王 娜，張 霞，王玉凈，張華林，孟亞麗

(河北醫(yī)科大學第一醫(yī)院，河北 石家莊 050000)

宮頸癌為威脅婦女生命健康的重大疾病，全球每年約有50萬新發(fā)病例，且其致死率高居女性惡性腫瘤第四位[1]。近年來，隨著宮頸癌篩查手段及水平的提高，宮頸癌發(fā)病率明顯下降，但仍然有一大部分患者確診時即為晚期而失去了手術的最佳階段[2]。目前，化療仍然是復發(fā)和晚期宮頸癌患者最主要的治療手段[3]。中藥治療宮頸癌具有低毒副作用、療效顯著、價格低廉等優(yōu)點，引起了廣大研究者的關注[4]。

牡荊素是來源于牡荊子和牡荊葉中的天然黃酮類化合物，具有預防心肌缺血再灌注損傷、降血糖、神經保護、止痛、抗氧化、抗炎等生物活性[5]。研究發(fā)現，牡荊素能呈時間-劑量依賴性的抑制人肝癌細胞SMMC-7721的增殖，并誘導凋亡[6]。姜玲等[7]證實在體外牡荊素能抑制卵巢癌SKOV3細胞系干細胞樣細胞球的形成，但牡荊素抑制腫瘤細胞增殖的機制并未闡明，且其對宮頸癌的抑制作用相關報道較少。因此，本研究以人宮頸癌HeLa細胞為研究對象，在證實牡荊素具有抑制其增殖作用的基礎上，進一步探討與凋亡及細胞周期的關系，初步闡明其作用機制，以期為后續(xù)臨床應用奠定基礎。

1 材料

1.1 試劑與藥物 牡荊素(純度>96%，南京道斯夫生物科技有限公司)；胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco公司)；MTT細胞增殖及細胞毒性檢測試劑盒(上海碧云天生物技術有限公司)；Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒(大連美侖生物技術有限公司)；細胞周期檢測試劑盒(杭州聯科生物技術股份有限公司)；Bcl-2、Bax、caspase-3、p-P53、cyclin B1、cyclin E、GAPDH多克隆抗體(美國CST公司)。

1.2 儀器 YSK-239型高速離心機(美國Sigma公司)；IX7型倒置熒光顯微鏡(日本Olympus公司)；Multiscan-GO酶標儀(美國Thermo公司)；FACSCalibur流式細胞儀(美國BD公司)；Mini-Protean小垂直板電泳儀(美國Bio-Rad公司)。

1.3 細胞株 人宮頸癌HeLa細胞購于中國科學院上海細胞庫。

2 方法

2.1 HeLa細胞增殖 HeLa細胞培養(yǎng)至對數生長期，離心收集細胞并用完全培養(yǎng)液重懸，調整細胞密度為1×105/mL。取100 μL胞懸液于96孔細胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后，棄去培養(yǎng)液，分為對照組，牡荊素低、中、高劑量組，分別加入含終濃度為0、2.5、5、10 μmol/L牡荊素完全培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h。采用MTT法，于450 nm波長處測光密度(OD)值。

2.2 細胞凋亡率檢測 HeLa細胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板中，按“2.1”項下方法分組處理，培養(yǎng)48 h后，離心并收集細胞于上樣管中。依次加入Annexin V-FITC結合液150 μL、Annexin V-FITC 3 μL、PI 2 μL重懸細胞，在室溫條件下于暗室內孵育15 min。加入磷酸鹽緩沖液使終體積為500 μL，經300目篩子濾過后，上機檢測，并通過Cell Quest軟件分析。

2.3 細胞周期檢測 HeLa細胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板中，按“2.1”項下方法分組處理，培養(yǎng)48 h后，離心并收集細胞于上樣管中。在4 ℃條件下用預冷至0 ℃75%乙醇固定HeLa細胞0.5 h，加少量磷酸鹽緩沖液重懸細胞，再加入適量PI使其終濃度為50 mg/L。在室溫條件下于暗室內孵育30 min，加入磷酸鹽緩沖液使終體積為500 μL，經300目篩子濾過后，上機檢測。

2.4 Western blot法檢測Bcl-2、Bax、caspase-3、p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表達 HeLa細胞培養(yǎng)于6孔培養(yǎng)板中，按“2.1”項下方法分組處理，培養(yǎng)48 h后，離心并收集細胞于1.5 mL離心管中。在冰水浴下加入細胞裂解液裂解0.5 h，離心取上清，采用考馬斯亮藍法測總蛋白濃度。經12%SDS-PAGE凝膠電泳分離目的蛋白，并通過濕轉法將目的蛋白轉移至聚偏二氟乙烯膜上。用封閉液在4 ℃條件下封閉2 h，再用稀釋后(1∶2 000)一抗(Bcl-2、Bax、caspase-3、p-P53、cyclin B1、cyclin E)孵育過夜，二抗(1∶5 000)孵育2 h。采用ECL法顯色，以GAPDH為內參蛋白，Image J軟件對目的蛋白條件進行分析與半定量。

3 結果

3.1 牡荊素對HeLa細胞增殖的影響 與對照組比較，牡荊素各劑量組在24、48、72 h內HeLa細胞存活率均下降(P<0.05，P<0.01)，且隨著藥物濃度及作用時間的延長，細胞存活率越低，具有明顯的劑量依賴關系及時間依賴關系，結果見表1。由此可知，牡荊素具有抑制HeLa細胞增殖的作用。

表1 牡荊素對HeLa細胞增殖的影響

3.2 牡荊素對HeLa細胞凋亡率的影響 與對照組比較，牡荊素各劑量組HeLa細胞48 h后的細胞凋亡率均增加(P<0.01)，結果見圖1。由此可知，牡荊素對HeLa細胞凋亡率的誘導作用，隨著作用劑量的增加而增強，表現出明顯的劑量依賴關系。

注：與對照組比較，**P<0.01。圖1 牡荊素對HeLa細胞凋亡率的影響(n=5)

3.3 牡荊素對HeLa細胞凋亡相關蛋白表達的影響 與對照組比較，牡荊素各劑量組HeLa細胞Bcl-2表達降低(P<0.05，P<0.01)，Bax表達升高(P<0.01)，牡荊素中、高劑量組HeLa細胞caspase-3表達升高(P<0.01)，牡荊素低劑量組caspase-3表達升高，但差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，結果見圖2、表2。由此可知，牡荊素具有HeLa細胞凋亡作用。

圖2 牡荊素對HeLa細胞凋亡相關蛋白表達的影響

3.4 牡荊素對HeLa細胞周期分布的影響 與對照組比較，牡荊素各劑量組HeLa細胞S期細胞數減少(P<0.05，P<0.01)，而G1細胞數增加(P<0.05，P<0.01)，結果見圖3。由此可知，牡荊素對HeLa細胞周期G1/S進程具有阻滯作用。

表2 牡荊素對HeLa細胞凋亡相關蛋白表達的影響

圖3 牡荊素對人宮頸癌HeLa細胞周期分布的影響(n=5)

3.5 牡荊素對HeLa細胞p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表達的影響 與對照組比較，牡荊素組各劑量組HeLa細胞p-P53表達增加(P<0.01)，cyclin B1、cyclin E蛋白表達降低(P<0.05，P<0.01)，結果見圖4、表3。由此可知，牡荊素具有細胞周期阻滯作用。

4 討論

細胞凋亡與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關系密切，凋亡進程由多種基因嚴密調控，是一種為適應外部環(huán)境而進行的主動性程序死亡過程[8]。在眾多的凋亡調控基因中，B淋巴細胞瘤-2基因(Bcl-2)和Bcl-2相關X蛋白(Bax)在宮頸癌等多種腫瘤中表達異常，為細胞凋亡過程中的關鍵調控因子，已成為多種抗癌藥物研發(fā)的熱門靶點[9]。Bcl-2基因可阻斷細胞凋亡進程，而作為Bcl-2同源基因的Bax則具有促進細胞凋亡作用[10]。細胞凋亡最主要的途徑為線粒體凋亡途徑，凋亡信號首先促使線粒體的通透性轉換孔開放，隨后使線粒體跨膜電位下降，進而導致線粒體膜功能障礙，引起半胱氨酸蛋白酶-3(caspase-3)的激活及表達增加，誘發(fā)caspase家族級聯反應，最終使細胞發(fā)生凋亡[11]。本研究首先采用Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞法在細胞水平上，發(fā)現牡荊素具有誘導HeLa細胞凋亡的作用；進而采用Western blot法在分子水平上，證實牡荊素可以降低HeLa細胞Bcl-2表達、增加Bax、caspase-3表達，進一步提示牡荊素抑制HeLa細胞增殖作用與誘導凋亡有關。

圖4 牡荊素對人宮頸癌HeLa細胞p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表達的影響

表3 牡荊素對人宮頸癌HeLa細胞p-P53、cyclin B1、cyclin E蛋白表達的影響

近年來，細胞癌變與細胞周期的關系已成為廣大研究者關注的焦點，通過靶向細胞信號傳導途徑中的相關蛋白，調節(jié)細胞周期進程[12]。除G0期、G1期、S期、G2期及M期外，G1/S期是最為重要的檢查點，其可監(jiān)測DNA合成的保真度和細胞組分的完整性[13]。本研究采用流式細胞術檢測發(fā)現，人宮頸癌HeLa細胞經不同濃度的牡荊素處理48 h后，S期細胞數減少，而G1細胞數增加，提示牡荊素對HeLa細胞周期G1/S進程具有阻滯作用。p53蛋白是基因組的監(jiān)護者，致癌信號、DNA損傷等細胞應激均會激活p53信號通路，進而活化多個下游途徑，使細胞周期檢查點G1/S期暫時停頓，誘導細胞凋亡及衰老[14]。細胞周期蛋白及細胞周期蛋白依賴性激酶共同調控細胞周期的進程，其中細胞周期蛋白cyclin B1和cyclin E是促進G1期向S期轉換的主要調節(jié)蛋白，若表達降低，則會導致G1/S進程受阻[15-16]。本研究發(fā)現人宮頸癌HeLa細胞經不同濃度的牡荊素處理48 h后，p-P53表達增加，而cyclin B1、cyclin E蛋白表達降低，進一步提示牡荊素具有阻滯細胞周期G1/S進程的作用。

綜上所述，牡荊素可能通過誘導人宮頸癌HeLa細胞凋亡和細胞周期阻滯，發(fā)揮抑制HeLa細胞增殖作用，為牡荊素治療宮頸癌提供重要的實驗基礎，也可為牡荊素抗腫瘤作用機制的研究提供新的思路。