任妙珍，董凱麟，張 劍，陳之端，蘇俊霞

(1.山西師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，太原 030092；2.中國(guó)科學(xué)院植物研究所系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100093)

竹葉花椒(ZanthoxylumarmatumDC.)屬于蕓香科(Rutaceae)花椒屬(ZanthoxylumL.)，俗稱“藤椒”，是一種落葉小喬木或灌木，枝具寬而扁銳的刺，全株有濃烈辛香味，主要分布在我國(guó)秦嶺以南的廣大西南區(qū)域[1].由于其清香濃郁的特殊風(fēng)味，竹葉花椒的干燥成熟果皮，常用作風(fēng)味調(diào)節(jié)劑和防腐劑，是中國(guó)美食中不可或缺的一種調(diào)料.它也是一種重要的藥用植物，根、莖、葉、果實(shí)等部位都可入藥，可以輔助治療胃痛、牙痛、腸內(nèi)蠕蟲及發(fā)熱、風(fēng)濕等；其提取的化合物具有消炎、殺菌和抗氧化的作用[2-4].竹葉花椒不僅是我國(guó)傳統(tǒng)的香料、油料和藥用樹種，也是重要的生態(tài)經(jīng)濟(jì)樹種，深受廣大人民的喜愛(ài).其中含有豐富的揮發(fā)油，主要為小分子醇類或萜類物質(zhì)[5].

特化次生代謝物的出現(xiàn)，提高了植物適應(yīng)環(huán)境的能力[6].在植物組織中，揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds, VOCs)的合成具有重要的生物學(xué)功能，包括抵抗病原菌，寄生生物和食草動(dòng)物等.根據(jù)其來(lái)源，VOCs又可分為萜類、苯類芳烴和脂肪酸衍生物，其中萜類占據(jù)了大多數(shù)[7].萜類是天然化合物中規(guī)模最大，結(jié)構(gòu)最多樣的一類次生代謝物[8].萜類化合物源自甲羥戊酸(MVA pathway)途徑和甲基赤蘚糖磷酸酯途徑(MEP pathway)產(chǎn)生的化合物和衍生物，分子骨架基于異戊二烯或其異構(gòu)體二甲基烯丙基焦磷酸C5單元，包含倍半萜、單萜、二萜、三萜等幾種類型[9].萜類化合物在植物生理和生化中扮演了重要的角色，例如光合作用、電子傳遞、發(fā)育調(diào)控等[10].根據(jù)植物中萜類化合物的作用可將其分為兩大類：初級(jí)代謝產(chǎn)物和次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如赤霉素、脫落酸、類胡蘿卜素、甾醇等為重要的初級(jí)代謝物，可調(diào)節(jié)細(xì)胞伸長(zhǎng)和植物生長(zhǎng)，參與光合作用以及控制膜流動(dòng)性等；植物中大多數(shù)萜類是次生代謝物，如青蒿素，紫杉醇，棉酚等，在植物與環(huán)境相互作用中起著關(guān)鍵作用，并且具有重要的藥用價(jià)值.萜類合成依賴于萜類合成酶(Terpene synthase, TPS)，萜類合成酶的多樣性造就了萜類的多樣性，根據(jù)生成的產(chǎn)物不同，可將其分為單萜合成酶、倍半萜合成酶、二萜合成酶等.根據(jù)植物TPS基因家族的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，前人將該家族劃分為8個(gè)亞家族：TPS-a，TPS-b，TPS-c，TPS-d(裸子植物特有)，TPS-e，TPS-f，TPS-g，和TPS-h(卷柏屬特有)[11].為了適應(yīng)特殊的生態(tài)位，例如吸引傳粉者，散播種子，對(duì)抗病原菌，防止食草動(dòng)物的啃食等，大部分植物的萜類物質(zhì)會(huì)發(fā)生譜系特異進(jìn)化，在各個(gè)亞家族中發(fā)生不同程度的擴(kuò)張和變異[10,12,13].萜類合成酶TPS基因家族在多種植物中都已經(jīng)被鑒定，例如在擬南芥[Arabidopsisthaliana(L.)Heynh.]中鑒定到32條，在玉米(ZeamaysL.)中鑒定到30條[14]，在水稻(OryzasativaL.)中鑒定到34條[11]，在陸地棉(GossypiumhirsutumL.)中鑒定出41條[15].然而，關(guān)于有名的香料植物竹葉花椒萜類合成酶基因家族的成員鑒定與功能研究卻還沒(méi)有相關(guān)報(bào)道.近年來(lái)隨著基因組測(cè)序技術(shù)的成熟，竹葉花椒基因組測(cè)序也已經(jīng)完成[16].因此，本研究開(kāi)展了竹葉花椒TPS基因家族的鑒定與表達(dá)分析，利用生物信息學(xué)方法深入解析了竹葉花椒TPS基因家族的進(jìn)化和表達(dá)模式，為進(jìn)一步探索竹葉花椒TPS基因的功能提供了參考，為深入探究竹葉花椒揮發(fā)油的合成調(diào)控提供重要的目標(biāo)基因.

2.1 材 料

竹葉花椒的全基因組數(shù)據(jù)，相關(guān)蛋白序列和GFF文件從Figshare(https://figshare.com/articles/dataset/The_chromosome-level_genome_assembly_of_Sichuan _pepper/14400884/1)網(wǎng)站下載獲取.擬南芥(A.thaliana)與甜橙[Citrus sinensis(L.)Osbeck]的蛋白序列分別來(lái)自于TAIR10(https://www.arabidopsis.org/)和 Phytozome13(https://phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Csinensis_v1_1)網(wǎng)站.

2.2.1 基因家族成員的鑒定和序列分析 根據(jù)TPS蛋白包含保守N端結(jié)構(gòu)域Terpene_synth(PF01397)和C端結(jié)構(gòu)域Terpene_synth_C(PF03936)的特征，從Pfam34.0網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)[17]下載這兩個(gè)隱馬爾科夫模型文件.分別用PF01397和PF03936隱馬爾科夫模型文件對(duì)竹葉花椒蛋白數(shù)據(jù)進(jìn)行hmmsearch，使用默認(rèn)閾值10.0，可以在初始搜索時(shí)覆蓋所有可能的TPS基因，最終得到兩個(gè)序列集，對(duì)這兩個(gè)數(shù)據(jù)集合并去冗余，得到hmmsearch的數(shù)據(jù)集(1).為了使數(shù)據(jù)集更完善，使用前人已鑒定的擬南芥TPS蛋白序列[18]，進(jìn)行blastp搜索竹葉花椒的蛋白庫(kù)，獲得竹葉花椒同源序列數(shù)據(jù)集(2).將數(shù)據(jù)集(1)和(2)合并去冗余，并在Pfam34.0網(wǎng)站(http://pfam.xfam.org/)[17]對(duì)合并得到的數(shù)據(jù)集進(jìn)行結(jié)構(gòu)域核查，獲得最終的竹葉花椒TPS基因列表.甜橙中的TPS基因序列采用同樣方法獲得.等電點(diǎn)，分子量等理化性質(zhì)分析用perl腳本計(jì)算完成.亞細(xì)胞定位使用WoLF PSORT網(wǎng)站(https://wolfpsort.hgc.jp/)進(jìn)行預(yù)測(cè).

2.2.2 系統(tǒng)發(fā)育分析 在MAFFT v7在線網(wǎng)站(https://mafft.cbrc.jp/alignment/software/)[19]對(duì)竹葉花椒、甜橙、擬南芥和三條經(jīng)過(guò)功能驗(yàn)證的胡椒木的TPS蛋白序列進(jìn)行多序列比對(duì)，比對(duì)好的序列在IQ-tree在線網(wǎng)站(http://iqtree.cibiv.univie.ac.at/)[20]上進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建，Bootstrap值設(shè)置為1000.竹葉花椒TPS基因類別劃分根據(jù)2011年Chen的系統(tǒng)發(fā)育分類標(biāo)準(zhǔn)[11].

2.2.3 基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析 使用在線網(wǎng)站MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)[21]對(duì)ZaTPSs保守基序進(jìn)行分析，預(yù)測(cè)值設(shè)置為20個(gè)；利用竹葉花椒基因組的GFF文件和蛋白序列，采用TBTOOLS[22]中的Gene Structure View 功能對(duì)竹葉花椒TPS基因結(jié)構(gòu)和保守基序進(jìn)行可視化繪圖.

2.2.4 染色體定位及基因重復(fù)類型分析 染色體定位使用以下幾個(gè)文件：MCScanX中的duplicate_gene_classifier程序生成的串聯(lián)重復(fù)對(duì)文件，染色體序列長(zhǎng)度文件，GFF文件以及竹葉花椒的TPS基因ID列表，運(yùn)行腳本生成Mapchart所需要的配置文件，在Mapchart軟件中進(jìn)行繪制和美化.竹葉花椒基因重復(fù)類型分析采用PGDD(http://chibba.agtec.uga.edu/duplication/)的方法進(jìn)行本地化分析.從基因組注釋文件中提取ZaTPSs基因家族成員的染色體定位信息和相關(guān)基因?qū)π畔?，而后使用MCScanX鑒定ZaTPSs基因的重復(fù)類型.

2.2.5 全基因組共線性分析 為了揭示竹葉花椒與其近緣種甜橙及模式植物擬南芥的TPS家族同源基因的共線性關(guān)系，比對(duì)三者基因組，進(jìn)行全基因組共線性分析，使用JCVI畫圖，竹葉花椒、甜橙和擬南芥的TPS基因在共線性塊中的連線將會(huì)高亮顯示.

2.2.6 基因表達(dá)模式分析 使用Hisat2軟件分別將竹葉花椒的頂芽、幼葉、成熟葉片、葉柄、幼花、種子、果皮、莖和皮刺9個(gè)不同組織的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/?term=Zanthoxylum+armatum)，比對(duì)到參考基因組上[16]，使用featurecounts R包計(jì)算TPM值[23]，分析竹葉花椒TPS家族基因在不同組織中的表達(dá)模式，使用TBTOOLS[22]軟件中的Heatmap功能完成可視化.

3.1 基因鑒定及理化性質(zhì)分析

在竹葉花椒基因組中鑒定出53個(gè)TPS基因.根據(jù)染色體位置信息分別命名，見(jiàn)表1.對(duì)ZaTPS蛋白理化性質(zhì)的分析結(jié)果顯示，ZaTPS蛋白長(zhǎng)度在173～859 aa之間，分子量在20.21～98.44 kD之間，等電點(diǎn)范圍在4.87～9.10，其中有52個(gè)成員偏酸性，只有1個(gè)成員偏堿性，說(shuō)明ZaTPSs蛋白質(zhì)在酸性環(huán)境下更容易沉淀.亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ZaTPSs大部分分布在葉綠體(49.06%)和細(xì)胞質(zhì)(39.62%)，少部分位于細(xì)胞核(9.43%)和線粒體(1.89%)中.

表1 竹葉花椒TPS基因家族成員信息

3.2 基因家族系統(tǒng)發(fā)育分析

使用32個(gè)擬南芥、28個(gè)甜橙和53個(gè)竹葉花椒TPS蛋白序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹，見(jiàn)圖1.三個(gè)物種的TPS基因聚為 6 個(gè)分支，分別對(duì)應(yīng)TPS基因的6個(gè)亞家族：TPS-a，TPS-b，TPS-c，TPS-e，TPS-f和TPS-g，在系統(tǒng)樹上每個(gè)亞家族的聚類關(guān)系都得到了很好的支持.在被子植物中，TPS-a和TPS-b是倍半萜和單萜的主要合成酶.在竹葉花椒中，TPS-a和TPS-b亞家族成員較多，分別為20條和24條，TPS-e和 TPS-f 亞家族中成員最少，只有1條.與之相似，甜橙的TPS-a和TPS-b亞家族成員也較多，分別為15條和9條，TPS-c和TPS-e亞家族成員較少，均為1條，TPS-f亞家族則一條也沒(méi)有.

圖1 竹葉花椒、甜橙和擬南芥TPS蛋白的系統(tǒng)發(fā)育樹

3.3 基因結(jié)構(gòu)及蛋白保守基序分析

利用MEME在線工具對(duì)ZaTPS蛋白序列進(jìn)行分析，并得到motif保守基序，根據(jù)含有保守基序的序列數(shù)目和其顯著性，依次命名為motif 1至20，見(jiàn)圖2.其中motif 1(E-value為7.5e-945)有TPS最典型的保守結(jié)構(gòu)域，“富含天冬氨酸殘基的DDxxD”，該殘基被認(rèn)為對(duì)金屬離子起到結(jié)合作用，從而在引導(dǎo)底物催化時(shí)發(fā)揮重要作用[24]，48個(gè)ZaTPSs都含有motif1.Motif 12包含TPS-a和TPS-b的保守基序“RRX8W”.包含Motif 20的序列條數(shù)最少，只有9條，都為TPS-b亞家族成員.整體來(lái)看，TPS-a 和TPS-b亞家族包含的保守基序較多，TPS-g亞家族保守基序較為一致，猜測(cè)TPS-g在竹葉花椒中比較保守.通過(guò)竹葉花椒全基因組GFF注釋文件和TPS基因家族CDS序列信息，統(tǒng)計(jì)外顯子和內(nèi)含子，分析發(fā)現(xiàn)53個(gè)ZaTPSs均正常編碼，但各成員外顯子個(gè)數(shù)存在差異，ZaTPS25外顯子數(shù)目最多，達(dá)到15個(gè).

圖2 竹葉花椒ZaTPSs保守基序分布及外顯子、內(nèi)含子分布

3.4 染色體定位及基因重復(fù)類型

染色體定位分析結(jié)果顯示竹葉花椒有44條ZaTPSs不均勻地分布在11條染色體上，結(jié)果見(jiàn)圖3，剩余的9個(gè)基因分布在未掛載到染色體上的片段序列中.其中14號(hào)染色體含有的ZaTPS基因最多，且主要為串聯(lián)重復(fù)，呈小型基因簇.16號(hào)，24號(hào)染色體上都分別發(fā)生了不同程度的串聯(lián)重復(fù).除了標(biāo)紅的幾個(gè)串聯(lián)重復(fù)基因簇外，還有一些基因分布距離較近，猜測(cè)是由比較古老的串聯(lián)重復(fù)形成.TPS基因分布最少的為3號(hào)、4號(hào)、10號(hào)、12號(hào)、15號(hào)、25號(hào)染色體，僅含有1個(gè)ZaTPS基因.同時(shí)，我們對(duì)ZaTPS基因重復(fù)類型的分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)座重復(fù)(TRD)(占24.53%)，串聯(lián)重復(fù)(TD)(占20.75%)和全基因組復(fù)制(WGD)(占20.75%)是竹葉花椒TPS基因家族擴(kuò)張的主要的驅(qū)動(dòng)因素.與甜橙物種分化后，竹葉花椒發(fā)生了一次特異的WGD事件[16]，這與WGD對(duì)竹葉花椒TPS基因特異擴(kuò)張的貢獻(xiàn)相吻合.

圖3 竹葉花椒TPS基因染色體定位

3.5 竹葉花椒、擬南芥及甜橙TPS基因全基因組共線性分析

我們對(duì)竹葉花椒、擬南芥及甜橙TPS基因進(jìn)行了全基因組共線性分析，見(jiàn)圖4.竹葉花椒有1條染色體上的TPS基因與擬南芥的TPS基因存在共線關(guān)系，有2條染色體與甜橙的TPS基因存在共線關(guān)系.與擬南芥相比，竹葉花椒與甜橙具有更近的基因進(jìn)化關(guān)系，共線基因?qū)?4對(duì)，而與擬南芥僅有1對(duì).竹葉花椒與甜橙的TPS共線性基因?qū)椭袢~花椒與擬南芥的TPS共線性基因?qū)χ?，沒(méi)有共享的ZaTPS基因.

圖4 竹葉花椒與甜橙及擬南芥TPS基因共線性分析

3.6 TPS基因在竹葉花椒中的表達(dá)模式分析

利用竹葉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析ZaTPSs在竹葉花椒頂芽、幼葉、成熟葉片、葉柄、幼花、種子、莖、皮刺和果皮中的表達(dá)量，見(jiàn)圖5.總體來(lái)看，ZaTPSs在竹葉花椒的各個(gè)部位都有表達(dá).相比于其他亞家族，TPS-a(log2TPM≈11.86)和TPS-b(log2TPM≈8.42)亞家族平均表達(dá)量大于其他亞家族.從各個(gè)組織的表達(dá)量來(lái)看，ZaTPSs在種子、成熟葉片和皮刺中表達(dá)量很低或不表達(dá)，但皮刺中ZaTPS51卻表達(dá)異常高(log2TPM≈11.85)，忽略此異常值后，ZaTPSs在幼花組織中平均表達(dá)量最突出，尤其是TPS-a(log2TPM≈3.30)，TPS-b(log2TPM≈2.89)和TPS-g(log2TPM≈4.97)亞家族成員，其中TPS-b亞家族的ZaTPS45和ZaTPS36在幼花中的表達(dá)量最多.TPS-g亞家族成員在種子、莖和皮刺中不表達(dá)，但在幼花中表達(dá)總量較明顯.除幼花組織外，ZaTPSs在果皮中總體表達(dá)量也比較高，最突出的是ZaTPS23(log2TPM≈8.79)，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與其聚為一支的ZaTPS24、ZaTPS42和ZaTPS51在果皮中也表達(dá)較高.一些基因在幼葉中有表達(dá)但在成熟葉中不表達(dá)，如ZaTPS4、ZaTPS6、ZaTPS7等，而一些基因在幼葉和成熟葉中都不表達(dá)，如ZaTPS14、ZaTPS44、ZaTPS52等.ZaTPS5、ZaTPS10、ZaTPS44只在莖中有微量表達(dá).

圖5 竹葉花椒TPS基因在不同組織中的表達(dá)熱圖(TD，頂芽；YL，幼葉；ML，成熟葉；PT，葉柄；YF，幼花；SD，種子；ST，莖；PK，皮刺；HK，果皮)，白色表示沒(méi)有表達(dá)，顏色越深表示表達(dá)值越高

4 討 論

TPS基因家族廣泛分布于各種生物體內(nèi)，參與多種生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程，發(fā)揮調(diào)節(jié)功能.目前，已在多種植物中鑒定到了大量的TPS基因家族成員，例如，在花椒(Z.bungeanum)中，鑒定得到70條TPS蛋白，TPS-a和TPS-b亞家族中成員最多，分別為23條和31條[25]，這與我們?cè)谥袢~花椒中確定的TPS基因數(shù)目大體相近.最近一項(xiàng)基于竹葉花椒轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的研究中，調(diào)查了果實(shí)中萜類合成通路的關(guān)鍵基因，篩選出28個(gè)表達(dá)顯著上調(diào)的關(guān)鍵基因，主要為以下幾個(gè)基因家族：TPS-like，GGPPS-like，GCPE-like和DXS-like，TPS-like中主要報(bào)道了5個(gè)TPS-a和TPS-b亞家族成員，但目前并沒(méi)有針對(duì)竹葉花椒TPS基因家族做全面系統(tǒng)性的研究和報(bào)道[26,27].鑒于竹葉花椒全基因組數(shù)據(jù)的發(fā)表，本研究開(kāi)展了竹葉花椒TPS基因家族的鑒定與表達(dá)分析，為進(jìn)一步了解ZaTPSs基因的功能提供了參考.

基于竹葉花椒全基因組數(shù)據(jù)，共有53條TPS基因被鑒定，其中TPS-a和TPS-b亞家族成員較多，分別為20條和24條，TPS-e和 TPS-f 中成員最少，只有1條，同科植物甜橙在TPS-a和TPS-b亞家族中成員也較多，分別為23條和16條，這一現(xiàn)象符合大多數(shù)被子植物中TPS家族分布的規(guī)律[14].通過(guò)統(tǒng)計(jì)竹葉花椒不同亞家族中的基因重復(fù)類型情況，我們發(fā)現(xiàn)TPS-a亞家族成員中35%來(lái)自于轉(zhuǎn)座重復(fù)，其次是串聯(lián)重復(fù)(25%)和全基因組復(fù)制(25%)，并且該亞家族中轉(zhuǎn)座重復(fù)來(lái)源的基因表達(dá)平均值最高.在TPS-b亞家族中，分散重復(fù)來(lái)源的基因占據(jù)了29.17%，其次是近端重復(fù)(20.83%)和轉(zhuǎn)座重復(fù)(20.83%)，然而在該亞家族中全基因組復(fù)制來(lái)源的基因表達(dá)平均值最高，其次是散在重復(fù).總體來(lái)說(shuō)，轉(zhuǎn)座重復(fù)(24.53%)，串聯(lián)重復(fù)(20.75%)和全基因組復(fù)制(20.75%)是竹葉花椒TPS基因家族擴(kuò)張的主要來(lái)源.轉(zhuǎn)座重復(fù)是一種通過(guò)DNA或RNA復(fù)制機(jī)制，將基因或基因片段從原來(lái)的位置轉(zhuǎn)移到一個(gè)新的染色體位置的基因重復(fù)類型[28].DNA轉(zhuǎn)座子，例如高粱(sorghum)的CACTA轉(zhuǎn)座元件，能夠?qū)⒒蚧蚧蚱我苿?dòng)到一個(gè)新的染色體位置，而基于RNA的轉(zhuǎn)座重復(fù)通常是指反轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座，能夠從信使RNA中的多個(gè)外顯子中產(chǎn)生單外顯子進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的基因?qū)?huì)轉(zhuǎn)座到一個(gè)新的染色體[29].結(jié)合竹葉花椒基因組中含有大量轉(zhuǎn)座元件的結(jié)構(gòu)特征，猜測(cè)TPS基因家族擴(kuò)張受到該結(jié)構(gòu)特征的影響.竹葉花椒與甜橙物種分化后，在大約26.6個(gè)百萬(wàn)年前發(fā)生過(guò)一次物種特異的全基因組復(fù)制事件，TPS基因家族的擴(kuò)張也受到了該事件的促進(jìn)[16].

萜類生成的前體是異戊烯焦磷酸(IPP)與其異構(gòu)體二甲基烯丙基二膦酸(DMAPP)，二者分別由發(fā)生在細(xì)胞質(zhì)中的甲羥戊酸途徑(MVA pathway)和質(zhì)體中的甲基赤蘚糖磷酸酯途徑(MEP pathway)生成[9].通過(guò)二者的變換結(jié)合，在萜類合成酶的作用下，生成一系列中間化合物：牻牛兒基焦磷酸(GPP)，橙花基焦磷酸(NPP)，法尼基焦磷酸(FPP)和牻牛兒牻牛兒基焦磷酸(GGPP)等，最終生成單萜、倍半萜、二萜等[30,31].根據(jù)TPS基因家族的亞細(xì)胞定位分布模式，倍半萜合酶一般定位于細(xì)胞質(zhì)中，單萜合酶都位于質(zhì)體中[11,32].亞細(xì)胞定位結(jié)果顯示ZaTPSs大部分定位在細(xì)胞質(zhì)和葉綠體，且TPS-a亞家族蛋白大部分分布于細(xì)胞質(zhì)中，TPS-b亞家族蛋白大部分分布于葉綠體中.眾所周知，TPS-a亞家族基因成員編碼倍半萜合酶，TPS-b亞家族基因成員編碼單萜合酶.這與大部分TPS-a分布在細(xì)胞質(zhì)中，大部分TPS-b分布于葉綠體中的事實(shí)相契合.有研究表明，代謝物質(zhì)合成的基因在染色體的基因排布上并不是隨意分散，而是彼此相鄰，形成基因簇.萜類合成酶基因形成基因簇有助于基因組合的共遺傳和共表達(dá)，減少單一通路基因在重組后丟失的可能性[33].染色體定位分析顯示，16號(hào)染色體和24號(hào)染色體上均有串聯(lián)重復(fù)，且16和24號(hào)染色體上分布的全為TPS-b亞家族的成員，猜測(cè)這加強(qiáng)了基因的共表達(dá).通過(guò)觀察竹葉花椒TPS基因在不同組織中的表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)，幼花中基因表達(dá)最為明顯，主要集中于TPS-a，TPS-b和TPS-g三個(gè)亞家族.在擬南芥TPS基因功能研究中發(fā)現(xiàn)，花器官中檢測(cè)到的萜類化合物數(shù)量最多，與兩個(gè)功能相關(guān)：吸引短距離內(nèi)的小型昆蟲進(jìn)行傳粉，另外可能與防御機(jī)制有關(guān)[34].玉米中，已有實(shí)驗(yàn)證明TPS23能夠調(diào)控石竹烯的釋放，來(lái)吸引食草動(dòng)物的天敵，間接達(dá)到驅(qū)趕食草動(dòng)物的目的[35].此外，在棉花中也發(fā)現(xiàn)能產(chǎn)生一系列具有殺蟲特性的萜類化合物，例如眾所周知的棉酚，半棉酚，殺食夜蛾素等[36].這說(shuō)明萜類作為一種具有重要生物學(xué)意義的揮發(fā)性有機(jī)化合物及其合成相關(guān)的TPS基因家族，很有可能在竹葉花椒吸引傳粉者、防止食草動(dòng)物的侵食、防御病原菌等方面起到重要作用，從而來(lái)適應(yīng)特殊的生態(tài)位.單萜和倍半萜為小分子萜類，多具有揮發(fā)性，在植物體內(nèi)常以揮發(fā)油的形式存在，ZaTPSs基因在果皮中也呈現(xiàn)較高的表達(dá)量，猜測(cè)與果皮合成、釋放揮發(fā)性物質(zhì)有關(guān).竹葉花椒同屬植物胡椒木中已有研究驗(yàn)證，ZpTPS1和ZpTPS2能夠催化FPP生成倍半萜(C15)，ZpTPS3催化GPP生成單萜(C10).將這三條ZpTPSs蛋白序列加入系統(tǒng)發(fā)育分析后發(fā)現(xiàn)，ZaTPS12、ZaTPS17-19和ZaTPS50與ZpTPS2聚為一支，得到了較高的支持率，猜測(cè)這幾個(gè)ZaTPSs基因也發(fā)揮與ZpTPS2同樣的功能.ZpTPS3在植物體內(nèi)催化形成單萜化合物，在系統(tǒng)進(jìn)化樹上與ZaTPS2、ZaTPS3、ZaTPS30、ZaTPS32-36和ZaTPS45、ZaTPS46聚為一支，這些基因在幼花和果皮中都有表達(dá)，但在幼葉和成熟葉中表達(dá)有所差別，在成熟葉中不表達(dá)，推測(cè)這些基因在幼花和果實(shí)中功能較為保守，參與幼花和果實(shí)單萜類化合物的合成，在葉中不會(huì)持續(xù)表達(dá).ZaTPS23在果皮中表達(dá)量最高，在系統(tǒng)發(fā)育樹上與其聚為一支的ZaTPS24、ZaTPS42和ZaTPS51在果皮中也表達(dá)較高，推測(cè)這些成員都參與了果皮中揮發(fā)油的合成，后續(xù)的功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)可通過(guò)基因敲除或過(guò)表達(dá)實(shí)驗(yàn)來(lái)觀察果皮中揮發(fā)油含量的變化[37].

綜上所述，基于全基因組數(shù)據(jù)，本研究全面地鑒定了竹葉花椒中TPS基因家族成員，并對(duì)其分類、進(jìn)化和表達(dá)模式進(jìn)行了深入分析，為后續(xù)功能驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提供了重要的理論依據(jù)，為探究竹葉花椒的生態(tài)適應(yīng)性提供了備選基因，同時(shí)為竹葉花椒揮發(fā)油應(yīng)用的研究提供了理論指導(dǎo).