李艷民 袁德義 葉天文 陳 雅 韓春霞 肖詩鑫

(經(jīng)濟(jì)林培育與保護(hù)教育部重點實驗室 經(jīng)濟(jì)林育種與栽培國家林業(yè)和草原局重點實驗室 中南林業(yè)科技大學(xué) 長沙 410004)

油茶(Camelliaoleifera)為山茶科(Theaceae)山茶屬(Camellia)植物，是我國南方重要的木本食用油料樹種(莊瑞林， 2008)。近年來，油茶產(chǎn)業(yè)備受重視，但是油茶生產(chǎn)上普遍存在產(chǎn)量不高、大小年明顯的問題，嚴(yán)重影響了農(nóng)民生產(chǎn)的積極性。究其原因是目前我國油茶良種主要為普通油茶物種，基本都是從野生普通油茶或地方品種中選優(yōu)而來，豐產(chǎn)穩(wěn)產(chǎn)且適應(yīng)性強(qiáng)的品種較少。長期的選擇育種會大大縮小物種的基因庫，降低物種的遺傳變異，增加物種對環(huán)境脅迫的敏感性(Klaudiaetal., 2018)，已經(jīng)成為油茶育種工作中迫切需要解決的難題。因此，在油茶育種中急需通過雜交，尤其是種間雜交來引入優(yōu)良的遺傳信息，豐富油茶的遺傳變異。

雜交育種是油茶遺傳改良的一項重要措施，然而一直以來育種工作進(jìn)展緩慢，主要原因是目前我國油茶雜交育種研究仍是集中在種內(nèi)不同性狀互補(bǔ)間的雜交(林萍等， 2017)，種間雜交相關(guān)研究相對較少(何華， 2016)。雖然種內(nèi)雜交在育種中容易實現(xiàn)，但變異幅度通常有限。而種間雜交能極大程度地擴(kuò)展和豐富育種篩選的基因庫，有力地促進(jìn)各種異源優(yōu)良基因的交流，因而能夠融合出具有各種優(yōu)良性狀的新變異類型，創(chuàng)造出良種選育所需要的新種質(zhì)(Masonetal., 2015; Kartaletal., 2020)。因此，開展普通油茶與其近緣種的種間雜交將有力推動油茶品種改良進(jìn)程。然而，由于對油茶細(xì)胞遺傳學(xué)研究不足，對油茶雜交過程中的細(xì)胞遺傳學(xué)規(guī)律也缺乏研究，加上油茶倍性復(fù)雜，給油茶種間雜交育種工作帶來了極大的困難。

核型分析是指對染色體條數(shù)和形態(tài)結(jié)構(gòu)以及帶型等參數(shù)進(jìn)行的分析，不但可以幫助我們從細(xì)胞學(xué)的角度了解植物的遺傳組成和變異規(guī)律，而且還可以為真假雜種的辨別、倍性育種的成果鑒定、物種起源與演化的探討、以及不同物種間親緣關(guān)系的分析提供十分重要的參考價值，為植物分類以及種質(zhì)創(chuàng)新提供一定的細(xì)胞遺傳學(xué)依據(jù)(徐順超等， 2012)。目前，核型分析已被廣泛應(yīng)用于小麥(Triticumaestivum)(Orlovskayaetal., 2020)、棉屬(Gossypium)(Yescas-Romoetal., 2021)、櫻桃(Cerasuspseudocerasus)(Wangetal., 2018)和山核桃(Caryacathayensis)(徐川梅等， 2017)等植物的育種研究中。自20世紀(jì)80年代掀起的山茶屬植物核型研究熱潮，取得了良好的進(jìn)展(孫靜賢等， 2019； 葉天文等， 2020)，然而，國內(nèi)外關(guān)于油茶種間雜交的核型研究卻鮮有報道。攸縣油茶(Camelliayuhsienensis)具有春季開花、抗炭疽病、果皮薄、油具芳香及富含維生素E等優(yōu)異特性，是油茶育種中非常珍貴的遺傳資源(莊瑞林， 2008； Nieetal., 2020)，是油茶遠(yuǎn)緣雜交育種中是春花、薄皮和抗炭疽病基因的主要來源。前期本課題組創(chuàng)制了一批攸縣油茶和普通油茶的雜交后代，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，雜交子代存在顯著的性狀分離和倍性變異，產(chǎn)生了具有超親優(yōu)勢的優(yōu)株和非整倍體資源(陳雅， 2020； Lietal., 2021)，但其在染色體核型上是否存在變異還尚未研究。為進(jìn)一步探究油茶種間雜交過程中的細(xì)胞遺傳學(xué)規(guī)律，本研究通過對‘攸雜2’ × ‘華碩’雜交親本及子代進(jìn)行染色體核型分析和似近系數(shù)聚類分析，明確雜交子代的染色體核型變異和遺傳組成，以期為探明油茶種間雜交過程中的染色體遺傳規(guī)律和為后續(xù)雜交育種研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 ‘攸雜2’(YZ2)為攸縣油茶后代優(yōu)株，具有攸縣油茶春季開花、皮薄、油香、抗炭疽病等優(yōu)異特性，而普通油茶‘華碩’(HS)為國審大果、豐產(chǎn)普通油茶品種，但是皮厚且不抗炭疽病。本研究以‘攸雜2’ × ‘華碩’雜交后代群體為材料(18個優(yōu)良單株分別命名為YH-1、YH-2、…、YH-18)，染色體制片所采用的植物材料為幼嫩莖尖和扦插苗根尖。植物材料均采自中南林業(yè)科技大學(xué)生科樓樓頂，長勢良好，位于112° 59′ 31″E，28° 8′ 11″N，海拔約80 m，全年平均氣溫17.2 ℃，年平均降水量1 361.6 mm。土壤為紅壤。

1.2 試驗方法 1) 染色體標(biāo)本制備 于晴朗溫和天氣，取生長狀態(tài)良好的扦插苗根尖，在冰水中清洗干凈。再用0.002 mol·L-1的8-羥基喹啉在20 ℃ 環(huán)境中避光處理5 h，隨后用蒸餾水沖洗干凈再置于新配制的卡諾氏固定液(95%乙醇∶冰醋酸 = 3∶1, V/V)中于4 ℃ 冰箱中固定24小時。將固定后的根尖于0.075 mol·L-1的KCl溶液中處理60 min。隨后用酶液(1.75%纖維素酶∶1.75%果膠酶 = 1∶1，V/V)于25 ℃ 恒溫條件下黑暗處理2 h。將酶解后的根尖洗凈后于蒸餾水中后低滲30 min。最后將根尖置于固定液中處理30 min備用。用滴管吸取3～4個根尖于載玻片上，在解剖鏡下剔除分生區(qū)以外的部分后快速用寬頭鑷子搗成漿狀，輕輕吹散并迅速在酒精燈上干燥。待玻片冷卻后，吸取50 μL卡寶品紅染液進(jìn)行染色10 s后隨即在OLYMPUS顯微鏡下鏡檢并拍照記錄。

2) 染色體核型分析 每個樣品選取5張染色體分散且形態(tài)清晰的中期分裂相，利用Image J和核型分析軟件對圖片進(jìn)行處理和染色體測量、配對。根據(jù)李懋學(xué)等(1985)的標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行核型分析。主要核型參數(shù)計算如下：

CLR = LC/SC。

CLR，染色體長度比；LC，最長染色體長度；SC，最短染色體長度。

AR = LA/SA。

AR，臂比；LA，長臂；SA，短臂。

CI = SA/TLC。

CI，著絲粒指數(shù)；SA，短臂；TLC，該染色體總長度。

As. K = TLLA / TCL × 100%。

As. K，核型不對稱系數(shù)；TLLA，長臂總長；TCL，全組染色體總長。

3) 核型似近系數(shù)聚類分析 核型似進(jìn)系數(shù)及進(jìn)化距離依照譚遠(yuǎn)德等(1993)的方法，主要依據(jù)的核型參數(shù)為配子的染色體數(shù)、染色體相對長度、著絲粒指數(shù)、臂比值以及平均數(shù)、方差、極差等，采用李峰等(2005)設(shè)計的核型似近系數(shù)聚類分析軟件計算親本‘攸雜2’與‘華碩’及其種間雜交子代18個優(yōu)良單株的核型似近系數(shù)及遺傳距離并進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及雜交子代核型分析 親本及雜交子代核型參數(shù)分析結(jié)果如表1所示，核型模式圖如圖1所示。

表1 親本及雜交子代核型參數(shù)Tab.1 Karyotype parameters of parents and hybrids

圖1 親本和雜交后代的染色體制片(左)、核型圖(中)及核型模式圖(右)Fig. 1 Photomicrographs of metaphase chromosome (left), karyogram (middle) and ideogram (right) of parents and hybrids

母本‘攸雜2’(YZ2)核型分析結(jié)果： ‘攸雜2’染色體條數(shù)為2n = 91，為非整倍體，核型公式為2n = 91 = 53m (4SAT) + 38sm (2SAT)，由53條中部著絲粒(m)染色體和38條近中部著絲粒(sm)染色體，具有3對隨體； 其染色體相對長度變化范圍為1.26%～2.97%，其中有6條長染色體(L)、40條中長染色體(M2)、38條中短染色體(M1)和7條短染色體(S)； 平均臂比值為1.67，其中臂比值大于2的染色體比例為17.8%，染色體長度比為2.36，核型不對稱系數(shù)為62.36%，著絲粒指數(shù)的變異幅度為29.86%～44.04%，核型類型為2B型。

父本‘華碩’(HS)核型分析結(jié)果： ‘華碩’染色體條數(shù)為2n = 90，核型公式為2n = 90 = 62m (2SAT) + 28sm (4SAT)，由62條中部著絲粒(m)染色體和28條近中部著絲粒(sm)染色體，具有3對隨體； 其染色體相對長度變化范圍為1.50%～3.00%，其中有6條長染色體(L)、40條中長染色體(M2)、42條中短染色體(M1)和2條短染色體(S)； 平均臂比值為1.48，其中臂比值大于2的染色體比例為4.4%，染色體長度比為2.00，核型不對稱系數(shù)為59.38%，著絲粒指數(shù)的變異幅度為32.14%～47.15%，核型類型為2B型。

18個雜交子代單株核型分析結(jié)果： 18個雜交子代單株中有11份染色體數(shù)目為90，6份染色體數(shù)目為91，1份染色體數(shù)目為92，雜交子代間染色體形態(tài)特征存在差異。研究發(fā)現(xiàn)其中絕大部分雜交子代的核型參數(shù)介于父本與母本之間。雜交子代的染色體類型仍是以m型和sm型染色體為主，其中YH-7和YH-12還含有少量st型染色體，均有隨體； 大部分雜交子代中不同類型染色體條數(shù)所占的比例是m > sm > st，與父本‘華碩’和母本‘攸雜2’相同，但同時也出現(xiàn)sm型染色體數(shù)目大于m型染色體數(shù)目的特殊情況(YH-14、YH-18)； 雜交子代的平均臂比值均高于父本‘華碩’，而更傾向與母本‘攸雜2’ ； 雜交子代的核型不對稱系數(shù)變異范圍為61.01%～63.38%，均高于父本‘華碩’，大多數(shù)介于父母本之間,但同時也出現(xiàn)部分雜交子代的核型不對稱系數(shù)大于親本的變異種質(zhì)(YH-1、YH-13、YH-14、YH-17和YH-18)； 核型類型為2A型的有6份，占33.3%，2B型的有12份，占66.7%。

表2 核型似近系數(shù)與進(jìn)化距離①Tab.2 Similarity coefficient of karyotype and evolutionary distance

圖2 核型似近系數(shù)和進(jìn)化距離聚類圖Fig. 2 Karyotype proximity coefficient and evolutionary distance clustering graph

2.2 核型似近系數(shù)及聚類分析 核型似近系數(shù)與進(jìn)化距離分析結(jié)果能很好地反映試驗材料的親緣關(guān)系，本研究根據(jù)親本及雜交子代的染色體數(shù)及相對長度等一系列核型參數(shù)為指標(biāo)計算種間雜交群體核型似近系數(shù)及遺傳距離，結(jié)果表明： 雜交子代當(dāng)中YH-3和YH-4之間的核型似近系數(shù)最大(0.998 2)而核型進(jìn)化距離最小(0.001 8)，表明YH-3和YH-4之間的親緣關(guān)系最近； 母本‘攸雜2’與雜交子代YH-3的核型似近系數(shù)最大為0.996，進(jìn)化距離為0.004，與雜交子代YH-14的核型似近系數(shù)最小為0.961 6，進(jìn)化距離為0.039 2，這表明在雜交子代中YH-3與母本‘華碩’的親緣關(guān)系最近而YH-14與‘攸雜2’親緣關(guān)系最遠(yuǎn)； 父本‘華碩’與雜交子代YH-11的核型似近系數(shù)最大為0.979 5，進(jìn)化距離為0.020 7，與雜交子代YH-14的核型似近系數(shù)最小為0.938 8，進(jìn)化距離為0.063 1，這表明在雜交子代當(dāng)中YH-11與父本‘華碩’親緣關(guān)系最近而YH-14與父本‘華碩’親緣關(guān)系最遠(yuǎn)； 此外，母本‘華碩’與父本‘華碩’的核型似近系數(shù)較小，為0.962 8，進(jìn)化距離為0.037 9，表明親緣關(guān)系也較遠(yuǎn)。

采用李峰等設(shè)計的核型似近系數(shù)聚類分析軟件對‘攸雜2’和‘華碩’及其雜交子代18個優(yōu)良單株進(jìn)行聚類分析并繪制聚類圖(圖2)，結(jié)果顯示： 在核型似近系數(shù)為0.966 0，距離系數(shù)為0.034 0時，可分為兩大類： 父本‘華碩’與YH-11、YH-15聚為一類，母本‘攸雜2’與其余的所有雜交子代可聚為一類； 在核型似近系數(shù)為0.974 5，距離系數(shù)為0.025 5時，可分為三大類： 其中母本‘攸雜2’可與YH-1、YH-2、YH-3、YH-4、YH-5、YH-6、YH-7、YH-8、YH-9、YH-10、YH-12、YH-13、YH-16、YH-18歸為一類，父本‘華碩’與YH-11、YH-15聚為一類，雜交子代YH-14和YH-17聚為一類。聚類結(jié)果表明大部分子代單株的核型與母本‘攸雜2’的核型更相似，親緣關(guān)系更近； 其中，雜交子代YH-11和YH-15的核型相對而言與父本‘華碩’的核型更相似，親緣關(guān)系更近； 此外，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)核型似近系數(shù)為0.974 5，距離系數(shù)為0.025 5時，雜交子代YH-14和YH-17在一定程度上與親本的核型差異較大，親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，可單獨聚為一類。

3 討論

染色體核型分析可以為研究物種間的親緣及進(jìn)化關(guān)系和遺傳多樣性提供一定的參考依據(jù)。本研究中，父本‘華碩’為普通油茶，核型類型為2B型，平均臂比值為1.48，核型公式為2n = 6x =90= 62m (2SAT) + 28sm (4SAT)，這與前人報道的普通油茶核型(2n = 6x = 90 =60m + 22sm + 8st和2n = 6x = 90 = 60m + 29sm (3SAT) + 1st)均存在較大差異(李光濤， 2001)，主要為本研究中未發(fā)現(xiàn)st型染色體以及存在3對隨體，推測其可能是由于同一物種不同栽培品種的核型會存在一定的差異所導(dǎo)致。同時制片的質(zhì)量也會對核型參數(shù)的測量產(chǎn)生較大的影響，為了避免因制片質(zhì)量帶來的誤差，本研究采用改良后的去壁低滲法替代傳統(tǒng)的壓片法，獲得的制片染色體分散，形態(tài)清晰，提高了核型分析結(jié)果的準(zhǔn)確性。作為同一品種，本研究中‘華碩’的核型與葉天文等(2020)報道的核型(2n = 6x = 90 = 63m (3SAT) + 27sm)差異較小，證明了該方法在研究油茶染色體核型中具有較高的可靠性，同時，較小的差異也表明常規(guī)的染色體核型分析存在一定的局限性，由于油茶遺傳背景相對復(fù)雜，許多非同源染色體形態(tài)相近，在研究核型時同源配對較為困難，對核型分析的準(zhǔn)確性會產(chǎn)生一定的影響，需要觀察更多的分裂相或結(jié)合分帶及熒光原位雜交等技術(shù)以消除誤差。此外，葉天文等(2020)在繪制‘華碩’核型圖時，依照同源配對原則，將染色體分為15對，每對6條； 根據(jù)前人的研究(秦聲遠(yuǎn)等， 2018)筆者認(rèn)為普通油茶應(yīng)為異源多倍體，且課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，‘華碩’減數(shù)分裂終變期染色體配對主要為二價體(Lietal., 2021)，因此，本研究認(rèn)為應(yīng)該將染色體分為45對，每對2條。但目前仍沒有充分的證據(jù)證明普通油茶為異源六倍體，且其染色體組成與二倍體祖先種至今仍不清晰，需利用熒光原位雜交和分子標(biāo)記等技術(shù)進(jìn)行更深入的探究。

前人研究認(rèn)為，種間雜交可能會導(dǎo)致高頻的核型變異(Douetal., 2017)。本研究首次對油茶種間雜交群體的核型進(jìn)行比較分析，其核型特征與前人對山茶屬植物的核型研究結(jié)果相一致，即以m型染色體占大多數(shù)，其次為sm型，少數(shù)有st型，尚未發(fā)現(xiàn)t型(張文駒等， 1999)。但在雜交子代中出現(xiàn)個別單株的sm型染色體數(shù)目大于m型染色體數(shù)目(YH-14、YH-18)。而且，在種間雜交群體中，雖大多數(shù)雜交子代的核型參數(shù)介于親本之間，但也有部分雜交子代的核型參數(shù)產(chǎn)生較大的變異，其原因可能是由于種間雜交過程中發(fā)生染色體重組或減數(shù)分裂過程中異常的染色體行為導(dǎo)致(陳瓊等， 2007； Amosovaetal., 2017)。染色體融合和分裂重排被認(rèn)為是影響植物核型結(jié)構(gòu)的重要因素之一(Mandkovetal., 2013; Fonsecaetal., 2016; Suseketal., 2016)，易位、倒位、重復(fù)以及缺失等染色體結(jié)構(gòu)異常往往會引發(fā)染色體形態(tài)發(fā)生變化而導(dǎo)致核型變異，進(jìn)而對物種的進(jìn)化產(chǎn)生影響(Tzanoudakis, 1983)。

Stebbins(1971)指出高等植物核型進(jìn)化的基本趨勢是由對稱向不對稱方向發(fā)展。本研究中親本和種間雜交群體的不對稱系數(shù)變異幅度為59.38% ～ 63.38%，核型不對稱系數(shù)較大，屬于較為進(jìn)化的類群。其中父本‘華碩’的核型不對稱系數(shù)最小(59.38%)，母本‘攸雜2’為62.38%，表明在山茶屬植物系統(tǒng)發(fā)育中攸縣油茶較普通油茶更為進(jìn)化。雜交子代的核型不對稱系數(shù)大多介于父母本之間，但也出現(xiàn)部分雜交子代的核型不對稱系數(shù)大于親本，說明其在進(jìn)化程度上高于雙親，這與張素勤等(2018)對小麥與野燕麥(Avenafatua)遠(yuǎn)緣雜交群體的研究類似，表明種間雜交能夠產(chǎn)生比親本更為進(jìn)化的子代，從而可以豐富油茶的遺傳背景及種質(zhì)資源。但是長期以來，由于山茶屬倍性復(fù)雜多樣、同源染色體間差異不明顯、雜合度較高，導(dǎo)致僅從傳統(tǒng)核型角度難以準(zhǔn)確研究同一組內(nèi)該屬植物的系統(tǒng)進(jìn)化(李光濤， 2001)，還需結(jié)合熒光原位雜交和分子生物學(xué)等多種手段研究該屬植物的系統(tǒng)演化。

近年來，核型似近系數(shù)分析越來越多地被應(yīng)用于植物親緣關(guān)系和系統(tǒng)演化等研究中(喬永剛等， 2020； 陳永畢等， 2019)，但在山茶屬植物中卻鮮有研究。本研究針對‘攸雜2’和‘華碩’及其雜交子代群體進(jìn)行核型似近系數(shù)聚類分析，發(fā)現(xiàn)大部分雜交子代的核型與母本更相近，而YH-11和YH-15的核型與父本更相近。同時，結(jié)合表型研究發(fā)現(xiàn)，大部分雜交子代在花期和果實經(jīng)濟(jì)性狀上也存在傾向于母本的遺傳趨勢(陳雅， 2020)，與核型分析結(jié)果一致，表明在油茶種間雜交過程中，母本的遺傳信息能更好地傳遞給子代，而母本的性狀可能有更高的遺傳力。同時也有可能是因為母本為非整倍體(2 n+1)，本身能傳遞更多的遺傳物質(zhì)給子代，且非整倍體植株可能會生成可遺傳的表觀遺傳變化使得整倍體后代也能遺傳非整倍體的表型特征(Henryetal., 2010)。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，雜交子代YH-14和YH-17在一定程度上與親本的親緣關(guān)系均較遠(yuǎn)，這可能是由于種間雜交增加了基因重組頻率，以及外源染色體片段的滲入，導(dǎo)致雜交子代在遺傳組成上與雙親均產(chǎn)生一定的差異(渠云芳等， 2013)，為種間雜交創(chuàng)制油茶新種質(zhì)奠定了一定的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

種間雜交群體中以m型和sm型染色體為主，少數(shù)有st型，均有隨體。大部分雜交子代的核型參數(shù)介于父本與母本之間，少數(shù)雜交子代的核型出現(xiàn)較大變異。雜交子代YH-1、YH-2、YH-3、YH-4、YH-5、YH-6、YH-7、YH-8、YH-9、YH-10、YH-12、YH-13、YH-14、YH-16、YH-17和YH-18的核型與母本‘攸雜2’更相近，而雜交子代YH-11和YH-15的核型與父本‘華碩’更相近。