李 靜 劉 倩 張春花 裴建贏 劉靜婷 毛寶宏 （甘肅省婦幼保健院科研中心，蘭州 730050）

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)（recurrent spontaneous abortion，RSA）是指孕20周前連續(xù)2次或以上的自然流產(chǎn)，是一種常見(jiàn)的病理妊娠，影響1%～2%的妊娠女性［1］。其發(fā)病因素眾多，包括遺傳問(wèn)題、解剖畸形、內(nèi)分泌異常、凝血等因素，但目前仍有50%患者原因不明，有研究表明其可能與免疫有關(guān)。RSA 患者較正常孕婦輔助型T 細(xì)胞（helper T cells，Th）百分比增高。Th 通過(guò)增加其分泌的細(xì)胞因子，加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)，促進(jìn)妊娠維持，但免疫調(diào)節(jié)細(xì)胞因子中，特別是白細(xì)胞介素（interleukin，IL），一類(lèi)能在細(xì)胞間傳遞信息、影響妊娠各階段的具有免疫調(diào)節(jié)和效應(yīng)功能的蛋白質(zhì)或小分子多肽，對(duì)妊娠結(jié)局起到至關(guān)重要的作用［2-3］。本研究擬采用病例對(duì)照研究方法，運(yùn)用SNaPshot 技術(shù)探討IL-15 基因rs3806798、IL-17A 基因rs2275913、IL-18 基因rs1946518 和rs187238 位點(diǎn)與RSA發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 一般資料 收集2019 年1 月至2020 年8 月于甘肅省婦幼保健院復(fù)發(fā)性流產(chǎn)門(mén)診就診的RSA患者150 例設(shè)為RSA 組，患者年齡19～41 歲［（29.3±4.0）歲］。納入標(biāo)準(zhǔn)：流產(chǎn)次數(shù)≥2 胎，并且發(fā)生于妊娠20周前；無(wú)內(nèi)分泌、感染、解剖、易栓癥、夫妻染色體異常；無(wú)糖尿病、高血壓、風(fēng)濕免疫性疾病等基礎(chǔ)疾病及家族遺傳病史；夫婦雙方無(wú)近親結(jié)婚。對(duì)照組為150 例同期體檢中心就診的健康女性，無(wú)自然流產(chǎn)史、早產(chǎn)史及妊娠高血壓病史，且至少成功分娩1 次1 名健康足月兒，其年齡為20～40 歲（30.0±4.0）歲，兩組比較年齡差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。本研究獲得甘肅省婦幼保健院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，研究對(duì)象均簽署知情同意書(shū)。

1.1.2 主要試劑 引物（上海生工）；Hotstar（Taq Qiagen）；PCR 反應(yīng)緩沖液、MgCl2（TaKaRa）；dNTP（Generay Biotech）；PCR Marker（New England Biola?bs）；SNaPshot Multiplex、5×Sequencing Buffer、HI-DI、GeneScanTM-120（ABI）；SAP（Promega）；EXO-Ⅰ（Epicentre）。

1.1.3 數(shù)據(jù)來(lái)源 查閱HapMap dbSNP 數(shù)據(jù)庫(kù)（www. hapmap. ncbi. nlm. nih. Gov）及相關(guān)文獻(xiàn)，選擇IL-15 基因rs3806798、IL-17 基因rs2275913、IL-18基因rs1946518 和rs187238 共4 個(gè)位點(diǎn)，3 個(gè)單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點(diǎn)均滿(mǎn)足以下條件：選擇RSA 相關(guān)SNPs；位點(diǎn)在中國(guó)人群最小等位基因頻率＞0.05。

1.2 方法

1.2.1 標(biāo)本采集及基因組DNA 提取 采集2 組受試者外周靜脈血2 ml 置于EDTA-K2真空抗凝管，根據(jù)MagenDNA 提取試劑盒說(shuō)明書(shū)提取白細(xì)胞基因組DNA，標(biāo)記并置于-80 ℃低溫冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 SNaPshot基因分型

1.2.2.1 PCR 擴(kuò)增引物及SNaPshot 引物設(shè)計(jì)及合成 參照GenBank 中IL-15、IL-17 和IL-18 基因引物序列查找IL-15 rs3806798、IL-17A rs2275913 及IL-18 rs1946518 和rs187238 共4 個(gè)位點(diǎn)的引物序列，運(yùn)用primer5.0設(shè)計(jì)引物，見(jiàn)表1。

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab.1 PCR primers in multiplex PCR reaction of this study

1.2.2.2 多重PCR 反應(yīng)體系（20 μl）包含2×GC-Ⅰbuffer 10μl，去離子水5μl，3.0 mmol/L Mg2+0.4μl，0.3 mmol/L dNTP 2.4 μl，1 U HotStarTaq polymerase 0.2 μl，樣本DNA 和多重PCR 引物各1 μl。多重PCR 擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性2 min，94 ℃變性20 s，65 ℃退火40 s，72 ℃延伸1.5 min，反應(yīng)11 個(gè)循環(huán)，再次94 ℃變性20 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1.5 min，反應(yīng)24個(gè)循環(huán)，最后72 ℃延伸2 min，4 ℃保存。

1.2.2.3 PCR產(chǎn)物純化 本研究反應(yīng)體系為17μl，其中PCR 產(chǎn)物為10μl，酶混合液7μl（含生產(chǎn)的5 U SAP和2 U ExoⅠ）；反應(yīng)條件：37 ℃孵育溫1 h，然后75 ℃15 min 以滅活SAP 和ExoⅠ酶，純化完成后進(jìn)行單堿基延伸反應(yīng)，預(yù)先混好延伸引物，見(jiàn)表2。

表2 SNaPshot多重單堿基延伸反應(yīng)延伸引物Tab.2 SNaPshot primer for multiple single base extension reaction

1.2.2.4 SNaPshot 反應(yīng) 采用ABI PRISM SNaP?shot Muhiplex Kit 進(jìn)行。反應(yīng)體系為10 μl，其中純化后多重PCR 產(chǎn)物為2 μl，SNaPshot Mix 5 μl，延伸引物混合1μl，超純水2μl；反應(yīng)條件為96 ℃預(yù)變性1 min，96 ℃變性10 s，55 ℃退火5 s，60 ℃延伸30 s，反應(yīng)28個(gè)循環(huán)，4 ℃保存。

1.2.2.5 SNaPshot 反 應(yīng) 產(chǎn) 物 純 化 10 μl 上 述SNaPshot PCR 產(chǎn)物中加入1 U SAP，振蕩混勻，37 ℃溫育1 h，75 ℃滅活15 min。4 ℃保存24 h 或-20 ℃長(zhǎng)期保存。

1.2.2.6 ABI 3730XL 測(cè)序儀測(cè)序分型產(chǎn)物 取0.5 μl 純 化 后 延 伸 產(chǎn) 物，與0.5 μl Liz120 SIZE STANDARD 和9μl Hi-Di混勻，95 ℃變性5 min 后上ABI3730XL 測(cè)序儀，使用GeneMapper 4.1 軟件分析峰圖結(jié)果。測(cè)序與基因分型由深圳華大基因科技有限公司完成。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 對(duì)IL-15 rs3806798、IL-17A rs2275913 及IL-18 rs1946518 和rs187238 位點(diǎn)基因型分布進(jìn)行Hardy-Weinberg 平衡檢驗(yàn)，P＞0.05 表示符合平衡檢驗(yàn)。采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間對(duì)比，Logistic二元逐步回歸進(jìn)行多因素分析，統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS26.0軟件進(jìn)行，P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 樣本及SNP 質(zhì)控 IL-15 rs3806798、IL-17A rs2275913、IL-18 rs1946518 和rs187238 這4 個(gè)位點(diǎn)在RSA 組和對(duì)照組基因型頻率進(jìn)行Hard-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)，結(jié)果顯示所有位點(diǎn)均符合Hard-Weinberg 遺傳平衡定律（P＞0.05），說(shuō)明群體具有代表性，見(jiàn)表3。

表3 4個(gè)SNP位點(diǎn)基因型分布的Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)Tab.3 Hardy-Weinberg equilibrium test for genotype distribution of four SNP locus

2.2 4個(gè)SNP 位點(diǎn)基因型頻率、等位基因頻率分布及遺傳模式分析 檢測(cè)RSA 組與對(duì)照組IL-15 rs3806798、IL-17A rs2275913、IL-18 rs1946518 3 個(gè)SNP 位點(diǎn)基因型頻率和等位基因頻率分布，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；對(duì)以上3 個(gè)SNP 采用非條件Logistic回歸模型分析等位基因隱性、顯性遺傳模式，結(jié)果顯示RSA 組和對(duì)照組差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），見(jiàn)表4。但I(xiàn)L-18 rs187238 SNP 位點(diǎn)GG型、CG 型、CC 型在對(duì)照組中檢出率分別為0、23.3%、76.7%，RSA 組檢出率為2.0%、12.0%、86.0%，其構(gòu)成比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=9.256，P=0.010）。通過(guò)非條件Logistic回歸分析顯性、隱性遺傳模式，結(jié)果顯示G 等位型（GC+GG 基因型）與RSA患病風(fēng)險(xiǎn)降低相關(guān)（χ2=4.303，OR=0.53，95%CI=0.29～0.97，P=0.038），見(jiàn)表4。但G 等位基因不是RSA的保護(hù)性等位基因（χ2=2.275，OR=0.66，95%CI=0.38～1.14，P=0.132），見(jiàn)表4。

表4 兩組4個(gè)多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因分布比較及遺傳模式分析Tab.4 Comparison of four SNPs's genotype，allele frequency and genetic model analysis in two groups

2.3 連鎖不平衡檢驗(yàn)和單體型分析 對(duì)4 個(gè)SNP進(jìn)行兩兩間連鎖不平衡檢驗(yàn)，rs1946518 和rs187238存在完全連鎖不平衡（D'=1，r2≥0.152），其余位點(diǎn)兩兩之間不存在連鎖不平衡（圖1）。本研究采用SHEsis在線軟件進(jìn)行單體型種類(lèi)和單體型頻率估算［4-5］，以最低頻率閾值，即單體型頻率＜0.03 不納入分析范圍，本研究4 個(gè)位點(diǎn)可構(gòu)建7 種單體型（AGGC、TAGC、TATC、TATG、TGGC、TGTC、TGTG），其 中TGTG 單體型在RSA 組與對(duì)照組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)非條件Logistic 回歸分析顯示TGTG 單體型是RSA 的保護(hù)因素，其OR（95%CI）=0.361（0.158～0.827）［4-5］。但其余各單體型與RSA發(fā)病無(wú)關(guān)（P＞0.05）。見(jiàn)表5。

表5 4個(gè)位點(diǎn)單體型頻率在RSA組與健康對(duì)照組分布比較Tab.5 Comparison of haplotype frequencies of four loci between RSA group and healthy control group

圖1 4個(gè)SNPs位點(diǎn)的LD圖Fig.1 LD map of four SNPs

3 討論

目前RSA 病因尚不明確，但在大量流產(chǎn)相關(guān)因素中，涉及異常免疫反應(yīng)和IL 的因素尤為引人注目［6］。IL是一類(lèi)在人體中介導(dǎo)多種免疫反應(yīng)的免疫調(diào)節(jié)蛋白，其與相應(yīng)免疫細(xì)胞相互作用，維持母胎免疫平衡。在大量胚胎植入失敗或流產(chǎn)相關(guān)因素中，IL參與異常免疫反應(yīng)尤為顯著［7］。

最新研究發(fā)現(xiàn)IL-15 是由髓樣細(xì)胞和其他類(lèi)型細(xì)胞表達(dá)，免疫調(diào)節(jié)方面具有治療潛力的一種多功能分子，其可參與T 細(xì)胞反應(yīng)、激活NK 細(xì)胞、協(xié)助B 細(xì)胞歸巢、調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)，特別在誘導(dǎo)和維持T 細(xì)胞應(yīng)答方面，是免疫治療方面最具治療潛力的靶點(diǎn)［8］。目前IL-15 基因多態(tài)性與RSA 易感性的關(guān)聯(lián)研究相對(duì)較少。WU等［9］對(duì)1 015例接受新鮮非供者體外受精周期女性進(jìn)行前瞻性隊(duì)列分析，探究IL-15基因rs3806798 A/T 對(duì)IVF 結(jié)局的影響，結(jié)果表明臨床妊娠率、胚胎移植率和活產(chǎn)率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但TOTH 等［8］研究發(fā)現(xiàn)患者胎盤(pán)組織中IL-15表達(dá)增加可能與胚胎丟失后的植入障礙有關(guān)。本研究未發(fā)現(xiàn)IL-15 基因rs3806798 位點(diǎn)與RSA 發(fā)病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，在多個(gè)遺傳模式（隱性、顯性）下差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前IL-15 和RSA 的關(guān)系研究較少，但鑒于IL-15 免疫治療的潛力，需要更多數(shù)據(jù)去支持其與RSA的關(guān)聯(lián)研究。

IL-17A 是IL-17 家族成員，既往研究表明IL-17在防御病菌、自身免疫病發(fā)生等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，近年來(lái)逐漸成為醫(yī)學(xué)及免疫學(xué)的研究熱點(diǎn)。rs2275913 位點(diǎn)位于IL-17A 基因上游區(qū)域中核因子激活T細(xì)胞（NFAT）結(jié)合基序內(nèi)，NFAT 是IL-17表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。有研究表明rs2275913 可能影響IL-17轉(zhuǎn)錄調(diào)控，且可提高IL-17分泌［10］。ZIDAN等［11］采用RFLP 對(duì)120 例RSA 患者和120 例無(wú)流產(chǎn)史且至少生育1 胎的女性為對(duì)照探討rs2275913 與RSA的關(guān)聯(lián)，發(fā)現(xiàn)IL-17A（rs2275913）AA 基因型與RPL風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)，其OR=2.440，95%CI=1.140～5.200，P=0.025。藺靜等［12］研究發(fā)現(xiàn)RSA 組該位點(diǎn)A 等位基因頻率明顯高于對(duì)照組，rs2275913位點(diǎn)AG和AA基因攜帶者RSA 相對(duì)危險(xiǎn)度分別為GG 等位基因的2.012倍和2.545倍，但在本研究中未發(fā)現(xiàn)此種關(guān)聯(lián)（OR=1.229，95%CI=0.654～2.307，P=0.521 6）。本研究與BAHADORI 等［13］和NAJAFI 等［14］的研究結(jié)果一致，即IL-17A rs2275913 基因型頻率與RPL 風(fēng)險(xiǎn)之間無(wú)顯著相關(guān)性。

越來(lái)越多的證據(jù)表明IL-18 基因可誘導(dǎo)INF-α，使NK 細(xì)胞活化，參與子宮血管的形成和著床，該機(jī)制在RSA 的發(fā)病中發(fā)揮重要作用［15］。人IL-18 基因位于染色體11q22.2～q22.3，有6 個(gè)外顯子和5 個(gè)內(nèi)含子。轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)位于外顯子-2 上。IL-18 有2 個(gè)啟動(dòng)子區(qū)，一個(gè)位于外顯子-2的6.7 kb上游，另一個(gè)位于5'-側(cè)。rs187238（-137G/C）、rs1946518（-607A/G）位于啟動(dòng)子-1 區(qū)。在基因啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄活性分析中，有研究表明-607A、-137C 等位基因可出現(xiàn)低活動(dòng)性，因此該位點(diǎn)變化可能導(dǎo)致產(chǎn)物功能增強(qiáng)或減弱，或者帶來(lái)對(duì)某些疾病的易感性，也就是遺傳因素變化，這對(duì)機(jī)體免疫機(jī)制研究有積極意義［16］。ZHANG 等［17］回顧了2015 年以前的21 項(xiàng)MEDLINE、EMBASE、OVID SP 和PubMed 的研究，以評(píng)估RPL相關(guān)IL 的基因多態(tài)性。對(duì)IL-18 基因的rs1946518、rs187238 多 態(tài) 性 進(jìn) 行Meta 分 析 和 綜 述［18-23］，其 中rs1946518 多態(tài)性在兩種顯性和隱性遺傳模型下與RSA 均無(wú)關(guān)：顯性模式P=0.310，OR=0.820，95%CI（0.560～1.210）；隱 性 模 式P=0.170，OR=0.730，95%CI（0.470 0～1.140）。但根據(jù)rs187238 多態(tài)性篩選出來(lái)的5項(xiàng)研究，固定效應(yīng)結(jié)果表明，顯性遺傳模式下，rs187238 多態(tài)性與RSA 無(wú)關(guān)聯(lián)［P=0.370，OR=1.080，95%CI（0.910 0～1.270）］，但在隱性遺傳模 型 下 存 在 關(guān) 聯(lián) 性［P＜0.01，OR=1.690，95%CI（1.240～2.310）］。SALIMI 等［22］的一項(xiàng)meta 研究中發(fā)現(xiàn)，rs1946518位點(diǎn)在等位基因顯性、隱性、加性及共顯性模式中均未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與RSA 發(fā)病相關(guān)［18-19，21，24-25］。而rs187238 位點(diǎn)在純合子模式下［CCvsGG：OR=1.653，95%CI（1.014～2.694），P=0.004］以及隱性模式下［CCvsCG+GG：OR=1.801，95%CI（1.345～2.411），P=0.001］與RSA 風(fēng)險(xiǎn)之間存在顯著關(guān)聯(lián)［15，18-21，23，25］。當(dāng)按種族分層時(shí)，在亞洲人群中，rs187238 多態(tài)性與RSA 風(fēng)險(xiǎn)間無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。然而，基于基因分型方法進(jìn)行的亞組分析顯示，在TaqMan分型研究組中，rs187238 位點(diǎn)多態(tài)性與RSA 風(fēng)險(xiǎn)間的關(guān)聯(lián)呈陽(yáng)性結(jié)果。本研究首次對(duì)甘肅地區(qū)人群IL-18 基因的rs1946518、rs187238 多態(tài)性進(jìn)行分析，結(jié)果顯示本研究中RSA 患者rs1946518 位點(diǎn)基因型和等位基因頻率與無(wú)RSA 史患者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），在隱性或顯性遺傳模式下，利用Logis?tic 回歸模型分析顯示兩組間差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），與既往研究基本一致［18-19，21，25］；但針對(duì)rs187238 的位點(diǎn)研究發(fā)現(xiàn)，在隱性遺傳模式下［CCvsCG+GG：OR=0.535，95%CI（0.295～0.971），P=0.0380］，結(jié)果與我國(guó)其他研究不一致［21，23］。YUE等［21］研究未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)CC vs GG+GC 在RSA 患者與對(duì)照中存在差異，而王丹等［23］研究表明該位點(diǎn)GC+CC基因型可能是RSA 易感基因型，C 等位基因可能是其發(fā)病的遺傳易感基因之一。本研究中由于檢測(cè)出的GG基因型較少，無(wú)法計(jì)算。

進(jìn)一步的連鎖不平衡和單體型分析發(fā)現(xiàn)，rs1946518 和rs187238 存在完全連鎖不平衡。TGTG單體型頻率在RSA 組及對(duì)照組分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），同時(shí)非條件Logistic 回歸分析顯示，該單體型與RSA 發(fā)病均有關(guān)（OR=0.361，95%CI=0.158 0～0.827 0）。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)rs187238 與甘肅地區(qū)RSA 患病有關(guān)，但不能完全排除IL-15、IL-17A 基因與中國(guó)漢族RSA 疾病的相關(guān)性，研究結(jié)果與既往研究存在差異，可能與種族地域有關(guān)。本研究雖僅選取4 個(gè)SNPs，不能完全代表IL-15、IL-17A、IL-18 基因。此外由于本研究樣本量較少，且未考慮基因-基因和基因-環(huán)境相互作用導(dǎo)致的RSA關(guān)聯(lián)性，因此有必要開(kāi)展更大樣本量、更高質(zhì)量的研究以進(jìn)一步驗(yàn)證本研究結(jié)論。