丹參多糖緩解小鼠乳腺炎癥和過氧化反應(yīng)的作用與機(jī)制

靳國忠，竇萌萌，張 迪，劉 維，吳占軍，史萬玉，2*，包永占* (.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 中獸醫(yī)學(xué)院，河北 保定 07000；2.河北省獸用中藥制劑技術(shù)創(chuàng)新中心，河北 辛集 52690；.河北省農(nóng)林科學(xué)院 糧油作物研究所，河北 石家莊 05005)

奶牛乳腺炎是困擾奶牛養(yǎng)殖業(yè)的主要疾病之一[1]。常規(guī)的抗生素治療，存在耐藥性和藥殘問題[2-3]，極易影響乳品質(zhì)量，導(dǎo)致經(jīng)濟(jì)損失。當(dāng)下國家穩(wěn)步推行的畜禽養(yǎng)殖端“減抗限抗”行動，使中藥及其提取物的使用成為了研究的新熱點(diǎn)[4]。作為丹參的有效成分，丹參多糖一定程度上保留了丹參的抗炎抗感染作用[5]，本實(shí)驗(yàn)室前期試驗(yàn)表明丹參多糖能夠降低炎性因子水平[6]，拮抗肝臟脂質(zhì)過氧化反應(yīng)[7]，緩解小鼠免疫性肝損傷。丹參多糖在乳腺組織的抗炎抗氧化作用尚未明確，本試驗(yàn)旨在以丹參多糖為研究對象，研究其對小鼠乳腺炎癥損傷的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制，為丹參多糖在奶牛養(yǎng)殖上的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料丹參多糖(杭州正大青春寶藥業(yè)有限公司)；脂多糖(LPS)干粉試劑，總一氧化氮合成酶(T-NOS)，還原型谷胱甘肽(GSH)，丙二醛(MDA)購自Sigma公司；超氧化物歧化酶(SOD)和過氧化氫酶(CAT)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；IKK抗體，IκB-α和P65抗體購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司；TNF-α；IL-6和IL-1β ELISA試劑盒購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司；總RNA提取試劑盒，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，實(shí)時熒光定量PCR引物(表1)，免疫熒光試劑購自寶生物工程(大連)有限公司；免疫組化試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；8周齡，35 g左右的實(shí)驗(yàn)用昆明小鼠購自斯貝福(北京)生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動物許可證號SCXK(京)2019-0011。

表1 實(shí)時熒光定量PCR引物及相關(guān)信息

1.2 動物分組與處理將120只成年昆明小鼠(30只雄鼠、90只雌鼠)按照雌雄比例3∶1合籠飼養(yǎng)。檢查確認(rèn)雌鼠受孕后與雄鼠分離單籠飼養(yǎng)靜待分娩。選取60只分娩母鼠隨機(jī)分成A(空白對照組)、B(模型組)、C(250 mg/kg丹參多糖低劑量組)、D(500 mg/kg丹參多糖中劑量組)以及E(750 mg/kg丹參多糖高劑量組)5組，每組12只。母鼠分娩后，按分組劑量對其進(jìn)行連續(xù)1周的灌胃(0.2 mL/只)，模型組和對照組灌服等體積生理鹽水。灌胃1周后進(jìn)行乳腺炎的造模：用10%水合氯醛麻醉母鼠，以酒精棉球?qū)Φ?對乳頭進(jìn)行消毒，輕輕剪去乳頭前端暴露乳腺導(dǎo)管，使用磨鈍的30 g針頭通過乳導(dǎo)管緩慢注入LPS溶液(2 g/L)，每側(cè)50 μL。造模完成后，將母鼠與仔鼠分離飼養(yǎng)24 h，眼球采血后處死，分離血清，剝離乳腺組織備用。將一部分乳腺組織固定于4%甲醛溶液，另一部分于-80℃保存。

1.3 指標(biāo)的檢測

1.3.1小鼠臨床表現(xiàn)及乳腺剖檢變化觀察 造模后，觀察各組母鼠精神狀態(tài)差異，外觀變化，24 h后脫頸處死母鼠，小心剪開腹部皮膚，充分暴露兩側(cè)乳腺組織。觀察不同組別之間乳腺組織的變化。

1.3.2乳腺組織病理學(xué)觀察 嚴(yán)格按照石蠟切片的制作流程對固定好的乳腺組織進(jìn)行石蠟切片制作。對制作好的切片進(jìn)行H&E染色，中性樹脂封片。顯微鏡下觀察各組乳腺組織的病理學(xué)變化。

1.3.3血清中炎性因子水平測定 對各組小鼠應(yīng)用眼球采血法采血并分離血清，按照ELISA試劑盒說明書測定TNF-α、IL-6、IL-1β的水平。

1.3.4乳腺組織中過氧化指標(biāo)含量測定 從-80℃冰箱中取出乳腺組織，按照各氧化指標(biāo)試劑盒說明書操作，制成組織勻漿。進(jìn)行T-NOS、 GSH、 MDA、 SOD和CAT指標(biāo)檢測。

1.3.5乳腺組織中IκB-α、IKK和NF-κB蛋白的表達(dá)水平測定 使用防脫載玻片制作石蠟切片，對制作好的石蠟切片進(jìn)行免疫組化染色，特異性抗體孵育完成后進(jìn)行常規(guī)封片。晾干后高倍顯微鏡下觀察，蛋白的陽性反應(yīng)呈棕黃色圓點(diǎn)狀聚集。隨機(jī)拍下視野后，使用ImageJ軟件計算各組陽性表達(dá)的光密度值，進(jìn)行半定量分析。

1.3.6乳腺組織中IκB-α、IKK和NF-κB mRNA表達(dá)水平測定 從-80℃超低溫冰箱中取出小鼠乳腺組織，按照總RNA提取試劑盒操作說明，在無菌無酶的條件下使用經(jīng)高壓的器械嚴(yán)格操作，提取mRNA，測定和調(diào)整濃度后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。使用反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA，按照實(shí)時熒光定量PCR說明書進(jìn)行各指標(biāo)的mRNA水平檢測。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析使用 Excel軟件和GraphPadPrism 7.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。組間多樣本使用單因素方差分析(ANOVA)，同時進(jìn)行組間比較，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 丹參多糖對各組小鼠臨床表現(xiàn)及乳腺病理變化的影響空白對照組小鼠精神狀態(tài)活躍，食欲正常，體表被毛柔順有光澤，剖檢可見乳腺中乳汁充盈；模型組小鼠精神萎靡，基本不食，畏寒扎堆，體表被毛雜亂，剖檢見乳腺紅腫、有出血點(diǎn)。丹參多糖用藥組小鼠精神略萎靡，食欲好于模型組小鼠，剖檢可見乳腺紅腫減輕和出血面積減小。

2.2 丹參多糖對各組小鼠乳腺剖檢變化的影響如圖1所示，空白對照組乳腺組織可觀察到完整的細(xì)胞形態(tài)和結(jié)構(gòu)，乳腺細(xì)胞細(xì)胞核清晰可見，所構(gòu)成的腺泡也完整清晰，無炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤，無病理特征；模型組乳腺組織中可以觀察到有大量的炎性細(xì)胞浸潤，部分區(qū)域腺泡壁崩解，腺泡完整性被破壞；各丹參多糖用藥組炎性細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的浸潤與模型組相比顯著減少，其中丹參多糖高劑量組基本無炎性細(xì)胞浸潤，腺泡整體結(jié)構(gòu)趨向于空白對照組乳腺組織的狀態(tài)。

A.空白對照組；B.模型組；C.丹參多糖低劑量組；D.丹參多糖中劑量組；E.丹參多糖高劑量組。圖中箭頭所指代表小鼠乳腺組織中炎性細(xì)胞浸潤和腺泡壁結(jié)構(gòu)被破壞圖1 丹參多糖對乳腺炎小鼠乳腺組織病理學(xué)變化的影響(×400)

2.3 丹參多糖對小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β表達(dá)水平的影響如圖2所示，與空白對照組相比，模型組和各用藥組的IL-1β、TNF-α和IL-6的表達(dá)水平均顯著升高(P<0.05或P<0.01)；與模型組相比，除IL-1β的表達(dá)水平與低劑量組與模型組無顯著性差異外，各用藥組炎性因子水平都顯著降低(P<0.05或P<0.01)，且具有劑量依賴性。

A.丹參多糖對血清TNF-α表達(dá)水平的影響；B.丹參多糖對血清IL-6表達(dá)水平的影響；C.丹參多糖對IL-1β表達(dá)水平的影響。與空白對照組相比，*代表P<0.05，**代表P<0.01；與模型組相比，#代表 P<0.05，##代表P<0.01。下同圖2 丹參多糖對小鼠乳腺組織中炎性因子表達(dá)水平的影響

2.4 丹參多糖對小鼠乳腺組織中過氧化指標(biāo)的影響如圖3所示，模型組T-NOS酶活力水平較空白對照組顯著上升(P<0.05)，用藥組與空白對照組無顯著性差異，用藥組與模型組相比，除低劑量組外，中、高劑量組均顯著降低(P<0.05)；模型組MDA含量顯著高于空白對照組(P<0.01)，低劑量組與空白對照組相比具有顯著性差異(P<0.05)，中高劑量組與空白對照組相比無顯著性差異，用藥組與模型組相比，MDA含量均顯著性降低(P<0.05或P<0.01)；模型組SOD含量與空白對照組相比顯著降低(P<0.01)，用藥組與模型組相比均顯著性升高(P<0.01)，低劑量組與空白對照組具有顯著性差異(P<0.05)；GSH水平上，與空白對照組相比，模型組存在極顯著性差異(P<0.01)，低、中劑量組存在顯著性差異(P<0.05)，與模型組相比，低、中劑量組無顯著性差異，高劑量組顯著升高(P<0.01)；模型組和用藥組CAT與空白對照組相比均顯著降低(P<0.05或P<0.01)，與模型組相比，中、高劑量組顯著升高(P<0.01)，低劑量組無顯著性差異。

圖3 丹參多糖對小鼠乳腺組織中過氧化指標(biāo)表達(dá)水平的影響

2.5 丹參多糖對小鼠乳腺組織中IκB-α、IKK和NF-κB表達(dá)水平的影響

2.5.1丹參多糖對各組小鼠乳腺組織IκB-α表達(dá)水平的影響 如圖4A所示，與空白對照組相比，模型組小鼠乳腺組織中IκB-α的表達(dá)水平顯著升高(P<0.01)；丹參多糖各用藥組與模型組相比顯著降低(P<0.01)；低劑量丹參多糖組與空白對照組間存在顯著性差異(P<0.01)，中、高劑量丹參多糖組與空白對照及模型組之間無顯著性差異。

圖4A 丹參多糖對各組小鼠乳腺組織中IκB-α表達(dá)水平的影響

2.5.2丹參多糖對各組小鼠乳腺組織IKK表達(dá)水平的影響 如圖4B所示，模型組小鼠乳腺組織中IKK蛋白的表達(dá)水平顯著高于空白對照組(P<0.01)；丹參多糖用藥組與模型組相比，小鼠乳腺組織的IKK蛋白表達(dá)水平均有顯著性降低(P<0.01)；丹參多糖各劑量組與空白對照組比較均存在顯著性差異(P<0.01)。

圖4B 丹參多糖對各組小鼠乳腺組織中IKK表達(dá)水平的影響

2.5.3丹參多糖對各組小鼠乳腺組織NF-κB表達(dá)水平的影響 如圖4C所示，與空白對照組相比，模型組NF-κB表達(dá)水平顯著上升(P<0.01)；與模型組相比，丹參多糖各用藥組NF-κB表達(dá)水平顯著降低(P<0.05或P<0.01)；低、高劑量丹參多糖組與空白對照組之間均存在不同程度的顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，中劑量組與空白對照組無顯著性差異。

圖4C 丹參多糖對各組小鼠乳腺組織中NF-κB表達(dá)水平的影響

2.6 丹參多糖對小鼠乳腺組織中IκB-α、IKK和NF-κB mRNA表達(dá)水平的影響如圖5所示，模型組小鼠乳腺組織中IκB-α、IKK和NF-κB mRNA的表達(dá)水平顯著高于空白對照組(P<0.01)；各丹參多糖劑量組與模型組相比較，除低劑量組小鼠乳腺組織中NF-κB的mRNA水平與模型組無顯著性差異外，其余3個用藥組的各個指標(biāo)與模型組之間均存在顯著性差異(P<0.05或P<0.01)，且降低趨勢上呈現(xiàn)出劑量依賴性。

圖5 丹參多糖對各組小鼠乳腺組織中IκB-α(A)、IKK(B)、NF-κB(C)mRNA表達(dá)的影響

3 討論

中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞大量浸潤是炎癥發(fā)生時乳腺組織的病理特征。在LPS誘導(dǎo)的急性炎癥中，中性粒細(xì)胞被募集到炎癥發(fā)生的部位以進(jìn)行機(jī)體的免疫應(yīng)答[8]，有研究表明，巨噬細(xì)胞的自噬水平可以影響促炎性因子IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)水平[9]。組織中巨噬細(xì)胞數(shù)量的多寡間接的反映了炎性因子的表達(dá)水平以及炎癥的嚴(yán)重程度。本試驗(yàn)中，乳腺炎小鼠模型的構(gòu)建主要參考了闞興池[10]的試驗(yàn)方法，并作了符合本試驗(yàn)實(shí)際情況的改進(jìn)。結(jié)果顯示，模型組小鼠乳腺組織中炎性細(xì)胞浸潤程度顯著大于空白對照組，并且丹參多糖用藥組小鼠乳腺組織炎性細(xì)胞浸潤程度明顯低于模型組。這既表明成功建立了乳腺炎癥模型，又說明丹參多糖在日常飼料中的添加可以減緩乳腺炎癥的損傷程度。

作為主要的促炎因子，IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)上調(diào)促進(jìn)了機(jī)體炎癥的發(fā)生。在發(fā)生炎癥時如何減少這些促炎因子的表達(dá)，就成為了研究如何緩解炎癥對機(jī)體損傷的關(guān)鍵點(diǎn)。相關(guān)研究通過減少IL-1β、IL-6和TNF-α的表達(dá)[11-13]，成功的緩解了細(xì)胞水平的炎癥損傷。本試驗(yàn)結(jié)果表明，丹參多糖用藥后降低了促炎因子的表達(dá)，抑制了炎癥的發(fā)生和發(fā)展，而且這些促炎因子水平的下降和丹參多糖用藥劑量呈正相關(guān)。

奶牛乳腺炎的致病因素主要是以革蘭陰性菌為主的大腸桿菌及其在動物機(jī)體內(nèi)增殖過程中產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，這些代謝產(chǎn)物中又以LPS最為經(jīng)典[14]。LPS誘導(dǎo)炎癥發(fā)生主要是通過激活TLR4信號通路[15]，有研究通過藥物抑制了NF-κB信號通路從而截斷了TLR4信號通路的傳導(dǎo)，以此達(dá)到了緩解炎癥的目的[16]。因此，有理由認(rèn)為NF-κB信號通路直接影響了炎癥的發(fā)生程度。使用藥物調(diào)控這些因子可能是緩解炎癥造成損傷的一種保健和治療思路。闞興池[10]通過藥物抑制AKT/IKK/NF-κB信號通路減少了促炎癥介質(zhì)的產(chǎn)生，達(dá)到了減輕乳腺組織炎癥的目的。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組IKK、IκB和NF-κB的表達(dá)水平顯著上升，這與MUHAMMAD等[17]研究中IκB等蛋白發(fā)生的過表達(dá)變化相一致。丹參多糖用藥組IKK、IκB和NF-κB的表達(dá)水平較模型組均有顯著下降；在mRNA水平上，模型組與空白對照組比，用藥組與模型組比，IKK、IκB和NF-κB的變化趨勢與蛋白表達(dá)水平變化趨勢基本相同。表明丹參多糖可以有效地抑制IKK、IκB和NF-κB在小鼠乳腺組織中的表達(dá)水平。丹參多糖可以在一定程度上通過抑制NF-κB信號通路的激活緩解炎癥對乳腺組織的損傷。

NF-κB信號通路的激活是乳腺炎癥發(fā)生的機(jī)制之一，而直接造成乳腺組織損傷的是組織本身發(fā)生的氧化應(yīng)激。機(jī)體通過動態(tài)的調(diào)控自由基的產(chǎn)生和清除，維持自身的健康狀態(tài)。當(dāng)發(fā)生炎癥或有其他因介入時，自由基的動態(tài)平衡難以維持，氧化應(yīng)激就會產(chǎn)生[18]。一氧化氮(NO)作為一種小氣體分子，在機(jī)體組織中屬于不穩(wěn)定的信號介質(zhì)。NO在機(jī)體中的活動，會促進(jìn)炎癥向更高程度轉(zhuǎn)歸，使用藥物抑制NO的產(chǎn)生，可以緩解細(xì)胞受到的氧化應(yīng)激。由于NO的不穩(wěn)定，在測定上存在一定的難度，可通過檢測誘導(dǎo)NO產(chǎn)生的T-NOS的活力，間接測定NO在機(jī)體組織中的變化。MDA和SOD經(jīng)常配合使用來測定機(jī)體的抗氧化能力和氧化損傷程度。通過藥物上調(diào)SOD清除機(jī)體氧自由基的能力，增強(qiáng)組織的抗氧化能力，可以維持組織在炎癥和氧化應(yīng)激中的健康狀態(tài)。利用藥物減少M(fèi)DA在機(jī)體中的累積，可以緩解氧自由基對機(jī)體的攻擊損傷。蘇芮[19]的研究在一定程度上揭示了硒的添加可以提升SOD活力，降低MDA含量，最終達(dá)到了減緩奶牛乳腺細(xì)胞的氧化應(yīng)激的目的。GSH作為一種三肽，是GSH-PX和GSH-ST 2種酶的重要底物，可以幫助酶分解氫過氧化物。作為重要的非酶類抗氧化物，GSH的含量反映了機(jī)體的抗氧化能力。于冬冬等[20]從GSH和GSH-PX的角度，通過針灸的方法有效的提升了肝損傷模型小鼠體內(nèi)GSH的水平，改善了小鼠肝細(xì)胞的炎癥，增強(qiáng)了小鼠肝細(xì)胞的抗氧化能力。CAT是一種關(guān)鍵的抗氧化酶，可以有效地清除組織中的氫過氧化物。張雅等[21]研究發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)液中維生素E的添加可以提升H2O2處理的奶牛乳腺細(xì)胞中CAT的活性，這與本試驗(yàn)中口服丹參多糖后的造模組小鼠的乳腺組織中過氧化氫酶活性的變化結(jié)果相一致。

綜上，丹參多糖能夠抑制NF-κB信號通路相關(guān)因子的激活，增強(qiáng)乳腺組織的抗氧化能力，最終減輕乳腺組織炎癥的損傷程度。該結(jié)果為應(yīng)用丹參多糖防治奶牛乳房炎提供了理論依據(jù)。