LINC00315在胃癌中的表達及對胃癌細胞增殖、凋亡的影響

賀海斌 張智勇 俞仲輝

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，具有惡性程度高、發(fā)病率高及死亡率高等特點[1-2]。盡管近年來胃癌的診療水平已經(jīng)有了大幅提升，但是現(xiàn)階段胃癌患者的預后仍然不容樂觀[3-4]。近年來，胃癌基因靶向治療研究為胃癌患者帶來了新的曙光，其中長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是研究熱點之一[5-6]。lncRNA是一類長度超過200個核苷酸且不具有蛋白編碼能力的單鏈RNA[6]。研究表明，異常表達的lncRNA參與胃癌的發(fā)生、發(fā)展[7]。如lncRNA NKX2-1-AS1在胃癌中的表達顯著上調(diào)，且NKX2-1-AS1通過激活SERPINE1/VEGFR-2通路促進胃癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移以及新生血管的形成[8]；lncRNA SNHG11通過激活Wnt/β-catenin通路促進胃癌細胞的增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和上皮間質(zhì)化[9]；lncRNA CCDC144NLAS1通過靶向作用于miR-143-3p/MAP3K7通路促進胃癌發(fā)生、發(fā)展[10]。而值得注意的是，LINC00315為一條長度為2 323 bp的lncRNA，基因位于21q22.3。研究發(fā)現(xiàn)：在乳腺癌患者中，LINC00315的拷貝數(shù)改變與其臨床特征相關(guān)[11]；LINC00315在卵巢癌化療耐藥性中起著重要作用[12]?；谶@些，本研究分析了LINC00315在胃癌中的表達情況，旨在探討其與胃癌患者臨床病理特征、預后的關(guān)系及其對胃癌細胞增殖、凋亡的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料和方法

1.1 胃癌患者和組織標本 選取2018年1月1日—2019年12月31日在寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院接受手術(shù)治療并經(jīng)術(shù)后病理診斷確診的胃癌患者75例，收集每例患者的胃癌組織和對應(yīng)的癌旁組織。患者中男49例，女26例；年齡26～78歲，中位年齡59歲。所有患者術(shù)前均未接受放療、化療等其他輔助治療。所有獲得的新鮮組織取得后均液氮冷凍，然后長期保存在-80°C冰箱。本研究經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會審核批準。

1.2 主要試劑 FBS和DMEM培養(yǎng)基購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Thermo Fisher Scientific公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（PrimeScript RT Reagent Kit）購自日本TaKaRa公司；實時定量PCR試劑盒（SYBR@Green Supermix）購自美國Bio-Rad公司；LINC00315特異性引物（HQP006418）和內(nèi)參GAPDH引物（HQP006940）購自廣州易錦生物技術(shù)有限公司；LINC00315小干擾RNA（siRNA）及siRNA陰性對照合成于上海Gene Pharma公司；MTT試劑盒購自江蘇凱基生物科技發(fā)展有限公司；5-乙炔基-2-脫氧尿嘧啶（5-Ethynyl-2′-deoxyuridine,EdU）檢測試劑盒購于廣州銳博生物技術(shù)有限公司；流式細胞檢測細胞凋亡試劑盒購自上海碩嘉生物科技有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000購自美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 胃癌細胞系NCI-N87、SGC-7901、AGS、HCG27和正常胃黏膜細胞GES-1均購自中國科學院上海細胞庫。細胞置于37℃、5% CO2的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含10%FBS、1%青霉素-鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液。細胞轉(zhuǎn)染按Lipofectamine?3000說明書所示步驟進行。先將待轉(zhuǎn)染細胞消化、離心、重懸、計數(shù)，然后將適宜數(shù)量的細胞接種于6孔板，待細胞融合度達到75%左右時，分別將LINC00315 siRNA、對照siRNA應(yīng)用Lipofectamine?3000對HCG27細胞進行轉(zhuǎn)染（分別為干擾組、對照組），48 h后應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測其轉(zhuǎn)染效率，并進行后續(xù)實驗。

1.3.2 胃癌組織、癌旁組織及胃癌細胞、胃黏膜細胞LINC00315表達水平檢測 采用qRT-PCR法。應(yīng)用Trizol提取組織和細胞總RNA，采用NanoDrop微量紫外分光光度計（美國Thermo Fisher Scientific公司）測定RNA的純度及濃度。應(yīng)用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，應(yīng)用實時定量PCR試劑盒檢測LINC000315的表達水平，GAPDH為內(nèi)參，每孔重復3次，上述操作均參照試劑盒說明書上的步驟進行，結(jié)果采用 2-ΔΔCt法進行分析。

1.3.3 胃癌細胞活力檢測 采用MTT實驗。將干擾組和對照組細胞接種于96孔板（1.5×104/孔），每組重復3個孔，培養(yǎng)24、48、72 h后，每孔加入20 μl MTT溶液，繼續(xù)孵育4 h后每孔加入150 μl的DMSO終止反應(yīng)。在酶聯(lián)免疫監(jiān)測儀上讀取490 nm處的光密度（OD）。每組的3個孔取平均值，繪制細胞生長曲線。

1.3.4 胃癌細胞增殖能力檢測 采用EdU細胞增殖實驗。將干擾組和對照組細胞接種于96孔板（1×105/孔），每組重復3個孔，培養(yǎng)48 h后每孔加入100 μl EdU（50 μmol/L）培養(yǎng)基孵育2 h后棄去；PBS清洗2次后每孔加入50 μl細胞固定液，室溫孵育30 min后棄去。加入 50 μl甘氨酸（2 mg/ml），搖床孵育5 min后棄去；PBS清洗后加入 100 μl Triton X-100（0.5%）孵育10 min；加入 100 μl Apollo?染色反應(yīng)液，避光室溫孵育30 min后，加入100 μl聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100）（0.5%）清洗2～3次；加入100 μl Hoechst 33342反應(yīng)液，避光室溫孵育30 min；100 μl PBS清洗1～3次后觀察、拍照。

1.3.5 胃癌細胞凋亡率檢測 采用流式細胞術(shù)。細胞凋亡檢測按照細胞凋亡試劑盒說明書步驟進行。轉(zhuǎn)染48 h后，收集干擾組和對照組細胞，用預冷的PBS洗滌后離心，棄掉上清液。用300 μl結(jié)合緩沖液重懸，然后分別加入5 μl藻紅蛋白標記的重組人附件素V（PE Annexin V）試劑和 5 μl 7-氨基放線菌素 D（7-AAD）試劑，并置于避光條件下室溫孵育15 min。應(yīng)用流式細胞儀檢測，細胞凋亡擬合軟件分析數(shù)據(jù)。

1.4 觀察指標 （1）比較胃癌組織與癌旁組織LINC00315表達水平；（2）比較胃癌細胞、胃黏膜細胞LINC00315表達水平；（3）根據(jù)75例胃癌組織中LINC00315的中位表達水平，將患者分為LINC00315高表達患者和低表達患者，分析LINC00315表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系；（4）應(yīng)用來自公共數(shù)據(jù)庫 GEPIA（http://gepia.cancer-pku.cn）的TCGA數(shù)據(jù)分析LINC00315的表達水平對胃癌患者預后的影響；（5）比較干擾組和對照組細胞LINC00315表達水平、細胞活力、增殖能力；（6）比較干擾組和對照組細胞凋亡率。

1.5 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0和Graphpad Prism 6統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗，胃癌組織與癌旁組織比較采用配對t檢驗。計數(shù)資料以頻數(shù)和構(gòu)成比表示，組間比較采用χ2檢驗。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線，生存曲線的比較采用log-rank檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 胃癌組織與癌旁組織LINC00315表達水平比較胃癌組織LINC00315表達水平高于癌旁組織（P＜0.05），見圖1。

圖1 胃癌組織與癌旁組織LINC00315表達水平比較

2.2 胃癌細胞、胃黏膜細胞LINC00315表達水平比較胃癌 NCI-N87、SGC-7901、AGS、HCG27 細 胞LINC00315表達水平均高于胃黏膜GES-1細胞（均P＜0.05），見圖2。

圖2 胃癌細胞、胃黏膜細胞LINC00315表達水平比較

2.3 LINC00315表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系分析 根據(jù)75例胃癌組織中LINC00315的中位表達水平（4.22），將患者分為LINC00315高表達患者39例和低表達患者36例。分析結(jié)果顯示：LINC00315表達水平與患者腫瘤大小及TNM分期有關(guān)（均P＜0.05），高表達患者腫瘤較大、TNM分期較晚；而與年齡、性別、分化程度、手術(shù)方式及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素無關(guān)（均P＞0.05），見表1。

表1 LINC00315表達水平與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系分析[例（%）]

2.4 LINC00315表達水平對胃癌患者預后的影響TCGA數(shù)據(jù)分析LINC00315的表達水平對胃癌患者預后的影響，結(jié)果顯示：LINC00315高表達的胃癌患者總生存率、無病生存率均低于LINC00315低表達的胃癌患者（均P＜0.05），見圖3。

圖3 LINC00315高表達與低表達胃癌患者總生存曲線和無病生存曲線比較（a：總生存曲線；b：無病生存曲線）

2.5 干擾組和對照組細胞LINC00315表達水平、細胞活力、增殖能力比較 干擾組細胞LINC00315表達水平低于對照組（P＜0.05），見圖4。MTT實驗結(jié)果顯示：培養(yǎng)24、48、72 h后，干擾組細胞活力較對照組減弱（均P＜0.05），即敲低LINC00315的表達導致HCG27細胞活力明顯減弱，見圖5。EdU細胞增殖實驗結(jié)果顯示：干擾組細胞增殖能力較對照組減弱（均P＜0.05），即敲低LINC00315的表達導致HCG27細胞增殖能力明顯減弱，見圖6。

圖4 干擾組和對照組細胞LINC00315表達水平比較

圖5 干擾組和對照組細胞活力比較

圖6 干擾組和對照組EdU陽性細胞率比較）

2.6 干擾組和對照組細胞凋亡率比較 干擾組細胞凋亡率高于對照組（P＜0.05），即敲低LINC00315的表達導致HCG27細胞的凋亡率明顯升高，見圖7。

圖7 干擾組和對照組細胞凋亡率比較

3 討論

胃癌是世界范圍內(nèi)最常見的惡性腫瘤之一，具有較高的發(fā)生率和致死率。一直以來，國內(nèi)外學者都在積極致力于研究如何提升胃癌的診療水平，而近年來以lncRNA為代表的胃癌靶向治療是研究熱點之一[13-14]。既往認為，lncRNA是基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的“噪音”，不具有生物學功能。而隨著研究的不斷深入，人們發(fā)現(xiàn)lncRNA能夠參與細胞的X染色體沉默、基因組印記、基因轉(zhuǎn)錄激活、轉(zhuǎn)錄干擾等多種重要的調(diào)控過程[15-17]。而研究也表明，異常表達的lncRNA與包括胃癌在內(nèi)的腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[18-22]。例如，Song等[18]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA TMEM92-AS1能夠通過與YBX1蛋白的結(jié)合介導CCL5對胃癌發(fā)生、發(fā)展的調(diào)節(jié)作用；Ma等[19]研究發(fā)現(xiàn)lncRNA NEAT1在胃癌細胞中可作為BRG1蛋白的“支架”，從而調(diào)控GADD45A的表達量進而影響胃癌的發(fā)生、發(fā)展；此外，Ma等[20]研究發(fā)現(xiàn)EGR1介導的LINC01503可通過表觀調(diào)控DUSP5/CDKN1A的表達水平從而調(diào)控胃癌細胞的發(fā)生、發(fā)展。由此可見，lncRNA在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中起著極其重要的作用。然而，LINC00315在胃癌中的表達情況報道鮮見。

本研究發(fā)現(xiàn)：LINC00315在胃癌組織和細胞系中的表達均明顯上調(diào)，并且高表達的LINC00315與胃癌較大的腫瘤體積和較晚的TNM分期有關(guān)。此外，LINC00315高表達的胃癌患者的總生存率和無病生存率與低表達患者相比明顯降低。上述結(jié)果提示，LINC00315可能是胃癌的促癌基因，且對判斷胃癌的惡性程度及患者預后具有一定的臨床參考價值。

在細胞功能實驗中，本研究發(fā)現(xiàn)敲低胃癌細胞中LINC00315表達后，胃癌細胞活力和增殖能力均被明顯抑制，此外，細胞的凋亡率明顯增加。上述結(jié)果表明，LINC00315能夠增強胃癌細胞的增殖能力，并能抑制胃癌細胞的凋亡。這一結(jié)果與在臨床病理特征分析中的發(fā)現(xiàn)，即高表達的LINC00315與胃癌較大的腫瘤體積和較晚的TNM分期有關(guān)，是相符的。筆者推測LINC00315可能通過上調(diào)細胞內(nèi)CDK4、Cyclin D1蛋白表達，加速細胞周期進展，進而促進細胞增殖。然而，LINC00315在胃癌細胞中的其他生物學作用、其上下游調(diào)控因子還有待進一步探究。

綜上，LINC00315在胃癌中表達上調(diào)，其與胃癌的腫瘤大小、TNM分期以及患者的預后密切相關(guān)；高表達的LINC00315可以促進胃癌細胞的增殖、抑制胃癌細胞的凋亡。