秦嶺大熊貓精漿指標(biāo)對(duì)精液品質(zhì)的影響

董賀孟，馬永杰，趙鵬鵬，沈潔娜，張丹輝，齊 航，靳亞平，雷穎虎*，林鵬飛* (.西北農(nóng)林科技大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，陜西 楊凌，700;.陜西省秦嶺大熊貓研究中心,陜西 樓觀臺(tái)，7040)

秦嶺大熊貓是大熊貓的重要亞種種群，具有獨(dú)特的形態(tài)特征和遺傳特性，提升秦嶺大熊貓種群數(shù)量，對(duì)于改變秦嶺大熊貓種群瀕危狀況和保護(hù)我國(guó)大熊貓遺傳多樣性具有重要的意義[1]。近幾年來，人工授精取得成功已成為圈養(yǎng)大熊貓繁育的主要方式[2]。但大熊貓精液資源稀缺珍貴，射精量一般在5 mL以內(nèi)[2]，如何最大限度地利用其遺傳資源，提高人工授精率和繁殖力，一直是人們研究的重點(diǎn)。

精液由精子和精漿組成，精漿中富含蛋白質(zhì)和各種化學(xué)成分，與精液品質(zhì)密切相關(guān)[3]，在雄性生育力判定和不育診斷中有重要的應(yīng)用價(jià)值。目前，針對(duì)大熊貓精液特性、精液品質(zhì)與雄性大熊貓繁育能力關(guān)系的研究已有報(bào)道[3]，但關(guān)于大熊貓精漿成分方面的研究較少。已有研究發(fā)現(xiàn)，精漿中果糖的主要作用是為精子活動(dòng)提供能量來源，是影響雄性繁殖能力的重要指標(biāo)[4]；精漿中檸檬酸對(duì)精子活力和密度有一定的影響[5]；精漿微量元素在精子成熟、運(yùn)動(dòng)、激活以及受精過程中發(fā)揮著重要作用[6]；精漿中的Zn能維持睪丸內(nèi)精子生精上皮的功能[7]；精漿中活性氧(reactive oxygen species，ROS)的濃度會(huì)影響精子的活力、質(zhì)膜完整性和頂體完整性[8]。本試驗(yàn)通過檢測(cè)4只雄性大熊貓精漿中糖類、微量元素以及ROS等物質(zhì)含量，比較其對(duì)精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性的影響，初步分析精漿指標(biāo)對(duì)秦嶺大熊貓精液品質(zhì)的影響，以期對(duì)精液的保存提供一定的理論依據(jù)及技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 精液采集在繁殖季節(jié)通過電刺激收集陜西野生動(dòng)物研究中心的性成熟雄性大熊貓的精液。大熊貓?jiān)诮?2 h后注射鹽酸氯胺酮(8 mg/kg，肌注)和氟烷麻醉，然后對(duì)大熊貓進(jìn)行10～90 mA 電刺激5 s，間隔2 s進(jìn)行采精。將新鮮精液收集到37℃ 預(yù)熱無菌杯中，并用稀釋劑(Irvine Scientific 90129)按1∶1 稀釋。本次大熊貓精液采集工作符合《中華人民共和國(guó)野生動(dòng)物保護(hù)法》和《陜西省野生動(dòng)植物保護(hù)條例》的規(guī)定。此外，所有操作都經(jīng)西北農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物護(hù)理和實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 精液的采集與處理在3-4月繁殖季節(jié)，通過電刺激收集性成熟雄性大熊貓的精液。采精前大熊貓禁食12 h，注射鹽酸氯胺酮(8 mg/kg，IM)和氟烷對(duì)大熊貓進(jìn)行麻醉；使用電射精器給予10～90 mA 電刺激，持續(xù)5 s，間歇2 s，進(jìn)行電刺激采精；將精液直接收集到37℃預(yù)熱無菌玻璃燒杯中，于1 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

1.3 精子活率檢測(cè)使用精子全自動(dòng)分析儀(Naturegene Sperm Tracker)對(duì)上述采集的精液進(jìn)行活率檢測(cè)。

1.4 質(zhì)膜完整性檢測(cè)采用精子尾部低滲腫脹試驗(yàn)(HOS)分析大熊貓精子質(zhì)膜完整性。

低滲液配制：稱取檸檬酸鈉0.735 g，果糖1.35 g溶于100 mL蒸餾水中，用0.22 μm濾器過濾，4℃保存?zhèn)溆?離子濃度0.15 mol/L，滲透壓為150 mOsm)。

將低滲液預(yù)熱至37℃后，用其稀釋調(diào)整精子密度至1×106～2×106個(gè)/mL，然后放入37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中孵育30 min，取10 μL滴于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上，400×倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)400個(gè)精子，計(jì)算精子尾部出現(xiàn)膨脹的百分率。

質(zhì)膜完整精子百分率=(尾部膨脹精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù))×100%

1.5 頂體完整性檢測(cè)采用異硫氰酸酯熒光素標(biāo)記的花生凝集素(FITC-PNA，購(gòu)自VECTOR LABORATORIES)染色法對(duì)精子進(jìn)行頂體完整率檢測(cè)。在干凈載玻片上制備1×105個(gè)/mL精子涂片，并使其干燥；甲醇固定10 min后，加入30 μL FITC-PNA染液，置于37℃濕盒，避光孵育30 min；PBS沖洗3次，指甲油封片；置于熒光顯微鏡下觀察，評(píng)估400個(gè)精子以上。

頂體完整精子百分率=(頭部發(fā)綠色熒光精子數(shù)/計(jì)數(shù)精子總數(shù))×100%

1.6 精漿指標(biāo)測(cè)定將大熊貓精液于4℃ 1 000 r/min離心10 min，收集上清精漿。檸檬酸(南京建成生物工程研究所)、鋅(南京建成生物工程研究所)、果糖(南京建成生物工程研究所)和ROS(江萊生物有限公司)的檢測(cè)按照試劑盒說明書進(jìn)行。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析使用GraphPad Prism 6.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用One-way ANOVA對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，顯著性閾值設(shè)置為P<0.05；各參數(shù)之間相關(guān)性分析采用Pearson檢驗(yàn)，其中|r|≤0.500為弱相關(guān)，0.500<|r|≤0.800為中等相關(guān)，|r|>0.800為強(qiáng)相關(guān)。

2 結(jié)果

2.1 秦嶺大熊貓精液品質(zhì)的檢測(cè)如表1所示，采集的4只秦嶺雄性大熊貓年齡為12～17歲，體質(zhì)量為113～125 kg，采精量為2.6～7.5 mL。4只雄性大熊貓的平均精子活率為(82.75±5.74)%、質(zhì)膜完整性為(81.04±4.35)%，頂體完整性為(47.10±8.11)%，其中Panda B和Panda C的精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性顯著高于Panda A和Panda D(表2，P<0.05)。

表1 雄性大熊貓基本信息

表2 精子活率以及質(zhì)膜和頂體完整性檢測(cè) %

2.2 秦嶺大熊貓精漿指標(biāo)檢測(cè)對(duì)上述4只雄性大熊貓的主要精漿指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果如圖1所示，Panda D中ROS含量顯著高于其他3只大熊貓(P<0.01)，其他3只大熊貓ROS含量無差異，平均值為(17.63±1.03) U/L；Panda B和Panda C的檸檬酸以及Zn含量無差異，但均顯著高于Panda A和Panda D(P<0.01)；4只大熊貓間果糖含量無差異，平均值為(4.41±0.26) g/L。

圖1 雄性大熊貓精漿指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.3 秦嶺大熊貓精漿指標(biāo)與精液品質(zhì)相關(guān)性分析表3中Pearson相關(guān)性分析結(jié)果所示，精漿中ROS含量與精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性呈顯著負(fù)相關(guān)性，檸檬酸和Zn含量與精子活率、質(zhì)膜完整性與頂體完整性呈顯著正相關(guān)性，而果糖含量與精子活率、質(zhì)膜完整性和頂體完整性無相關(guān)性。

表3 精漿指標(biāo)與精液品質(zhì)相關(guān)性分析

3 討論

人工授精過程中，精液質(zhì)量尤為重要，直接影響受精的成敗。精液由精子細(xì)胞和基質(zhì)精漿共同組成。精漿中富含精子活動(dòng)需求的蛋白質(zhì)、酶和各種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)(果糖、檸檬酸和鋅等)，具有保護(hù)精子活力、質(zhì)膜和頂體完整性的作用。有研究表明，大熊貓精漿中谷草轉(zhuǎn)氨酶活性與精子活力呈極顯著負(fù)相關(guān)[9]；大熊貓精漿中乙酰水解酶水平與精子活力等質(zhì)量指標(biāo)呈顯著負(fù)相關(guān)[10]。以上研究證明精漿中的成分直接影響精子的質(zhì)量，因此探究大熊貓精漿成分含量具有重要意義。

果糖是精液中精子的唯一能量來源，被分解后形成ATP，直接為精子的運(yùn)動(dòng)提供動(dòng)力支持，果糖含量較低時(shí)，精子存活率也會(huì)較低[6]。有研究表明，在人醫(yī)上正常果糖濃度患者精子濃度明顯低于異常果糖濃度患者，精子濃度同精漿果糖濃度之間有著密切關(guān)系[11]，但是本試驗(yàn)研究顯示，精漿中果糖濃度對(duì)秦嶺大熊貓的精子活率、頂體和質(zhì)膜完整性無顯著相關(guān)性。綜合來看，這4只大熊貓的精子活率整體處于較高水平，為(82.75±5.74)%，因此(4.41±0.26) g/L 果糖對(duì)精液品質(zhì)無顯著影響，這可能和種屬差異有關(guān)。Zn是精漿中重要的微量元素之一，具有維持睪丸內(nèi)精子生精上皮的功能，可促進(jìn)雄性動(dòng)物生殖器官發(fā)育，影響垂體分泌促性腺激素，同時(shí)參與精子內(nèi)糖的酵解和氧化過程，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性[12]。研究證明，給予嚴(yán)重少精癥患者適當(dāng)補(bǔ)充 Zn 可能會(huì)有效改善精液質(zhì)量[13]；精液黏稠度增高組精漿Zn含量亦明顯下降[14]。大熊貓精漿中Zn含量與精子活率、頂體和質(zhì)膜完整性呈極顯著正相關(guān)，進(jìn)一步證實(shí)了Zn對(duì)大熊貓精液品質(zhì)發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用。檸檬酸是由前列腺細(xì)胞分泌，主要生理功能是維持精液的滲透壓及酸堿度平衡，同時(shí)提高精子的活力。本試驗(yàn)中檸檬酸與精子活率、頂體和質(zhì)膜完整性呈正相關(guān)，證實(shí)了檸檬酸的含量會(huì)影響大熊貓精液品質(zhì)。雄性動(dòng)物生殖器官在生精過程中會(huì)產(chǎn)生大量的ROS，ROS會(huì)對(duì)精子的質(zhì)膜、頂體等結(jié)構(gòu)完整性造成損害，從而對(duì)精子的受精能力造成不可逆轉(zhuǎn)的破壞[15]。Panda D中ROS含量顯著高于其他3只大熊貓，同時(shí)Panda D的精子活率、頂體和質(zhì)膜完整性是最低的，可能表明Panda D精漿中高濃度的ROS對(duì)精液品質(zhì)產(chǎn)生了顯著影響。目前已有研究表明在大熊貓精液稀釋液中加入白藜蘆醇等具有抗氧化作用的添加物，可保護(hù)大熊貓精子免受氧化應(yīng)激[16]。本試驗(yàn)中所得的結(jié)果可為后續(xù)開展大熊貓精液保存技術(shù)提供一定的理論支持，根據(jù)已有研究，或可通過對(duì)大熊貓精液保護(hù)液中添加相關(guān)物質(zhì)來延長(zhǎng)大熊貓精液保存期，提升大熊貓精液保存質(zhì)量。

綜上所述，果糖濃度對(duì)秦嶺大熊貓的精子活率、頂體和質(zhì)膜完整性無顯著相關(guān)性；Zn含量與精子活率、頂體和質(zhì)膜完整性呈極顯著正相關(guān)；檸檬酸含量與精子活率、頂體和質(zhì)膜完整性呈正相關(guān)；ROS含量與精液品質(zhì)呈顯著負(fù)相關(guān)。因此，在精液保存中，可通過在大熊貓精液保護(hù)液中添加相關(guān)物質(zhì)來調(diào)整精漿中Zn、檸檬酸及ROS含量進(jìn)而提升精液保存質(zhì)量。