組+antimiR-338-3p組細胞MMP2、MMP9水平和細胞活力升高(＜0.05),遷移及侵襲細胞數(shù)增多(＜0.05),TNF-α、IL-6、IL-1β的水平升高(＜0.05),圖3,表6.

圖3 anti-miR-338-3p可以逆轉(zhuǎn)山竹果皮中總氧雜蒽酮對胃癌細胞細胞AGS遷移、侵襲的影響.A:Western Blot檢測MMP2、MMP9蛋白的表達;B:Transwell檢測AGS細胞遷移和侵襲;MMP-2:基質(zhì)金屬蛋白酶-2;MMP-9:基質(zhì)金屬蛋白酶-9;β-actin:β肌動蛋白;與高劑量組+anti-miR-NC組比較,aP＜0.05.

表6 anti-miR-338-3p可以逆轉(zhuǎn)山竹果皮中總氧雜蒽酮對胃癌細胞細胞AGS增殖、遷移、侵襲以及炎癥反應的影響(mean±SD,n=9)

3 討論

胃癌發(fā)病機制較為復雜,分子靶向治療成為胃癌的潛在治療方法,目前中醫(yī)藥可通過調(diào)控基因或信號通路表達而發(fā)揮抗胃癌作用.miRNA在胃癌中表達異常,并可通過靶向調(diào)控靶基因表達而參與胃癌發(fā)生及發(fā)展過程,還可能作為胃癌靶向治療的潛在靶點.但miRNA是否可作為中醫(yī)藥治療胃癌的潛在靶點尚未闡明.

山竹果皮中總氧雜蒽酮具有抗腫瘤作用,并可抑制結直腸癌細胞增殖及促進細胞凋亡.本研究結果顯示,山竹果皮中總氧雜蒽酮處理后胃癌細胞活力降低,提示山竹果皮中總氧雜蒽酮可抑制胃癌細胞增殖.MMP2、MMP9屬于基質(zhì)金屬蛋白酶,其水平升高可降解細胞外基質(zhì)沉積從而促進細胞轉(zhuǎn)移.本研究結果顯示,山竹果皮中總氧雜蒽酮可降低胃癌細胞遷移及侵襲能力,并可抑制MMP2、MMP9表達,提示山竹果皮中總氧雜蒽酮可抑制胃癌細胞遷移及侵襲.慢性炎癥與胃癌密切相關,TNF-α、IL-6、IL-1β等炎癥因子釋放可促進胃癌發(fā)展.本研究結果顯示,山竹果皮中總氧雜蒽酮處理后胃癌細胞中TNF-α、IL-6、IL-1β的水平降低,提示山竹果皮中總氧雜蒽酮可抑制胃癌細胞炎癥反應進而減緩胃癌發(fā)展進程.

miR-338-3p通過下調(diào)ADAM17而抑制人下咽癌細胞遷移和侵襲.miR-338-3p在胃癌中表達下調(diào),上調(diào)其表達可抑制胃癌細胞增殖及轉(zhuǎn)移.miR-338-3p過表達可抑制肺癌細胞增殖及侵襲.本研究結果顯示,山竹果皮中總氧雜蒽酮處理后胃癌細胞中miR-338-3p的表達量升高,抑制miR-338-3p表達可拮抗山竹果皮中總氧雜蒽酮對胃癌細胞生物學行為的作用.提示山竹果皮中總氧雜蒽酮可通過促進miR-338-3p表達而抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥反應.

4 結論

綜上所述,山竹果皮中總氧雜蒽酮可通過上調(diào)miR-338-3p表達而抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥反應進而減緩胃癌發(fā)展進程,miR-338-3p可能作為山竹果皮中總氧雜蒽酮治療胃癌的潛在靶點.但山竹果皮中總氧雜蒽酮是否可通過調(diào)控其他基因而發(fā)揮抗胃癌作用尚需進一步探究.

中藥及其提取物對胃癌等腫瘤細胞增殖、轉(zhuǎn)移等具有抑制作用,但山竹果皮中總氧雜蒽酮對胃癌細胞生物學行為的影響及其可能作用機制尚未明確.

山竹果皮中總氧雜蒽酮調(diào)節(jié)胃癌細胞生物學行為的機制尚未可知,已知miR-338-3p可作為胃癌靶向治療的潛在靶點,但其與山竹果皮中總氧雜蒽酮相關性尚未可知.

山竹果皮中總氧雜蒽酮可通過調(diào)控miR-338-3p表達影響胃癌細胞生物學行為.

以人胃癌細胞AGS為研究對象,隨機分組:NC組、低劑量組、中劑量組、高劑量組、miR-NC組、miR-338-3p組、高劑量組+anti-miR-NC組、高劑量組+anti-miR-338-3p組;MTT法、Transwell實驗分別檢測細胞增殖、遷移及侵襲;ELISA法檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白細胞介素6(interleukin-6,IL-6)、白細胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的水平;qRT-PCR法檢測miR-338-3p的表達量

山竹果皮中總氧雜蒽酮可抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥反應,并可促進miR-338-3p表達,抑制miR-338-3p表達可減弱山竹果皮中總氧雜蒽酮對胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥反應的抑制作用.

山竹果皮中總氧雜蒽酮可通過上調(diào)miR-338-3p表達而抑制胃癌細胞增殖、遷移、侵襲及炎癥反應.

山竹果皮中總氧雜蒽酮可能用于治療胃癌,減緩胃癌發(fā)展進程.