謝蘭桂，袁淑勝，韓小旭，楊會英，趙 霞*，肖新月

（1.中國食品藥品檢定研究院，北京 100050；2.國家藥品監(jiān)督管理局藥用輔料質(zhì)量研究與評價重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100050）

藥用膠塞是藥品包裝材料中一類典型的密封制品，常與玻璃、陶瓷等包裝容器搭配使用，用于包裝藥用液體和固體制劑。藥用膠塞由橡膠配合適宜的助劑制備而成。膠塞中常用助劑有硫化劑、促進(jìn)劑、防老劑、填充劑、防焦劑、著色劑以及活性劑等。

硫代氨基甲酸鋅是常見的促進(jìn)劑[1]。然而，硫代氨基甲酸鋅可釋放游離仲胺，與亞硝化劑反應(yīng)生成N-亞硝胺[2]。亞硝胺可增大食道癌、咽癌、膀胱癌、肺癌、胃癌和白血病的患病風(fēng)險，也可能導(dǎo)致操作工人出現(xiàn)鼻出血、眼喉灼熱、聲音嘶啞、咳嗽、惡心和頭痛的癥狀。為保障橡膠產(chǎn)品生產(chǎn)者以及使用人員的健康和安全[3-4]，《化學(xué)藥品與彈性體密封件相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》[5]將硫代氨基甲酸鋅類化合物（包括二甲基二硫代氨基甲酸鋅、二乙基二硫代氨基甲酸鋅和二丁基二硫代氨基甲酸鋅[6]）列為藥用密封件慎用助劑，GB 9685—2016《食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》[7-8]將二乙基二硫代氨基甲酸鋅列為食品接觸材料及制品需要控制用量的助劑，并規(guī)定了二乙基二硫代氨基甲酸鋅最大使用量（占總基材質(zhì)量的百分比）不得超過1.5%。

雖然《化學(xué)藥品與彈性體密封件相容性研究技術(shù)指導(dǎo)原則（試行）》《食品接觸材料及制品用添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》對硫代氨基甲酸鋅類化合物有限量使用要求，但未收錄定量分析方法。檢索發(fā)現(xiàn)文獻(xiàn)中鮮有報道藥用膠塞中二丁基二硫代氨基甲酸鋅的定量分析方法，而類似化合物二甲基二硫代氨基甲酸鋅的定量分析方法有化學(xué)分析法[9]、快速比色法、高效液相色譜（HPLC）法?；瘜W(xué)分析法[10]和快速比色法[11]干擾因素多，不適合作為精準(zhǔn)定量分析方法。HPLC法準(zhǔn)確、高效[12-13]，更適合作為藥用膠塞的質(zhì)量控制手段，也方便今后建立標(biāo)準(zhǔn)分析方法。二丁基二硫代氨基甲酸鋅為金屬螯合物，即為2個或多個配體與同一金屬離子形成螯合環(huán)配合物。金屬螯合物在HPLC上的保留行為并不理想[14-15]，譜峰拖尾、穩(wěn)定性差，出現(xiàn)多個譜峰是常見現(xiàn)象[16]。本研究通過排除不穩(wěn)定因素，建立了可簡便、準(zhǔn)確、穩(wěn)定、經(jīng)濟(jì)地定量分析二丁基二硫代氨基甲酸鋅的HPLC方法，為建立二丁基二硫代氨基甲酸鋅的標(biāo)準(zhǔn)分析方法奠定基礎(chǔ)。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 試劑和樣品

二丁基二硫代氨基甲酸鋅對照品，中國食品藥品檢定研究院提供；四氫呋喃，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；乙腈，色譜純，美國霍尼韋爾公司產(chǎn)品；純化水，自制；液氮，北京普萊克斯實(shí)用氣體有限公司產(chǎn)品；藥用膠塞（3批），某企業(yè)產(chǎn)品。

1.2 儀器

Mettler XS205DU 型電子天平，美國梅特勒-托利多公司產(chǎn)品；HPLC儀，美國沃世特公司產(chǎn)品。

2 結(jié)果與討論

2.1 HPLC測試條件優(yōu)化

2.1.1 優(yōu)選色譜柱

從分離類型和經(jīng)濟(jì)角度出發(fā)，考察了2種色譜柱的分離效果。A號色譜柱為Sunfire C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，美國沃世特公司產(chǎn)品），搭配的流動相為四氫呋喃-乙腈（35∶65）（體積比，下同）；B號色譜柱為離子色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm，天津博納艾杰爾科技有限公司產(chǎn)品），搭配的流動相為甲醇-磷酸二氫銨水溶液（90∶10）。

結(jié)果顯示：A號色譜柱的出峰時間穩(wěn)定，譜峰峰形尖銳；B號色譜柱的出峰時間漂移，且可見解離峰。因此，選擇Sunfire C18色譜柱進(jìn)行檢測。

2.1.2 優(yōu)選溶劑

二丁基二硫代氨基甲酸鋅溶于苯、四氯化碳、氯仿、二硫化碳，微溶于醋酸乙酯、丙酮，不溶于水[17-18]。為建立適用于二丁基二硫代氨基甲酸鋅的HPLC分析方法，首先應(yīng)探索其在常規(guī)HPLC分析用溶劑中的溶解性。

經(jīng)過了近三年的數(shù)百次試驗(yàn)、改進(jìn)，全色系的水醇體系油墨最終研制成功，并在一些企業(yè)應(yīng)用。同時，配套研發(fā)了干燥裝置、回收裝置。由于從源頭解決了絕大多數(shù)VOCs的排放問題，所以過程控制和回收裝置使用相對簡單，成本低、效果好，不但做到了印刷現(xiàn)場VOCs排放雙達(dá)標(biāo)（經(jīng)第三方檢測），而且不用改版，印刷質(zhì)量完全達(dá)到溶劑油墨的效果，印刷速度達(dá)到溶劑油墨的80%以上，油墨的使用成本也低于溶劑油墨。由于VOCs排放完全達(dá)標(biāo)，解決了環(huán)境污染的困擾，因此使用廠家數(shù)量不斷增加。預(yù)計，隨著這種新型環(huán)保油墨的不斷推廣，軟包裝領(lǐng)域的VOCs污染問題可以得到解決。

本工作考察了二丁基二硫代氨基甲酸鋅對照品在甲醇、乙腈、四氫呋喃3種溶劑中的溶解性。通過配制質(zhì)量濃度為0.75 mg·mL-1的對照品溶液得出，二丁基二硫代氨基甲酸鋅在甲醇中不易溶解，在乙腈中可超聲溶解，在四氫呋喃中易溶解。考慮到四氫呋喃對液相體系有一定的腐蝕作用，不適合使用純四氫呋喃溶解對照品，因此使用四氫呋喃與乙腈混合溶劑溶解對照品。配比試驗(yàn)結(jié)果顯示，對照品在四氫呋喃-乙腈（10∶90）中溶解良好，因此選擇四氫呋喃-乙腈（10∶90）作為溶劑。

2.1.3 優(yōu)化流動相

在相同色譜條件（Sunfire C18柱，流動相流速1 mL·min-1，波長 254 nm，柱溫 30 ℃，進(jìn)樣量 2 μL）下，參考相關(guān)文獻(xiàn)，考察了甲醇-磷酸二氫銨水溶液（90∶10）、四氫呋喃-乙腈-磷酸二氫銨（25∶50∶25）、四氫呋喃-甲醇（35∶65）、四氫呋喃-乙腈（35∶65）4種流動相對二丁基二硫代氨基甲酸鋅對照品HPLC行為的影響。

試驗(yàn)結(jié)果顯示，在4種流動相中，二丁基二硫代氨基甲酸鋅均可出峰。在甲醇-磷酸二氫銨水溶液（90∶10）、四氫呋喃-乙腈-磷酸二氫銨（25∶50∶25）流動相中，二丁基二硫代氨基甲酸鋅出現(xiàn)不同程度的解離，其原因是二丁基二硫代氨基甲酸鋅為金屬螯合物[19-20]，配體二丁基二硫代氨基甲酸與金屬離子鋅形成了4個配位鍵[21]，其中2個配位鍵由配體上酸性基團(tuán)解離去H＋后與金屬離子鋅配位形成，另兩個配位鍵由2個配體上含孤電子對S與金屬離子鋅配位形成。二丁基二硫代氨基甲酸配體與金屬離子鋅配合后形成四原子環(huán)，四元環(huán)是熱力學(xué)不穩(wěn)定體系，易發(fā)生解離，且即使溶劑體系中含有緩沖鹽也難以抑制其解離。

考慮到解離需要適宜的溶劑環(huán)境，嘗試除去水相環(huán)境抑制解離，采用四氫呋喃-甲醇（35∶65）、四氫呋喃-乙腈（35∶65）兩種流動相進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果顯示，在上述兩種流動相中，二丁基二硫代氨基甲酸鋅的解離均可被抑制。在四氫呋喃-甲醇（35∶65）中，二丁基二硫代氨基甲酸鋅的HPLC峰易發(fā)生漂移，穩(wěn)定性差；在四氫呋喃-乙腈（35∶65）中，二丁基二硫代氨基甲酸鋅的HPLC峰穩(wěn)定性良好。因此，選擇四氫呋喃-乙腈（35∶65）作為流動相。

綜上所述，確定優(yōu)化HPLC測試條件為：色譜柱 SunFire C18（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱溫30 ℃，進(jìn)樣量 2 μL，流動相 四氫呋喃-乙腈（35∶65），流動相流速 1 mL·min-1，檢測器 紫外線檢測器，波長 254 nm。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 線性回歸方程

精確稱取37.5 mg二丁基二硫代氨基甲酸鋅對照品，置于50 mL容量瓶中，用四氫呋喃-乙腈（10∶90）溶解并稀釋定容至刻度，搖勻溶液，作為貯備液。

2.2.2 精密度

吸取適量貯備液，依次稀釋為質(zhì)量濃度為750，500，250 μg·mL-1的系列對照品溶液，分別取各對照品溶液2 μL進(jìn)行測試，重復(fù)測試3次，結(jié)果見表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果Tab.1 Precision test results

由表1可知，3種質(zhì)量濃度的對照品溶液的譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于3%，表明測試精密度高。

2.2.3 穩(wěn)定性

配制質(zhì)量濃度為500 μg·mL-1的對照品溶液，分別在放置0，2，4，6 h時進(jìn)行測試，記錄HPLC峰面積。結(jié)果顯示，這4個時間點(diǎn)測試的譜峰面積的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.6%，表明供試品溶液在6 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.2.4 檢出限和定量限

取質(zhì)量濃度為20 μg·mL-1對照品溶液逐步稀釋并進(jìn)行檢測，信噪比為10時得到定量限，信噪比為3時得到檢出限。計算得出檢出限為20 ng，定量限為30 ng。按二乙基二硫代氨基甲酸鋅限量使用要求（≤1.5%），本方法檢出限和定量限可滿足檢測要求。

2.2.5 回收率

藥用膠塞經(jīng)液氮脆化處理后，分別置于粉碎機(jī)中粉碎成末。稱取膠塞樣品置于錐形瓶中，平行制備9份（每份約350 mg）。每3份膠塞樣品中分別加入約3，5，6 mg的二丁基二硫代氨基甲酸鋅，然后加入10 mL四氫呋喃-乙腈（10∶90）超聲提取60 min（分2次完成）。按優(yōu)化色譜條件對提取液進(jìn)樣測試，計算回收率，結(jié)果見表2。

表2 回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Recovery test results

由表2可知，高、中、低加標(biāo)回收率試驗(yàn)的回收率在98.84%～102.58%范圍內(nèi)，平均回收率為101.03%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.17%，表明本方法準(zhǔn)確性良好。

2.3 藥用膠塞檢測

3批藥用膠塞經(jīng)液氮脆化處理后，分別置于粉碎機(jī)中粉碎成末。稱取適量膠塞樣品置于錐形瓶中，加入四氫呋喃-乙腈（10∶90）超聲萃取60 min（分2次完成）。按上述建立的HPLC方法對提取液進(jìn)行測試，即對3批藥用膠塞樣品中二丁基二硫代氨基甲酸鋅的殘留量進(jìn)行測試。結(jié)果顯示，3批藥用膠塞中均未檢出二丁基二硫代氨基甲酸鋅。

2.4 適用性

金屬螯合物的解離行為與HPLC行為密切相關(guān)。本研究在確認(rèn)測試方法后，進(jìn)一步探究了不同配體取代基對螯合物配合穩(wěn)定性的影響。對3種硫代氨基甲酸鋅鹽（二丁基二硫代氨基甲酸鋅、二乙基二硫代氨基甲酸鋅和二甲基二硫代氨基甲酸鋅）的解離行為進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)其配體與金屬離子的配合穩(wěn)定性從高到低的順序?yàn)槎』虼被姿徜\、二乙基二硫代氨基甲酸鋅、二甲基二硫代氨基甲酸鋅。其原因在于3種配體上取代基（丁基、乙基和甲基）的差異影響螯合物的穩(wěn)定性。丁基、乙基和甲基為給電子基團(tuán)，給電子能力越強(qiáng)的基團(tuán)可給氮提供更充分的電子，從而使得配體的堿強(qiáng)度增大和螯合能力增強(qiáng)，有助于螯合物穩(wěn)定。丁基、乙基和甲基的給電子能力順序減弱，這與3種硫代氨基甲酸鋅鹽的配體與金屬離子的配合穩(wěn)定性高低順序一致。

本研究建立的HPLC法還適用于二乙基二硫代氨基甲酸鋅的定量分析，但不適用于二甲基二硫代氨基甲酸鋅的定量分析，這表明對于配體與金屬離子的配合相對穩(wěn)定的金屬螯合物，可通過抑制解離實(shí)現(xiàn)其HPLC分析，但對于配體與金屬離子的配合穩(wěn)定性較差的金屬螯合物，很難通過抑制解離方式對其進(jìn)行HPLC分析。

3 結(jié)論

本研究建立了HPLC法測定藥用膠塞中二丁基二硫代氨基甲酸鋅的殘留量的方法，填補(bǔ)了當(dāng)前該方面檢測的空白。該方法簡便、準(zhǔn)確、靈敏、穩(wěn)定，適用于二丁基二硫代氨基甲酸鋅的分析和檢測。實(shí)際藥用膠塞產(chǎn)品檢測證明該方法適用性良好。該方法為膠塞類藥品包裝材料的質(zhì)量監(jiān)測提供了有效的技術(shù)手段。