黃容容 張子君 解夢園 茍 靜 李 晴 馬 坤 向 明

（華中科技大學同濟醫(yī)學院藥學院生物藥學系，武漢 430030）

代謝綜合征（metabolic syndrome，MS）是多種代謝紊亂癥候群在同一個體聚集的慢性疾病，表現(xiàn)為高血糖、高血壓、血脂異常、腹部肥胖等，易誘發(fā)糖尿病、脂肪肝病以及心血管疾病［1-2］。近年來MS 患者大量增加，亟需開發(fā)治療MS 的藥物［3］。MS 發(fā)病機制是代謝紊亂和慢性炎癥相互影響：肝臟和脂肪組織代謝異常易出現(xiàn)胰島素抵抗，導致肥胖、高血脂［4］；肥胖環(huán)境下脂肪擴張引發(fā)Th1 細胞、M1 型巨噬細胞以及IL-6、TNF-α 等過度產(chǎn)生，形成慢性炎癥，促進脂肪分解，引起血漿脂肪酸升高［5-6］。據(jù)報道人參皂苷G-Rh2具有抗糖尿病、肥胖、炎癥等藥理活性，本課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)G-Rh2 對肝臟脂肪酸代謝和免疫有調(diào)節(jié)作用［7-9］。本文旨在探究G-Rh2對MS的治療作用，并通過代謝和免疫調(diào)節(jié)途徑探究其作用機制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 6周齡雄性C57BL/6J小鼠40只，SPF 級，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，合格證號：42000600036134。飼養(yǎng)于華中科技大學實驗動物中心（溫度25 ℃，相對濕度60%），許可證號SYXK（鄂）2016-0057，適應性喂養(yǎng)1 周后進行實驗。本研究經(jīng)過華中科技大學實驗動物倫理委員會批準。

1.1.2 試劑 高脂飼料（北京華阜康生物科技股份有限公司，批號：D12492）；人參皂苷G-Rh2（商品名：今幸膠囊，浙江亞克藥業(yè)有限公司，每100 g 含16.2 g 人參皂苷G-Rh2，批號：190801）；二甲雙胍鹽酸鹽、洛伐他?。ㄉ虾CI 化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號POW6L-QH、55FIB-JP）；總膽固醇（total choles?terol，TC）、總?cè)８视停╰otal triglycerides，TG）、游離脂肪酸（nonestesterified fatty acid，NEFA）、高密度脂蛋白膽固醇（high density liptein cholesterol，HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（low density liptein cholesterol，LDL-C）、谷 丙 轉(zhuǎn) 氨 酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（aspartate aminotransferase，AST）（南京建成生物工程研究所，批號：A111-1、A110-1、A112-1、A113-1、A042-2、C009-2、C010-2）；BCA蛋白測定試劑盒（Beyotime 公司，批號：P0010S）；PE-Cy5標記的小鼠CD3 流式抗體（美國BD 公司，批號：7069621）；PE標記的小鼠CD8流式抗體（美國BD公司，批號：7132789）；FITC 標記的小鼠CD4 流式抗體（天津三箭生物科技有限公司，批號：AD605）；PE 標記的小鼠NK1.1 流式抗體（上海Biolegend 公司，批號：B190158）；PE 標記的小鼠CD25 抗體（美國BD公司，批號：E021463）；PE-Cy5 標記的小鼠Foxp3 抗體（美國BD 公司，批號：8025968）；PE 標記抗小鼠Gr-1 流式抗體（美國BD 公司，批號：4277720）；APC標記的小鼠CD11b 流式抗體（美國BD 公司，批號：2010622）。

1.1.3 儀器 血糖儀（湖南三諾生物傳感股份有限公司）；多功能酶標儀（美國BioTek公司）；C6型流式細胞儀（美國BD 公司）；液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀（LC-MS/MS，美國AB SCIEX 公司）；球磨勻漿機、超聲儀、真空干燥機（武漢邁特維爾生物科技有限公司）；HE 染色、油紅O 染色分析儀（湖北百奧斯生物科技有限公司）；高速冷凍離心機（上海力新儀器有限公司）；恒溫振蕩器（太倉豪城實驗儀器制造有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物造模、分組及給藥 隨機挑取8只正常小鼠，給予標準飼料喂養(yǎng)，作為正常對照組（Con）；其余32 只小鼠作為模型組，給予高脂飼料（high-fat diet，HFD，含60%脂肪、20%蛋白質(zhì)、20%碳水化合物）喂養(yǎng)。喂養(yǎng)期間，每周稱量一次小鼠體質(zhì)量并記錄其狀態(tài)。喂養(yǎng)12 周后，小鼠禁食6 h（自由飲水），尾尖微創(chuàng)采血測定空腹血糖（fasting blood glu?cose，F(xiàn)BG）值，眼眶靜脈叢取全血200μl，分離血清檢測TC、TG、HDL-C、LDL-C 水平。取同時符合下列標準的小鼠作為MS 模型：①體質(zhì)量高于同期飼養(yǎng)的正常組小鼠平均值；②FBG≥7.0 mmol/L；③血脂TG≥1.55 mmol/L、TC≥2.22 mmol/L、LDL-C≥0.35 mmol/L、HDL-C≤1.20 mmol/L 或與正常組相比有顯著性差異［10-12］。

根據(jù)造模標準取造模成功的小鼠20只，隨機分為4組（每組5只）：模型組（Mod），二甲雙胍組（陽性對照，Met，250 mg/kg），洛伐他汀組（陽性對照，Lova，10 mg/kg），G-Rh2 組（10 mg/kg 該劑量依據(jù)本課題組前期研究［9］和參考文獻［13］確定）。正常對照組和模型組按0.2 ml/只灌胃蒸餾水，各給藥組按相應劑量灌胃藥物混懸液（蒸餾水配制），1 次/d，連續(xù)4 周。給藥期間每周稱量1 次體質(zhì)量，末次給藥后處死小鼠，剝?nèi)⌒∈笃は潞透共恐?，稱重并計算脂肪指數(shù)。

1.2.2 胰島素耐量實驗（insulin tolerance test，ITT） 給藥2 周后，小鼠禁食6 h（自由飲水），皮下注射胰島素溶液（0.4 U/kg），分別于胰島素注射后0 min、20 min、40 min 和90 min 采血測定FBG 值，記錄所得數(shù)據(jù)并計算曲線下面積（AUC）。

1.2.3 口服葡萄糖耐量實驗（oral glucose tolerance test，OGTT） 給藥2周后，小鼠禁食6 h（自由飲水），灌胃葡萄糖溶液（2 g/kg），分別于葡萄糖負荷后0 min、30 min、60 min、90 min、120 min采血測定FBG值，記錄所得數(shù)據(jù)并計算AUC。

1.2.4 胰島素抵抗指數(shù)（homeostasis model assess?ment，HOMA-IR）評估 末次給藥后，眼眶取血，4 ℃放置3～4 h，高速冷凍離心（6 000 r/min，4 ℃，10 min）收集血清。采用胰島素試劑盒檢測血清中胰島素含量，通過穩(wěn)態(tài)模型評估HOMA-IR，具體計算公式：HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.2.5 生化檢測 取血清，采用生化試劑盒檢測TC、TG、NEFA、HDL-C、LDL-C 水平。取肝臟勻漿，采用生化試劑盒檢測肝臟組織中ALT、AST 含量，并用蛋白試劑盒進行均一化。

1.2.6 ELISA 檢測炎癥因子 取血清，采用ELISA試劑盒檢測炎癥因子TNF-α、IL-6水平。

1.2.7 肝臟組織病理學分析 末次給藥后，脫臼處死小鼠，取肝臟組織同一部位的樣本固定于4%的多聚甲醛中，行HE 染色。另取一份肝臟組織迅速凍于液氮中，行油紅O染色。

1.2.8 非靶向脂質(zhì)代謝組學分析 取小鼠肝臟組織同一部位的樣本裝在預冷的離心管中，迅速轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱凍存，采用非靶向脂質(zhì)代謝組學技術(shù)檢測八大類脂質(zhì)代謝物含量，并對脂質(zhì)代謝組學數(shù)據(jù)進行解析。

1.2.9 流式細胞儀（FACS）檢測免疫細胞 末次給藥后，脫臼處死小鼠，取出新鮮的脾臟和胸腺組織，置于PBS中保持濕潤，碾磨消化后制備單細胞懸液，分裝于EP 管中（每管約2×106個細胞），分別加入不同的流式抗體：T 細胞加入PE-Cy5 標記的小鼠CD3抗體、FITC 標記的小鼠CD4 抗體或PE 標記的小鼠CD8 抗體；調(diào)節(jié)性T 細胞（Treg）加入FITC 標記的小鼠CD4 抗體、PE 標記的小鼠CD25 抗體和PE-Cy5 標記的小鼠Foxp3 抗體；NK 細胞加入PE-Cy5 標記的小鼠CD3 抗體、PE 標記的小鼠NK1.1 流式抗體；骨髓來源的抑制性細胞（bone marrow-derived suppressor cells，MDSCs）加入APC 標記的小鼠CD11b 抗體、PE標記抗小鼠Gr-1 流式抗體；4 ℃避光孵育50 min，加入1 ml PBS，1 200 r/min 離心5 min，重復1 次，用300μl PBS重懸，流式細胞儀檢測細胞百分比。

2 結(jié)果

2.1 G-Rh2 對MS 小鼠肥胖體征的影響 喂養(yǎng)12 周后，與正常組比較，HFD 飼養(yǎng)小鼠體質(zhì)量快速增加且明顯高于正常組（P＜0.01），呈現(xiàn)出肥胖體型。給藥4 周后，與模型組比較，G-Rh2 組小鼠體質(zhì)量明顯下降（P＜0.01），恢復至正常組水平，呈瘦型（圖1A、C）。與正常組比較，模型組小鼠脂肪指數(shù)顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，G-Rh2 組、二甲雙胍組和洛伐他汀組小鼠脂肪指數(shù)均明顯降低（P＜0.05或0.01，圖1B）。

圖1 G-Rh2對MS小鼠肥胖體征的影響（n=5）Fig.1 Effects of G-Rh2 on obesity symptom in MS mice（n=5）

2.2 G-Rh2對MS小鼠胰島素敏感性的影響 給藥2 周后，ITT 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠AUC增大（P＜0.05）；與模型組比較，G-Rh2組注射胰島素后FBG 值下降，AUC 減小（圖2A）。OGTT 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組小鼠口服葡萄糖30 min后FBG 值迅速上升，至120 min 時才恢復到初始水平，同時AUC 顯著增大（P＜0.01）；與模型組比較，G-Rh2 組小鼠葡萄糖負荷后FBG 值變化幅度小，90 min 時恢復至初始水平，且AUC 明顯減?。≒＜0.05，圖2B）。給藥4 周，與正常組比較，模型組小鼠HOMA-IR 顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，G-Rh2 組小鼠HOMA-IR 指數(shù)有一定程度的降低（圖2C）。

圖2 G-Rh2對MS小鼠胰島素敏感性的影響（n=5）Fig.2 Effects of G-Rh2 on insulin sensitivity in MS mice（n=5）

2.3 G-Rh2 對MS 小鼠血脂的影響 給藥4 周，與正常組比較，模型組小鼠血清中4 種脂質(zhì)TC、TG、NEFA、LDL-C 水平均升高；與模型組比較，G-Rh2 組小鼠血清中NEFA 和LDL-C 水平明顯降低（P＜0.01或0.05），TC 水平也下降（P=0.105）；洛伐他汀組TC 和NEFA 水平明顯降低（P＜0.01）；二甲雙胍組NEFA 水平下降，其余4 種脂質(zhì)水平無顯著變化（圖3）。

圖3 G-Rh2對MS小鼠血脂的影響（n=5）Fig.3 Effects of G-Rh2 on serum lipid levels in MS mice（n=5）

2.4 G-Rh2對MS小鼠肝臟脂質(zhì)代謝的影響 給藥4周后，與正常組比較，模型組有28種脂質(zhì)代謝物水平明顯下調(diào)，222 種脂質(zhì)代謝物水平明顯上調(diào)；G-Rh2 組74 種脂質(zhì)代謝物水平明顯下調(diào)，8 種脂質(zhì)代謝物水平明顯上調(diào)（圖4A）。差異倍數(shù)柱狀圖展示：與正常組比較，模型組小鼠肝臟中上調(diào)最顯著的10種脂質(zhì)代謝物包括6種三酰甘油（TGs）、2種神經(jīng)酰胺（Cer）、1 種磷脂酰膽堿（PC）和1 種二酰甘油（DG）；與模型組比較，G-Rh2 組小鼠肝臟中下調(diào)最顯著的脂質(zhì)代謝物有12 種，包括4 種TGs、2 種DGs、1 種Cer、2 種PCs、1 種磷脂酰乙醇胺（PE）、1 種溶血磷脂酰乙醇胺（LPE）和1 種溶血磷脂酰膽堿（LPC）；上調(diào)最顯著的代謝物有8 種，分別是1 種羥基花生四烯酸（HETE）、2種環(huán)氧十八碳烯酸（EpOME）、1種PC、1 種棕櫚酸肉堿（palmitoleoylcarnitine）、1 種環(huán)氧二十碳三烯甘油酸（EET）、1 種血栓素B2（TXB2）、1種油?；鈮A（oleyl-carnitine）（圖4B）。

聚類分析結(jié)果顯示，模型組與G-Rh2 組之間共有90 種脂質(zhì)代謝物參與了聚類，其中G-Rh2 組較模型組減少的脂質(zhì)代謝物有82 種，大多數(shù)是TGs 和磷脂酰膽堿類（PCs），與差異倍數(shù)柱狀圖結(jié)果一致。G-Rh2 組較模型組增多的脂質(zhì)代謝物有8 種，分別是3種LPCs、3種膽固醇脂和2種LPEs（圖4C）。

圖4 G-Rh2對MS小鼠脂質(zhì)代謝物的影響（n=5）Fig.4 Effects of G-Rh2 on lipid metabolites in MS mice（n=5）

2.5 G-Rh2 對MS 小鼠脂肪性肝炎的影響 給藥4 周后，HE 切片結(jié)果顯示：正常組小鼠肝臟形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，中央靜脈血管清晰，肝小葉規(guī)則，肝索排列整齊；模型組小鼠肝竇萎縮變形，肝竇周圍細胞散亂，存在多處炎癥細胞聚集區(qū)域（黑色箭頭所指）；G-Rh2 組小鼠肝臟形態(tài)恢復正常，肝小葉呈規(guī)則的多面棱柱狀，僅中央靜脈管周圍存在少許炎癥細胞，其他肝實質(zhì)區(qū)的炎癥細胞較模型組明顯減少（圖5A）。油紅O 染色結(jié)果顯示：正常組小鼠肝臟油紅O 染色呈陰性，藍色的細胞核清晰，無紅色；模型組小鼠肝臟油紅O染色呈陽性，有較多紅色的脂肪，藍色的細胞核少，排列疏松并出現(xiàn)大量裂隙；G-Rh2組小鼠肝臟油紅O 染色基本呈陰性，細胞核清晰，細胞內(nèi)脂滴聚集少，紅色染色比模型組明顯減輕（圖5B）。

給藥4周后，與正常組比較，模型組小鼠肝臟指數(shù)增大，ALT、AST 含量顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，G-Rh2 組小鼠肝臟指數(shù)和ALT、AST 含量明顯降低（P＜0.05或0.01，圖5C、D）。與正常組比較，模型組血清中TNF-α、IL-6 含量升高；與模型組比較，G-Rh2 組TNF-α、IL-6 含量明顯降低（P＜0.05，圖5E）。

圖5 G-Rh2對MS小鼠脂肪性肝炎的影響（n=5）Fig.5 Effects of G-Rh2 on steatohepatitis in MS mice（n=5）

2.6 G-Rh2對MS小鼠免疫系統(tǒng)的影響 與正常組比較，模型組小鼠脾臟中CD4+T 和CD8+T 細胞比例明顯升高（P＜0.05），MDSCs 細胞數(shù)量有一定程度的下降。與模型組比較，G-Rh2 組小鼠脾臟中CD4+T細胞數(shù)量明顯減少（P＜0.05）；CD8+T 細胞和NK 細胞數(shù)量有一定程度地下降，MDSCs 細胞數(shù)量明顯升高（P＜0.01，圖6A）。胸腺組織中CD4+T、CD8+T、NK和Treg細胞均無明顯變化（圖6B）。

圖6 G-Rh2對MS小鼠體內(nèi)免疫環(huán)境的影響（n=5）Fig.6 Effects of G-Rh2 on immune function in MS mice（n=5）

3 討論

諸多研究報道人參皂苷G-Rh2具有治療代謝性疾病的作用，可提高糖尿病大鼠胰島素敏感性和葡萄糖代謝能力，促進前脂肪細胞3T3-L1 脂質(zhì)分解代謝預防肥胖［14-16］，但是作用機制尚不清楚。本研究同樣證實G-Rh2明顯抑制MS小鼠肥胖和脂肪肝，并降低血脂TC、NEFA、LDL-C 水平。肝臟脂質(zhì)代謝紊亂是引發(fā)高血糖、高血脂和肥胖等MS 系列癥狀的關(guān)鍵原因，一些藥物可通過重編程肝臟脂質(zhì)代謝治療MS［17-18］。因此，本課題組利用脂質(zhì)代謝組學探究G-Rh2 如何影響肝臟脂質(zhì)代謝發(fā)揮治療小鼠MS 的作用。結(jié)果表明經(jīng)HFD 誘導的MS 小鼠肝臟中有大量脂質(zhì)代謝物升高，最為顯著的是TGs，而G-Rh2 降低MS 小鼠肝臟中多種脂質(zhì)代謝物，包括TGs、DGs和PCs 等，說明G-Rh2 對脂肪肝的抑制與重塑肝臟脂質(zhì)代謝模式有關(guān)。另外，有報道稱與胰島素抵抗患者相比，胰島素敏感性患者的代謝產(chǎn)物中LPCs（C16：0）水平較高［19］；本研究同樣觀察到G-Rh2 升高肝臟中LPCs，推測G-Rh2 改善MS 小鼠胰島素抵抗效應可能通過升高LPCs實現(xiàn)。

除機體代謝紊亂外，MS和肥胖患者通常還伴隨慢性低度炎癥，他們的代謝器官肝臟和脂肪組織中存在大量的免疫細胞和細胞因子，如巨噬細胞、T 細胞、肥大細胞，炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α 和趨化因子CCL2、CXCL10［20-23］。MDSCs 在MS 疾病環(huán)境中具有降低免疫反應的作用，CD11b+Gr-1+髓樣細胞在高血壓小鼠外周血中增加，通過產(chǎn)生過氧化氫來抑制T 細胞活化，從而限制炎癥反應和血壓升高［24-26］。據(jù)報道G-Rh2 具有較強的抗炎活性，通過阻斷MAPK 和NF-κB 信號通路抑制巨噬細胞激活和炎癥因子產(chǎn)生［27］。本課題組也探究了G-Rh2 對MS 小鼠組織炎癥及免疫系統(tǒng)的影響：給予G-Rh2 后，MS 小鼠肝臟中炎癥細胞浸潤減少，血清中炎癥因子TNF-α、IL-6 水平降低，脾臟中CD4+T 細胞數(shù)量恢復至正常水平，MDSCs 數(shù)量增加。研究證實肝臟炎癥與脾臟免疫狀態(tài)密切相關(guān)，HFD 喂養(yǎng)的小鼠脾臟中T 細胞增殖加速和數(shù)量增加會導致脂肪性肝炎加重［28］。本研究觀察到MS 小鼠脾臟中CD4+T 細胞和CD8+T細胞均明顯升高，而G-Rh2 減少脾臟中CD4+T 細胞數(shù)量，增加MDSCs數(shù)量，說明G-Rh2限制脾臟中T細胞過度激活和增加MDSCs 細胞，有利于肝臟恢復免疫平衡。

MS患者脂質(zhì)代謝和免疫相互影響，脂質(zhì)代謝紊亂易導致免疫失衡引發(fā)肝臟炎癥，而炎癥反過來造成肝損傷，干擾其代謝功能，形成惡性循環(huán)［29］。有研究報道暴露于斷奶后肥胖飲食的雌性C57BL/6J小鼠后代顯示出肝損傷的跡象，暴露于母體肥胖會加劇肝臟炎癥性損傷，ALT、TGs、IL-6、TNF-α 在肝臟中的含量增加［30］。G-Rh2 減少肝臟炎癥細胞聚集，調(diào)節(jié)脾臟中CD4+T/MDSCs 細胞比例平衡并降低炎癥因子IL-6、TNF-α 水平，這對抑制肝臟炎癥性損傷有重要意義，同時G-Rh2 改變了肝臟的脂質(zhì)代謝模式，尤其是減少TGs、DGs和PCs的過度堆積，有利于防止脂肪肝的形成。但是由于脂質(zhì)代謝和炎癥存在相互影響的關(guān)系，本研究尚不能確定G-Rh2 是通過解除代謝紊亂環(huán)境避免了炎癥反應，還是通過抑制炎癥進而改善肝臟代謝紊亂及高血脂、胰島素抵抗、肥胖等MS癥狀。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)G-Rh2 有改善胰島素抵抗、肥胖和降血脂的作用，可用于治療MS 的高血糖、高血脂、肥胖、脂肪肝等系列癥狀，機制可能是通過調(diào)控MS 小鼠免疫失衡阻止肝臟炎癥性損傷，同時重塑脂質(zhì)代謝從而發(fā)揮治療MS的作用。