FGF10干預PM誘導支氣管上皮細胞COX2/PGE2表達的分子機制

董年 施強強 宋晨劍 劉莉 陳俊杰

當前，日益嚴重的空氣污染對公眾健康產(chǎn)生了嚴重的影響，尤其影響到基數(shù)龐大的氣道疾病人群[1]。細顆粒物（particulate matter,PM）是空氣污染物中的重要成分，可以跟隨呼吸氣流廣泛沉積在支氣管上皮表面。支氣管上皮主要由固有結(jié)構(gòu)細胞支氣管上皮細胞構(gòu)成，支氣管上皮細胞在PM作用下發(fā)生炎癥損傷，表現(xiàn)為炎癥介質(zhì)的合成分泌和細胞過早壞死凋亡，導致的炎癥反應是氣道疾病發(fā)生、發(fā)展的重要病理生理過程[2]。與氣道結(jié)構(gòu)發(fā)生不可逆性改變的氣道重構(gòu)相比，氣道炎癥具有一定的可逆性，闡明支氣管上皮的損傷修復機制在預防和診治氣道炎癥上具有重要作用。在PM作用下的動物模型中可以觀察到以氣道炎癥為主的病理改變[3]，伴隨成纖維生長因子10（fibroblast growth factor 10,FGF10）表達變化[4]，誘導支氣管上皮細胞的環(huán)氧合酶2（cyclooxygenase 2,COX2）表達，進而催化前列腺素E2（prostaglandin E2,PGE2）合成，擴大氣道炎癥反應[5-6]。本研究使用FGF10干預PM誘導的動物模型和細胞模型，觀察PM導致的支氣管上皮細胞炎癥損傷效應，探討COX2/PGE2在不同條件下的變化，為探明FGF10在PM誘導氣道炎癥中的抗炎調(diào)控作用及分子機制提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料 6～8周SPF級雄性C57BL/6小鼠（20～22 g）購自北京維通利華實驗動物技術(shù)公司，動物生產(chǎn)許可證號為SXCK（京）2016-0011。人支氣管上皮細胞（BEAS-2B）購自上海中科院細胞庫，根據(jù)相應的細胞培養(yǎng)指導手冊進行培養(yǎng)。PM購自美國NIST公司，商品化名：SRM 1649b；RPMI 1640培養(yǎng)液、FBS和PBS購自美國Gibco公司；動物實驗用FGF10購自溫州醫(yī)科大學藥學院；細胞實驗用FGF10購自美國Peproptech公司；抗COX2抗體和抗上皮特異性標志物上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule,EpCAM）抗體購自美國CST公司；ELISA試劑盒購自上海博蘊生物科技有限公司；蛋白激酶1/2（extracellular regulated protein kinases 1/2,ERK1/2）抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002購自美國Selleck公司；BCA蛋白濃度測定試劑盒、預染蛋白Marker和ECL發(fā)光液購自美國Thermo公司；乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）檢測試劑盒購自上海碧云天生物科技有限公司。

1.2 動物模型建立及實驗分組、處理

1.2.1 動物模型的建立和分組 取40只小鼠隨機分為4組，每組10只。空白對照組0、24 h時給予腹腔注射 PBS 25 μl，1、25 h 時給予氣道滴注 PBS 25 μl；FGF10組根據(jù)動物體質(zhì)量按0.5 mg/kg于0、24 h時腹腔注射FGF10，于1、25 h時氣道滴注等量PBS；PM組于0、24 h時腹腔注射等量PBS，根據(jù)動物體質(zhì)量按4.0 mg/kg于1、25 h 時氣道滴注PM；（PM+FGF10）組0、24 h時給予0.5 mg/kg FGF10腹腔注射，1、25 h時給予4.0 mg/kg PM氣道滴注。

1.2.2 動物標本的處理 4組小鼠在末次氣道滴注24 h后用4%的水合氯醛腹腔注射麻醉。（1）每組取3只小鼠，經(jīng)氣管插管灌注0.9%氯化鈉溶液，獲取肺泡灌洗液用以PGE2表達水平檢測；小鼠死亡后切開胸腔獲取新鮮肺組織用于COX2表達水平檢測。（2）每組取4只小鼠，經(jīng)氣管插管灌注多聚甲醛，獲取肺組織用于常規(guī)病理檢查。（3）每組取3只小鼠，經(jīng)氣管插管灌注冷凍切片包埋劑，獲取肺組織用于免疫熒光檢測。

1.3 細胞模型建立及實驗分組、處理 BEAS-2B細胞用含10%FBS和1%青霉素/鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，37℃、5% CO2恒溫，隔天換液，取生長狀況良好的對數(shù)生長期細胞，使用0.25%胰酶溶液消化傳代。（1）細胞模型Ⅰ分為空白組、FGF10組、PM組、PM+FGF10組。空白組于0、1 h時加入1 μl PBS培養(yǎng)；FGF10組加入10 μg/L FGF10培養(yǎng)，1 h后加入PBS；PM組加入PBS培養(yǎng)，1 h后加入200 mg/L PM；PM+FGF10組加入10 μg/L FGF10培養(yǎng)，1 h后加入200 mg/L PM。所有各組培養(yǎng)24 h后收集細胞上清液和細胞，分別檢測COX2/PGE2表達水平和細胞功能變化。（2）細胞模型Ⅱ分為空白組、PM組、PM+FGF10組、PM+FGF10+LY294002組和PM+FGF10+U0126組。空白組于0、1、2 h時加入1 μl PBS培養(yǎng)；PM組于0、1 h時加入PBS培養(yǎng)，2 h后加入200 mg/L PM；PM+FGF10組加入PBS培養(yǎng)，1 h后加入10 μg/L FGF10，2 h后加入200 mg/L PM；PM+FGF10+LY294002組和PM+FGF10+U0126組加入5 mmol/L 的LY294002或U0126培養(yǎng)，1 h后加入10 μg/L FGF10，2 h后加入200 mg/L PM。所有各組培養(yǎng)25 h后收集細胞，檢測COX2/PGE2的表達水平。

1.4 小鼠指標觀測

1.4.1 組織病理分級 4組小鼠肺組織常規(guī)切片，HE染色，光學顯微鏡下觀察。以0到4分的主觀等級評估支氣管周圍和血管周圍的炎癥程度：0分為未觀察到炎癥；1分為偶見炎癥細胞；2分為支氣管或血管周圍不均勻分布炎癥細胞或炎癥細胞圍繞成薄的環(huán)狀（層厚1～5個炎癥細胞）；3分為支氣管或血管周圍分布均勻的炎癥細胞或炎癥細胞圍繞成厚的環(huán)狀（層厚＞5個炎癥細胞）；4分為支氣管、血管或肺泡分布彌漫聚集的炎癥細胞。

1.4.2 小鼠肺泡灌洗液中PGE2表達的檢測 采用ELISA法。4組小鼠肺泡灌洗液4℃、1 000 r/min離心10 min，取上清液，加注至ELISA板中，37℃孵育2 h。移除板孔中液體，添加生物素抗體，37℃孵育1 h；洗去液體，添加HRP-抗生物素蛋白，37℃孵育1 h；重復洗滌5次。顯色并終止，利用酶標儀測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算各組樣品PGE2的質(zhì)量濃度。

1.4.3 小鼠肺組織COX2蛋白表達的檢測 采用Western blot法。4組小鼠肺組織研磨搗碎后4℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，進行聚丙烯凝膠電泳；取30 μg電泳凝膠，濕轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜，用質(zhì)量濃度為5%的脫脂牛奶室溫下封閉2.0 h，一抗4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜10 min，重復3次，二抗室溫孵育1.5 h，用TBST緩沖液洗膜10 min，重復3次，化學發(fā)光法顯影條帶。以管家基因蛋白甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH）作為內(nèi)參，計算蛋白質(zhì)相對表達量。

1.4.4 小鼠支氣管上皮細胞COX2表達的檢測 采用免疫熒光法。取4組小鼠支氣管冷凍切片，用抗原修復緩沖液進行切片修復，用牛血清白蛋白封閉非特異性抗原。分別使用抗COX2一抗和抗EpCAM一抗孵育過夜，PBS充分洗凈后，二抗室溫孵育1 h，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole,DAPI）復染細胞核，切片稍甩干后添加熒光猝滅封片劑封片，于熒光顯微鏡下觀察并采集圖像，計算熒光強度。其中DAPI用于細胞核染色，發(fā)藍光；異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate,FITC）用于上皮特異性標志物Epcam染色，發(fā)綠光；Sulfo-Cyanine 3染料（CY3）用于COX2染色，發(fā)紅光。

1.5 細胞指標觀測

1.5.1 BEAS-2B細胞PGE2表達的檢測 采用ELISA法。將細胞模型Ⅰ的4組細胞上清液按照1.4.2方法測定并計算樣品PGE2質(zhì)量濃度。

1.5.2 BEAS-2B細胞COX2表達的檢測 采用Western blot法。將細胞模型Ⅰ的4組細胞用裂解液裂解，4℃、14 000 r/min離心10 min，取上清液，按照1.4.3方法測定并計算COX2的相對表達量。

1.5.3 BEAS-2B細胞功能分析 將細胞模型Ⅰ的4組細胞分別與1.0 μmol/L Hoechst33342 和 0.3 μmol/L Mito Tracher Green共培養(yǎng)45 min，高內(nèi)涵成像分析系統(tǒng)（美國PerkinElmer公司）進行高內(nèi)涵成像分析，根據(jù)細胞核數(shù)計算總細胞數(shù)，根據(jù)線粒體熒光強度反映線粒體功能。

1.5.4 LDH細胞毒性實驗 將細胞模型Ⅰ的4組細胞上清液，根據(jù)LDH細胞毒性檢測試劑盒方法測定吸光度，根據(jù)標準曲線計算各組LDH釋放相對值。LDH釋放相對值越大，說明細胞毒性越強。

1.5.5 信號通路抑制劑作用下BEAS-2B細胞PGE2和COX2表達的檢測 采用ELISA法，取細胞模型Ⅱ的5組上清液按照1.4.2方法測定PGE2質(zhì)量濃度；采用Western blot法，取細胞模型Ⅱ的5組細胞按照1.4.3方法，以β-肌動蛋白（β-actin）為內(nèi)參，檢測COX2的相對表達量。

1.6 統(tǒng)計學處理 使用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用Bonferroni校正的t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 4組小鼠支氣管病理形態(tài)改變的比較 PM組支氣管周圍炎癥細胞浸潤，支氣管上皮細胞變厚，伴隨PM氣道沉積；空白組和FGF10組支氣管周圍無明顯炎癥細胞浸潤；PM+FGF10組支氣管周圍炎癥較PM組相對緩解，主要表現(xiàn)為炎癥細胞浸潤程度降低。見圖1a（插頁）。對各組的病理分級評分發(fā)現(xiàn)：相比空白組，PM組炎癥評分升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；相比PM組，PM+FGF10組炎癥評分降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見圖1b（插頁）。

圖1 4組小鼠支氣管病理形態(tài)變化（a）和病理等級評分（b）

2.2 4組小鼠肺泡灌洗液PGE2表達的比較 相比空白組，PM組肺泡灌洗液中PGE2質(zhì)量濃度升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；相比PM組，PM+FGF10組肺泡灌洗液中PGE2質(zhì)量濃度降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖2。

圖2 4組小鼠肺泡灌洗液PGE2表達的比較

2.3 4組小鼠肺組織COX2蛋白表達的比較 相比空白組，PM組肺組織COX2蛋白相對表達量升高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；相比PM組，PM+FGF10組肺組織COX2蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見圖3。

圖3 4組小鼠肺組織COX2蛋白電泳圖和相對表達量比較（a：蛋白電泳圖；b：相對表達量）

2.4 4組小鼠支氣管上皮COX2表達的比較 各組支氣管上皮細胞COX2均有表達，其中PM組紅色熒光強度較高，說明該組COX2表達升高，PM+FGF10組COX2熒光強度較PM組降低（圖4a，見插頁），但各組熒光強度差異不顯著（圖4b，見插頁）。

圖4 4組小鼠支氣管上皮COX2熒光染色（a）和熒光強度（b）的比較

2.5 4組BEAS-2B細胞COX2/PGE2表達的比較 PM組細胞上清液中PGE2質(zhì)量濃度高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖5a。各組細胞的COX2均有表達見圖5b，其中PM組高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，差異均有統(tǒng)計學意義均P＜0.05，見圖5c。

圖5 4組BEAS-2B細胞COX2/PGE2表達的比較（a：PGE2質(zhì)量濃度；b：COX2蛋白電泳圖；c：COX2相對表達量）

2.6 4組BEAS-2B細胞生物功能改變的比較 熒光顯微鏡下，PM組細胞核（藍色熒光）數(shù)量減少，PM+FGF10組線粒體（綠色熒光）數(shù)量增多（圖6a，見插頁）。結(jié)合細胞計數(shù)（圖6b，見插頁）和線粒體熒光強度（圖6c，見插頁）結(jié)果可知：PM組BEAS-2B細胞數(shù)少于空白組，PM+FGF10組多于PM組；PM組線粒體熒光強度低于空白組，PM+FGF10組高于PM組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。LDH釋放相對表達值實驗（圖6d，見插頁）表明：PM組乳酸脫氫酶水平高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。

圖6 4組BEAS-2B的細胞生物功能改變的比較（a：細胞熒光染色；b：BEAS-2B細胞計數(shù)；c：線粒體熒光強度；d：LDH釋放相對表達值）

2.7 5組BEAS-2B細胞COX2/PGE2表達的比較 不同處理下BEAS-2B細胞COX2蛋白均有表達（圖7a）；PM組COX2相對表達量高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，PM+FGF10+LY294002組和PM+FGF10+U0126組高于PM+FGF10組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖7b。PM組PGE2質(zhì)量濃度高于空白組，PM+FGF10組低于PM組，PM+FGF10+LY294002組和PM+FGF10+U0126組高于PM+FGF10組，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。見圖7c。

圖7 5組BEAS-2B細胞 COX2/PGE2表達的比較（a：COX2蛋白電泳圖；b：COX2相對表達量；c：PGE2質(zhì)量濃度）

3 討論

PM作為空氣污染物中的重要成分，是危害中國成人肺部健康、引起氣道疾病的重要因素[7]，主要成分包括碳化合物、烴類物質(zhì)和金屬元素等，其介導的理化損傷是空氣污染和健康效應之間的重要聯(lián)系[8-9]。PM可以伴隨呼吸氣流廣泛沉積在氣道上皮和肺泡上皮。其中氣道上皮是呼吸系統(tǒng)抵御PM的首要屏障，支氣管上皮細胞作為氣道上皮的固有結(jié)構(gòu)細胞，在氣道炎癥中扮演了啟動細胞和繼發(fā)受體的雙重角色[10]。

本研究通過氣道滴注PM構(gòu)建動物模型，獲取鼠肺組織模擬人肺及氣道的炎癥變化。病理分級評分發(fā)現(xiàn)：PM導致肺臟組織產(chǎn)生以氣道炎癥為主的病理改變，表現(xiàn)為氣道PM沉積、氣道周圍炎癥細胞浸潤等；給予FGF10干預時氣道炎癥得到緩解，與Xu等[11]報道一致。FGF10干預使得肺泡灌洗液中PGE2質(zhì)量濃度降低，但并沒有觀察到明顯的肺泡炎癥。原因可能是氣道滴注將PM制造成為懸浮液，PM無法沉積到肺泡。本研究以腹腔注射方式注入FGF10，藥物劑量僅為氣道滴注的10%[12]，同樣觀察到了FGF10的抗炎效應。值得注意的是，腹腔注射方式給藥，F(xiàn)GF10需要經(jīng)血液循環(huán)到達肺臟，可能會造成系統(tǒng)性不良反應[13]，提示后續(xù)研究可開發(fā)PM霧化造模和FGF10霧化給藥。氣道滴注PM后小鼠全肺組織COX2表達水平升高，肺泡灌洗液PGE2質(zhì)量濃度升高，F(xiàn)GF10干預后，COX2/PGE2表達水平均降低，認為FGF10逆轉(zhuǎn)了PM誘導的COX2/PGE2表達。

細胞實驗同樣觀察到了上述結(jié)果。本研究以永生化的支氣管上皮細胞為研究對象，使用PM刺激建立細胞模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：PM誘導下，支氣管上皮細胞COX2/PGE2的表達水平升高，細胞膜通透性升高，活細胞計數(shù)降低，LDH釋放量增加，這充分體現(xiàn)了PM對支氣管上皮細胞的理化損傷作用。FGF10干預后COX2/PGE2的表達水平降低，活細胞數(shù)增多，線粒體熒光強度增大，LDH釋放量下降，可見FGF10逆轉(zhuǎn)了PM誘導的炎癥反應。

COX2/PGE2是重要的炎癥介質(zhì)，參與了氣道炎癥的起始發(fā)展[14]。關于PM誘導支氣管上皮細胞COX2/PGE2表達的分子機制，Wang等[15-16]認為是ROS-MAPK-NFκB信號通路和circTXNRD1-miR892a-COX2軸，Zhao等[17]報道了NF-κB信號通路和C/EBPβ信號通路，Song等[18]闡明了PI3K/Akt信號通路。在PM誘導的氣道炎癥中，F(xiàn)GF10主要與上皮細胞選擇性表達的成纖維生長因子受體 2（fibroblast growth factor receptor 2,FGFR2）以配體-受體結(jié)合的方式發(fā)揮調(diào)控作用[19]。FGF10-FGFR2觸發(fā)的信號傳導通路包括MAPK、PI3K/Akt、PLC-γ等[20]。結(jié)合MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路在肺炎癥損傷中的研究基礎[21]，本研究在培養(yǎng)體系中添加了ERK1/2抑制劑U0126和PI3K抑制劑LY294002，結(jié)果發(fā)現(xiàn)此兩者作用下，COX2/PGE2表達水平重新提高?？梢奆GF10經(jīng)活化的MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗炎作用，逆轉(zhuǎn)PM誘導支氣管上皮細胞COX2/PGE2的表達。此外，F(xiàn)ang等[22]發(fā)現(xiàn)：FGF10還可以通過調(diào)控高遷移率族蛋白B1的胞核胞漿轉(zhuǎn)移和PM誘導的自噬流改變發(fā)揮抗炎效應。

FGF10可針對PM誘導的氣道炎癥發(fā)揮抗炎效應，但這些研究還處于起步階段，MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路如何介導FGF10的抗炎效應還不清楚，后期可圍繞信號通路下游信號蛋白、與經(jīng)典炎癥信號通路NF-κB的聯(lián)系等展開深入探究。目前，PM氣道滴注和FGF10腹腔給藥方式還不能完全模擬真實事件中PM暴露情況，針對FGF10最優(yōu)化的給藥途徑如霧化吸入的方法還未正式報道；COX2/PGE2作為重要的炎癥介質(zhì)參與了氣道炎癥的發(fā)生、發(fā)展，F(xiàn)GF10通過MAPK/ERK或PI3K/Akt信號通路發(fā)揮抗炎效應，但涉及的介質(zhì)，如下游信號傳導蛋白及轉(zhuǎn)錄翻譯等還未知。

本研究從動物實驗和細胞實驗兩個層面揭示了FGF10調(diào)控PM誘導支氣管上皮細胞COX2/PGE2的表達，其中分子機制涉及MAPK/ERK和PI3K/Akt信號通路，初步揭示了間充質(zhì)來源的FGF10在PM誘導氣道炎癥中的抗炎效應，為FGF10用于治療PM相關呼吸道炎癥提供依據(jù)。