許陽陽，袁文肅

（天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300072）

細菌在生長繁殖過程中需要適應(yīng)外界環(huán)境的變化以及接受外界信息的輸入［1］。細菌通過多種信號傳導(dǎo)途徑適應(yīng)外界環(huán)境的變化，最常見的有單組分系統(tǒng)、雙組分系統(tǒng)以及化學(xué)傳感系統(tǒng)［2］。其中，雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)（Two-component regulating system，TCS）是細菌體內(nèi)最重要的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)，參與細菌大部分的生命活動，調(diào)節(jié)細菌適應(yīng)外界的各種刺激反應(yīng)，例如抗生素反應(yīng)、滲透壓反應(yīng)、群體信號、營養(yǎng)反應(yīng)等。

已知幾大類跨膜TCS包括傳感器激酶、化學(xué)受體、趨光系統(tǒng)［3］。其中，最常見的雙組分轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)通常包括組氨酸激酶傳感器以及受體蛋白2個部分，組氨酸激酶傳感器存在于細胞膜或細胞質(zhì)中，根據(jù)接收外界刺激的位置不同將細胞感覺結(jié)構(gòu)域分為胞外感覺結(jié)構(gòu)域、膜嵌入感覺結(jié)構(gòu)域和胞質(zhì)內(nèi)感覺結(jié)構(gòu)域。組氨酸激酶傳感器通過改變它們的磷酸化狀態(tài)直接響應(yīng)物理或化學(xué)信號，受體蛋白上保守的天冬氨酸接受來自激酶的磷?；l(fā)生磷酸化，磷酸化的受體蛋白通過其C末端的效應(yīng)結(jié)構(gòu)域直接結(jié)合DNA引起細胞反應(yīng)［4-8］。對大量細菌進行基因組測序后發(fā)現(xiàn)，部分細菌的雙組分信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)達200多個［9-11］。

化學(xué)感覺系統(tǒng)介導(dǎo)趨化性和基于第四型菌毛的運動性，其核心主要包括化學(xué)受體（也稱甲基趨化蛋白）、CHeA組氨酸激酶和CHeW偶聯(lián)蛋白形成的三元復(fù)合物?；瘜W(xué)受體是位于信號通路輸入端的功能性信號蛋白，具有檢測高度特異性化學(xué)效應(yīng)物，并將趨化信號傳導(dǎo)至下游蛋白的功能［12］。細菌中含有大量的化學(xué)受體，它們在拓撲結(jié)構(gòu)、傳感模式、細胞位置以及配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域（Ligand binding domain，LBD）的類型上有所不同。組氨酸激酶傳感器和甲基接受趨化蛋白［13-15］（Methyl-accepting chemotaxis proteins，MCPs）在激酶和反應(yīng)調(diào)節(jié)劑的磷酸轉(zhuǎn)移過程中涉及的保守的信號域有相似性。隨著科技的發(fā)展，基因組學(xué)的出現(xiàn)讓研究者了解到組氨酸激酶傳感器和MCPs之間的相似性。這2種傳感器蛋白共享胞內(nèi)感覺結(jié)構(gòu)域PAS（PER、ARNT、SIM）［16-19］、GAF（c-GMPspecific and-stimulated phosphodiesterases，Anabaena adenylate cyclases andEscherichia coliFhlA）［20，21］、HAMP（for histidine kinases，adenylyl cyclases，methyl-accepting proteins，and other prokaryotic signaling proteins）［22，23］，以 及 胞 外 感 覺 結(jié) 構(gòu) 域Cache、4HB（four-helix bundle，4HB）、CHASE（cyclase/histidine kinase-associated sensory extracellular）、NIT（Nitrate-and nitrite-sensing）。

在雙組分系統(tǒng)和化學(xué)傳感系統(tǒng)中的信號結(jié)構(gòu)域高度保守［24］，但其LBDs在一級序列和結(jié)構(gòu)方面多樣［25］，因此胞外感覺域蛋白幾乎沒有同一性［26］。本研究根據(jù)胞外感覺域的結(jié)構(gòu)特性主要介紹了Cache結(jié)構(gòu)域、CHASE結(jié)構(gòu)域、NIT結(jié)構(gòu)域以及4HB結(jié)構(gòu)域這4類胞外感覺結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特性以及結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。

1 Cache結(jié)構(gòu)域

1.1 Cache結(jié)構(gòu)域特征

Cache結(jié)構(gòu)域是原核生物中最常見的1種胞外感覺結(jié)構(gòu)域（圖1A），存在雙Cache結(jié)構(gòu)域（dCache）和單一Cache結(jié)構(gòu)域（sCache）2種形式，通常存在于雙組分組氨酸激酶和MCPs中。Cache結(jié)構(gòu)域由1個長的N末端螺旋和1個或2個球狀模塊組成。Cache結(jié)構(gòu)域最初作為細菌化學(xué)受體和動物鈣離子通道共有的配體結(jié)合域，同時也是抗神經(jīng)病變藥物的靶點。Cache結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合一些小的配體分子，比如：糖、有機酸和氨基酸等［27-29］。Cache家族中包含一些與PAS結(jié)構(gòu)域相似的PDC結(jié)構(gòu)域（PhoQ、DcuS、CitA），因此有研究者提出Cache結(jié)構(gòu)域和PAS結(jié)構(gòu)域具有同源性，并提出可能是PAS祖先早期作為胞外感覺域逐漸演化為現(xiàn)在的Cache結(jié)構(gòu)域［30］。

PhoQ傳感結(jié)構(gòu)域是類似于PAS的結(jié)構(gòu)域，二價陽離子可以抑制PhoQ的活性，抗菌肽可以激活PhoQ的活性。一般PAS結(jié)構(gòu)域有1個可以與小分子配體結(jié)合的凹槽，但PhoQ結(jié)構(gòu)域沒有。PhoQ結(jié)構(gòu)域是1個螺旋-轉(zhuǎn)角-螺旋（helix-turn-helix）的結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)特點形成了1個高負電荷的平面，帶負電荷的一面對著帶負電荷的磷脂雙層，一般需要鈣離子維持平衡。目前，已經(jīng)提出的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制是當(dāng)鈣離子消耗盡的時候，2個帶負電荷的面互斥激活激酶，引起下游反應(yīng)［31-33］。DcuS和CitA傳感器由胞外類PAS結(jié)構(gòu)域（PDC）、2個跨膜螺旋、細胞質(zhì)PAS結(jié)構(gòu)域和激酶結(jié)構(gòu)域組成。DcuS和CitA能夠結(jié)合不常見的C4—二羧酸鹽（左旋酒石酸鹽和右旋蘋果酸鹽）。

PDC結(jié)構(gòu)域的主要特征是在其中心位置存在5個反平行的β-片層支架，兩側(cè)各有1個α-螺旋。PDC的β-片層結(jié)構(gòu)與PAS的β-片層結(jié)構(gòu)相同，其他部分的結(jié)構(gòu)不同。雙PDC結(jié)構(gòu)域的形成是由膜遠端的PDC結(jié)構(gòu)域插在膜近端PDC結(jié)構(gòu)域的第一個螺旋和第二個螺旋之間［34］（圖1B）。

圖1 Cache結(jié)構(gòu)域在不同傳感器中的位置及Cache結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)

單核細胞趨化蛋白-N是1個保守的N末端結(jié)構(gòu)域，存在于幾種單核細胞趨化蛋白和含緩沖液的蛋白中。HAMP，發(fā)現(xiàn)于組氨酸激酶、腺苷酸環(huán)化酶、甲基結(jié)合蛋白和磷酸酶的1個結(jié)構(gòu)域。樹突狀細胞結(jié)構(gòu)域的主要特征是在其中心位置有4個反平行的β-折疊支架，每側(cè)有1個α-螺旋。DcuS感覺域的關(guān)鍵殘基是Arg107、His110和Arg147。

1.2 d Cache結(jié)構(gòu)域的功能

dCache結(jié)構(gòu)域是由2個串聯(lián)PAS樣亞結(jié)構(gòu)域組成，分為膜近端結(jié)構(gòu)域和膜遠端結(jié)構(gòu)域，具有dCache LBD的化學(xué)受體對配體的喜好不同。根據(jù)已有的研究表明，具有dCache LBD的化學(xué)受體識別氨基酸、有機酸、多胺、半乳糖和組胺等［35］。

dCache結(jié)構(gòu)域通過直接或間接的識別方式與小分子結(jié)合，通過直接識別的小分子通常與dCache的膜遠端亞結(jié)構(gòu)域結(jié)合，也有部分與膜近端結(jié)構(gòu)域結(jié)合；間接識別配體的方式通常是由底物結(jié)合蛋白介導(dǎo)的。

dCache型受體大部分通過膜遠端亞結(jié)構(gòu)域與配體結(jié)合的方式識別配體，在識別不同氨基酸時以類似于結(jié)合異亮氨酸的方式結(jié)合到膜遠端亞結(jié)構(gòu)域上。有研究表明，熒光假單胞菌CtaA LBD的配體結(jié)合口袋可以識別結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)上不同的氨基酸，配體結(jié)合口袋可以根據(jù)配體側(cè)鏈的大小膨脹或收縮［36］。CtaA LBD的蛋白質(zhì)側(cè)鏈（R126、W128、Y144、D146、D173）能夠識別配體氨基酸上不變的氨基和羧基部分。這5個殘基在dCache型化學(xué)受體中是保守的，能特異性識別氨基酸?？漳c彎曲桿菌CjTlp3 LBD與異亮氨酸相互作用時，配體完全被末端磷腺苷酸結(jié)構(gòu)域吞噬，在蛋白質(zhì)與配體的側(cè)鏈和主鏈部分之間形成廣泛的相互作用。對CjTlp3 LBD中與CtaA LBD對應(yīng)的5個保守殘基進行丙氨酸取代（圖2A），通過等溫滴定量熱法（Isothermal titration calorimetry，ITC）試驗驗證突變后的CjTlp3 LBD顯著降低了異亮氨酸結(jié)合的親和力［37］。同樣，對銅綠假單胞菌PctA LBD中與CtaA LBD對應(yīng)的5個保守殘基進行丙氨酸取代，通過ITC試驗驗證PctA LBD突變后顯著減少或消除了其與氨基酸的相互作用［38］。這些突變研究為這5個保守殘基在識別氨基酸中具有重要作用提供了證據(jù)。識別組胺的dCache型受體具有結(jié)構(gòu)相似性。在TlpQ受體中識別組胺的4個關(guān)鍵 殘基E170、Y208、D210和D239（圖2B），除D210外，其他3個殘基同樣存在于McpA受體中，這些殘基形成與TlpQ相似的配體口袋。在McpA受體中D210被Y174取代在組胺的咪唑環(huán)中引起空間位阻［39］。

現(xiàn)有文獻中，僅有少量結(jié)果證明配體與dCache結(jié)構(gòu)域膜近端亞結(jié)構(gòu)域的結(jié)合［40］。幽門螺桿菌TlpC LBD結(jié)合乳酸鹽是證明dCache結(jié)構(gòu)域通過膜近端結(jié)合配體的第一個例子，乳酸與TlpC的配體口袋（由 殘 基F202、L210、N213、I218、L223、Y249、L252、S253和Y285）結(jié)合（圖2C），乳酸鹽的羧基和羥基，N213、Y249和Y285的側(cè)鏈以及L252和S253的主鏈酰胺形成氫鍵，將N213、I218、Y285突變?yōu)楸彼?，Y249突變?yōu)楸奖彼?，通過圓二色譜試驗顯示氨基酸的突變沒有引起二級結(jié)構(gòu)的改變，并且ITC試驗表明這些氨基酸突變后與乳酸鹽的結(jié)合能力消失［40］。銅綠假單胞菌McpP受體的sCache結(jié)構(gòu)域以相似的親和力結(jié)合乳酸鹽。

圖2 化學(xué)受體傳感器的d Cache結(jié)構(gòu)域

1.3 sCache結(jié)構(gòu)域的功能

化學(xué)受體中含有大量的dCache結(jié)構(gòu)域和sCache結(jié)構(gòu)域，雖然這2種結(jié)構(gòu)域都可以結(jié)合有機酸，但是它們的配體分布不同。丁香假單胞菌的化學(xué)受體PscD含有sCache結(jié)構(gòu)域，能夠識別特定的C2和C3羧酸配體。丙酸酯通過羧基氧原子與sCache結(jié)構(gòu)域的4個殘基（Y90、H103、Y143和K156）以氫鍵的方式與受體結(jié)合。通過對一系列sCache結(jié)構(gòu)域序列進行比對，Y90、H103和K156 3個殘基是高度保守的［41］。KT2440細菌的化學(xué)受體McpP含有sCache結(jié)構(gòu)域，可以結(jié)合乙酸鹽、丙酮酸鹽和丙酸鹽，McpP基因的缺失導(dǎo)致這些配體的趨化性顯著降低［42］。銅綠假單胞菌受體PA2652的sCache結(jié)構(gòu)域能夠結(jié)合幾種C2取代的C4-二羧酸，并且通過ITC試驗表明PA2652只結(jié)合蘋果酸、檸檬酸、甲基琥珀酸的左旋異構(gòu)體，而不結(jié)合右旋異構(gòu)體［43］。

目前只鑒定了少數(shù)的Cache結(jié)構(gòu)域，其中大多數(shù)對單羧酸具有高度特異性。雖然Cache結(jié)構(gòu)域與PAS結(jié)構(gòu)域同源，但Cache結(jié)構(gòu)域的功能多樣性沒有得到充分研究。觀察以上幾種蛋白dCache中的關(guān)鍵殘基的組成可以發(fā)現(xiàn)，這些關(guān)鍵殘基集中分布在β-片層區(qū)域并且大多為極性氨基酸，因此猜測這些極性氨基酸的側(cè)鏈可能在結(jié)合配體中發(fā)揮重要作用。dCache結(jié)構(gòu)域通過幾種不同的直接或間接的機制結(jié)合配體，這些配體結(jié)合dCache結(jié)構(gòu)域的膜末端結(jié)構(gòu)域或膜近端結(jié)構(gòu)域或者二者兼有，由于這種多樣性，導(dǎo)致對不同的dCache結(jié)構(gòu)域是否共享同一種跨膜信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制仍不清楚。因此，還需對不同dCache結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)與功能進行研究與分析。

2 CHASE結(jié)構(gòu)域

2.1 CHASE結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)特性

CHASE結(jié)構(gòu)域是由200～230個氨基酸殘基組成的胞外LBD，存在于細菌、低等真核生物和植物的傳感器蛋白的N端或細胞外區(qū)域。在CHASE結(jié)構(gòu)域之后會連接PAS、GAF或受體結(jié)構(gòu)域等非酶結(jié)構(gòu)域，以及組氨酸激酶、腺苷酸環(huán)化酶、GGDEF和EAL結(jié)構(gòu)域［44］等酶信號結(jié)構(gòu)域。根據(jù)數(shù)據(jù)分析，CHASE的結(jié)構(gòu)與PAS、GAE以及Cache結(jié)構(gòu)域具有相似性，并且CHASE的結(jié)構(gòu)總是在2個跨膜區(qū)之間。目前，已經(jīng)鑒定了從CHASE2到CHASE8 7種CHASE結(jié)構(gòu)域。

CHASE2結(jié)構(gòu)域存在于多種細菌信號傳導(dǎo)途徑的傳感蛋白中，如組氨酸激酶、腺苷酸環(huán)化酶、二苷酸環(huán)化酶和絲氨酸/蘇氨酸激酶。通過SMART分析CHASE2結(jié)構(gòu)域（以Spirulinasubsalsa PCC 9445為例）可能連接非酶結(jié)構(gòu)域以及酶信號結(jié)構(gòu)域（圖3A）［45］。CHASE3結(jié)構(gòu)域（Spirulina platensis）一般存在于組氨酸激酶、甲基接受趨化蛋白、腺苷酸環(huán)化酶和二胍酸環(huán)化酶中，通常與PAS、HAMP和GAF這些非酶結(jié)構(gòu)域相結(jié)合（圖3B）。CHASE4結(jié)構(gòu)域只存在于信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白中，如傳感器組氨酸激酶和二鳥苷酸環(huán)化酶/磷酸二酯酶（Archaeoglobus fulgidis）（圖3C），部分CHASE4的蛋白質(zhì)含有HAMP［46］和PAS結(jié)構(gòu)域。

根據(jù)預(yù)測CHASE4結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合多種低分子配體，如細胞分裂素樣腺嘌呤衍生物或肽，并通過各自的受體介導(dǎo)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。另外，CHASE5、CHASE6、CHASE7以及CHASE8都存在于組氨酸激酶中，到目前還沒有對CHASE4結(jié)構(gòu)域的完整解析，因此利用Robetta server對CHASE4進行結(jié)構(gòu)預(yù)測（圖3D），從而可以根據(jù)預(yù)測的結(jié)構(gòu)特征對CHASE4的功能進行合理預(yù)測。

圖3 CHASE結(jié)構(gòu)域在不同傳感器中的位置及對CHASE4的結(jié)構(gòu)預(yù)測

2.2 CHASE結(jié)構(gòu)域的功能

CHASE結(jié)構(gòu)域可以識別環(huán)境中的許多信號，例如有機酸、氨基酸和根分泌物中的其他化學(xué)化合物［47，48］。植 物 傳 感 器AHK4的CHASE結(jié) 構(gòu) 域 是AHK4識別各種化學(xué)上不同細胞分裂素的重要結(jié)構(gòu)域，AHK4的配體結(jié)合口袋具有疏水殘基和極性殘基，已發(fā)現(xiàn)它們分別接觸脂肪族或芳香族尾基和極性腺嘌呤基團［49］。目前在AHK4結(jié)構(gòu)方面的研究有一些進展，但是AHK4識別細胞分裂素的分子機制還不清楚［50］。植物病原體黃單胞菌PcrK的CHASE結(jié)構(gòu)域（圖4A）與AHK4的結(jié)構(gòu)（圖4B）相似，結(jié)合細胞分裂素，以二聚體形式存在。PcrK的CHASE結(jié)構(gòu)域由2個PAS樣結(jié)構(gòu)域組成，與AHK4的不同在于PcrK的配體結(jié)合口袋大小受細胞分裂素限制。PcrK的配體結(jié)合口袋具有高度的疏水性，在14個氨基 酸（I114、P164、L167、V69、R175、T191、V194、L196、S197、Y199、L208、L210、W233和Y235）中有9個是疏水的，其余5個是極性或帶電荷的氨基酸［51］。PcrK二聚體結(jié)合來自植物的異戊烯基腺嘌呤（iP），L196突變導(dǎo)致PcrK的CHASE結(jié)構(gòu)域無法結(jié)合配體，Y191突變破壞識別配體所需構(gòu)象。同時通過ITC試驗證明單獨的PcrK無法與iP結(jié)合，可能需要1個尚未鑒定的分子幫助PcrK與iP結(jié)合［51］。

圖4 Pcr K和AHK 4的三維結(jié)構(gòu)

目前的研究表明［26］，CHASE結(jié)構(gòu)域一般以二聚體的形式存在，但研究者發(fā)現(xiàn)CHASE結(jié)構(gòu)域單體和二聚體同時存在，單體如何轉(zhuǎn)變成二聚體，是否與配體結(jié)合有關(guān)，尚不清楚。

3 NIT結(jié)構(gòu)域

3.1 NIT的結(jié)構(gòu)特性

NIT（Nitrate-and nitrite-sensing）結(jié)構(gòu)域是特異性識別硝酸鹽或亞硝酸鹽的1種結(jié)構(gòu)域。許多細菌都是通過將硝酸鹽還原成亞硝酸鹽，亞硝酸鹽進一步還原成銨來吸收硝酸鹽，也有一部分細菌將硝酸鹽當(dāng)成無氧呼吸時最終的氧化劑，因此NIT結(jié)構(gòu)域在細菌利用硝酸鹽的過程中發(fā)揮重要作用，同時還可以控制包括基因表達的調(diào)節(jié)、細胞運動性以及酶活性等多種生物活性。

NIT結(jié)構(gòu)域是在NasR蛋白中發(fā)現(xiàn)的，其長度約為200個氨基酸殘基。在許多的細菌中都能發(fā)現(xiàn)NIT結(jié)構(gòu)域，它與許多的調(diào)節(jié)輸出結(jié)構(gòu)域相關(guān)，比如，ANTAR（AmiR和NasR轉(zhuǎn)錄抗終止調(diào)節(jié)因子）、組氨酸激酶、甲基受體趨化蛋白、GGDEF和EAL等（圖5A）。NIT結(jié)構(gòu)域（圖5B）不同于其他的感覺域，例如PAS和GAF是單純的胞內(nèi)感覺結(jié)構(gòu)域，CHASE和Cache是單純的胞外感覺結(jié)構(gòu)域，但是NIT既可以作為胞內(nèi)感覺結(jié)構(gòu)域也可以作為胞外感覺結(jié)構(gòu)域［52］。

圖5 NIT結(jié)構(gòu)域在不同傳感器中的位置及NIT結(jié)構(gòu)域的三維結(jié)構(gòu)

3.2 NIT結(jié)構(gòu)域的功能

NasR蛋白是1種RNA結(jié)合蛋白，包含1個大的N端NIT結(jié)構(gòu)域和C端的RNA結(jié)合ANTAR結(jié)構(gòu)域，NIT結(jié)構(gòu)域?qū)⑾跛猁}和亞硝酸鹽的感知與多種轉(zhuǎn)錄和行為反應(yīng)相結(jié)合。之前已對硝酸鹽和亞硝酸鹽結(jié)合蛋白NarX進行研究，NarX輸入域是1個四螺旋束的二聚體，通過每個單體中保守的Arg殘基的氫鍵部分結(jié)合硝酸鹽。NasR蛋白的NIT結(jié)構(gòu)域與NarX輸入域的結(jié)構(gòu)和功能具有高的相似性。二聚的NIT結(jié)構(gòu)域的每個單體包含1個四螺旋束，在單體中的1對Arg殘基幾乎與NarX中的Arg殘基完全對應(yīng)［53］。NasR蛋白通過NIT結(jié)構(gòu)域接受硝酸鹽信號，ANTAR結(jié)構(gòu)域結(jié)合到RNA上激活nasF操縱子，引起硝酸鹽的同化作用。ANTAR的一些殘基與NIT結(jié)構(gòu)域中的殘基（Q204-N373、D201-R366、R193-E359、E191-R340和Q194-W362）通過形成氨基酸配對相互作用，形成自動抑制機制。通過突變破壞這些相互作用，可以將NIT結(jié)構(gòu)域與ANTAR結(jié)構(gòu)域分離［54］，由此可以猜測極性氨基酸在結(jié)合配體中發(fā)揮重要作用。

目前在很多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑并且能夠調(diào)節(jié)細胞功能的受體中檢測到NIT結(jié)構(gòu)域，在2個螺旋束的界面上關(guān)鍵的谷氨酰胺和精氨酸都是保守的，這是否意味著NIT結(jié)構(gòu)域在這些受體蛋白中同樣發(fā)揮識別硝酸鹽的功能或者具有識別其他配體的功能，還需進一步研究。

4 四螺旋束結(jié)構(gòu)域

4.1 四螺旋束的結(jié)構(gòu)特性

在組氨酸激酶傳感器的胞質(zhì)外發(fā)現(xiàn)的另一類常見的全α-螺旋感覺結(jié)構(gòu)域也被稱為四螺旋束結(jié)構(gòu)域（four-helix bundle 4HB）［55，56］。在第二個跨膜螺旋上并位于細胞質(zhì)末端的1個或多個芳香殘基可能參與脂質(zhì)-水界面相互作用，并調(diào)節(jié)跨膜信號［11］。含有4HB結(jié)構(gòu)域的化學(xué)受體一般是同型二聚體，它們有1個很大的周質(zhì)結(jié)構(gòu)域，由2個相同的反平行的四螺旋束組成。受體的跨膜區(qū)是由每個亞單位的2個跨膜α螺旋配對形成的單個反平行四螺旋束［57］。

在組氨酸激酶傳感器、MCPs、二鳥苷酸環(huán)化酶以及腺苷酸環(huán)化酶中都存在4HB結(jié)構(gòu)域。4HB位于2個跨膜螺旋之間，表明4HB結(jié)構(gòu)域只檢測細胞外的信號。最初是通過對細菌趨化性天冬氨酸受體的半胱氨酸和二硫鍵研究發(fā)現(xiàn)，4HB結(jié)構(gòu)與HAMP結(jié)構(gòu)域有非常密切的聯(lián)系，同二聚體HAMP的每個亞單位都有1個螺旋-連接體-螺旋結(jié)構(gòu)，該特點也成為HAMP結(jié)構(gòu)域的標(biāo)志［58］。位于膜遠端的4HB所感受到的外界信號，通過膜近端的平行4HB傳遞跨膜，然后與HAMP結(jié)構(gòu)域偶聯(lián)。現(xiàn)有的推測認為，信號傳輸是通過跨膜螺旋2相對于跨膜螺旋1的類似活塞的垂直位移發(fā)生的，信號傳遞的過程基本可分為3步：①膜遠端的4HB作為胞外感覺域結(jié)合配體；②將信號通過膜近端螺旋傳遞給胞質(zhì)HAMP結(jié)構(gòu)域；③再通過HAMP將信號轉(zhuǎn)換成界面信號傳遞給組氨酸激酶、腺苷酸環(huán)化酶等，將信號傳遞到下游作出相應(yīng)反應(yīng)［59，60］。

4.2 四螺旋束結(jié)構(gòu)域的功能

4HB結(jié)構(gòu)域是在原核生物中分布最廣泛的感覺結(jié)構(gòu)域，Tar和Tsr是研究4HB結(jié)構(gòu)域的主要模型，它們的4HB結(jié)構(gòu)域能夠識別天冬氨酸和絲氨酸［61，62］。在Tar和Tsr的二聚體界面上有2個配體結(jié)合位點，它們具有負協(xié)同性［63］，配體與其產(chǎn)生相互作用，穩(wěn)定二聚體的狀態(tài)。通過X射線衍射解析了Tar與配體復(fù)合物的結(jié)構(gòu)，發(fā)現(xiàn)結(jié)合結(jié)構(gòu)域中與天冬氨酸相互作用的關(guān)鍵殘基，在Tar-LBD的2個單體界面上各有1個天冬氨酸結(jié)合位點，其中1個結(jié)合位點 的 殘 基 由B鏈 的 殘 基R64、S68、Y149、F150、Q152、T154和Q155以及來自A鏈的殘基R69和R73形成，而在另1個位點處只發(fā)現(xiàn)了與水分子的結(jié)合［64］。在Tsr-LBD中的R64和T156的突變明顯地影響受體對絲氨酸的感知［65］，Tar或Tsr中R64的突變大大降低或消除了配體結(jié)合和趨化性。最近有研究發(fā)現(xiàn)新的具有4HB結(jié)構(gòu)域的化學(xué)受體PcaY_PP，PcaY_PP-LBD二聚體的2個配體結(jié)合位點全部結(jié)合高親和力的原兒茶酸鹽和奎寧酸鹽，低親和力的配體苯甲酸鹽和水楊酸鹽只能結(jié)合1個位點。PcaY_PP的LBD分別與大腸桿菌Tar和Tsr的LBD僅具有16%和10%的蛋白質(zhì)序列同一性。在PcaY_PP-LBD中的R71識別配體的羧基，同時配體口袋中有大量極性不帶電荷的殘基，即N75、S73、S78、Y135、Q142、N158和Q169（圖6），它們與結(jié)合的配體建立了許多氫鍵。R71的丙氨酸取代導(dǎo)致所有配體無法結(jié)合，N75的丙氨酸取代導(dǎo)致PcaY_PPLBD無法與原兒茶酸鹽和奎寧酸鹽結(jié)合，同時對其他配體的親和力降低［66］。根據(jù)對Tar和Tsr的LBD以及PcaY_PP LBD的配體口袋氨基酸的分析發(fā)現(xiàn)大部分的氨基酸由極性氨基酸組成，極性氨基酸的突變直接影響與配體的結(jié)合，猜測極性氨基酸在4HB結(jié)合口袋里發(fā)揮重要的作用。

圖6 PcaY_PP（PDB：6S1A）的三維結(jié)構(gòu)

盡管4HB是細菌信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)中分布最廣泛的細胞外感覺域，但是對4HB的所有了解幾乎都來自對Tar和Tsr的研究，那么具有4HB的其他受體中對應(yīng)Tar的R71是否同樣是結(jié)合配體的關(guān)鍵殘基，是否以相同的傳導(dǎo)機制發(fā)揮與Tar和Tsr相似的功能，還需要深入研究。

5 小結(jié)與展望

雙組分調(diào)節(jié)系統(tǒng)和化學(xué)傳感系統(tǒng)是細菌感知外界系統(tǒng)的重要組成部分，二者共享Cache結(jié)構(gòu)域、CHASE結(jié)構(gòu)域、NIT結(jié)構(gòu)域以及四螺旋束結(jié)構(gòu)域4種感覺結(jié)構(gòu)域。對Cache結(jié)構(gòu)域、CHASE結(jié)構(gòu)域、NIT結(jié)構(gòu)域以及四螺旋束結(jié)構(gòu)域4種感覺結(jié)構(gòu)域進行分析發(fā)現(xiàn)，Cache結(jié)構(gòu)域和CHASE結(jié)構(gòu)域的序列同源性最高。在CHASE結(jié)構(gòu)域中存在類似Cache結(jié)構(gòu)域的2個PAS樣結(jié)構(gòu)，根據(jù)這些相似性猜測Cache結(jié)構(gòu)域和CHASE結(jié)構(gòu)域可能具有相同的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機制。目前發(fā)表的文獻中CHASE結(jié)構(gòu)域多以二聚體形式結(jié)合小分子［25，26］，而天津大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院結(jié)構(gòu)生物學(xué)實驗室通過對CHASE4結(jié)構(gòu)域的研究，發(fā)現(xiàn)與已經(jīng)發(fā)表的CHASE結(jié)構(gòu)域不完全一致，其研究的CHASE4結(jié)構(gòu)域存在單體和二聚體2種狀態(tài)，并針對這種現(xiàn)象提出了2點猜測：一是CHASE4結(jié)構(gòu)域是在單體和二聚體共存的狀態(tài)下發(fā)揮作用，二是CHASE4結(jié)構(gòu)域在原核系統(tǒng)表達時受某種因素影響從部分二聚體體裂解成單體。針對以上2種猜測還需后續(xù)從功能以及結(jié)構(gòu)方向的研究進行驗證。NIT結(jié)構(gòu)域和四螺旋束結(jié)構(gòu)域都是由螺旋構(gòu)成，二者具有很高的相似性，這是否意味著二者會有相同的傳感機制仍需要深入研究。Cache結(jié)構(gòu)域、CHASE結(jié)構(gòu)域、NIT結(jié)構(gòu)域以及四螺旋束結(jié)構(gòu)域4種感覺結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體的關(guān)鍵殘基大多為極性氨基酸或疏水氨基酸并且在各感覺域中是高度保守的，猜測這些關(guān)鍵殘基的特性可能影響配體的種類。

本研究雖然對Cache結(jié)構(gòu)域、CHASE結(jié)構(gòu)域、NIT結(jié)構(gòu)域以及四螺旋束結(jié)構(gòu)域這4種感覺結(jié)構(gòu)域有一定的認識，但仍然存在一些問題沒有解決。對于Cache結(jié)構(gòu)域、CHASE結(jié)構(gòu)域、NIT結(jié)構(gòu)域的功能多樣化沒有進行深入的研究。目前，已經(jīng)了解雙組分傳感器和化學(xué)傳感器的工作模式，但對感覺結(jié)構(gòu)域捕捉到信號后的結(jié)構(gòu)變化以及整個受體蛋白是如何通過結(jié)構(gòu)變化將信號進行傳遞有待研究，未來基因組學(xué)的研究將會揭示更多信號與信號之間的關(guān)系，并進一步加深研究者對信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的理解。