劉哲，葉英*，羅黎霞，王虹，張祎睿

1(青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，青海 西寧，810016)2(青海大學(xué) 化工學(xué)院，青海 西寧，810016)

狹果茶藨子(RibesstenocarpumMaxim)，又名長果醋栗，為虎耳草科茶藨子屬，該屬植物在世界約有160余種[1]，目前，我國在不同地方開展了茶藨屬植物資源的調(diào)查[2]，其中以陜西、四川、新疆、青海等地分布較多[3]，大多生長在山坡灌叢、山地針葉林或溪旁。據(jù)相關(guān)資料記載，茶藨子的各個(gè)部位都具有一定的價(jià)值[4]，其果實(shí)漿汁飽滿，富含營養(yǎng)成分，如維生素、粗纖維、蛋白質(zhì)、黃酮類及氨基酸等[5]，具有降三高、保護(hù)心血管等生理功能[6]。茶藨子不僅風(fēng)味獨(dú)特、天然無污染，而且具有良好的加工性能，可用于功能性食品的開發(fā)，故又被稱作第3代水果[7]。青藏高原茶藨子資源分布廣泛，但大多處于野生狀態(tài)，目前對其化學(xué)成分的研究尚處于起步階段，且多集中于有機(jī)酸、黃酮、花青素以及生物堿等活性成分，關(guān)于氨基酸的研究鮮有報(bào)道。

氨基酸作為植物蛋白組成的基本物質(zhì)單元，不僅影響著食品的風(fēng)味與營養(yǎng)價(jià)值，同時(shí)能夠提高人體免疫機(jī)制[8]。SADZUKA 等[9]通過藥理試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，茶氨酸可以通過增加阿霉素的濃度，抑制腫瘤活性。HASE等[10]發(fā)現(xiàn)，酪氨酸能夠明顯改善思維記憶能力以及可能由身體或精神上的超負(fù)荷引起的情緒惡化，通過增加酪氨酸的攝入量來達(dá)到對心理及行為的有益影響。研究發(fā)現(xiàn)，茶藨子果實(shí)是良好的天然氨基酸植物源，能補(bǔ)充人體必需的氨基酸，因此有必要進(jìn)一步研究其提取工藝及成分組成。近年來，有關(guān)天然產(chǎn)物氨基酸的提取方法較多，主要有加熱回流法[11]、超聲波法[12]、微波法[13]、超臨界流體萃取法[14]等。其中超聲波法是最常用的一種提取方法，依據(jù)超聲過程中釋放的機(jī)械作用破壞植物細(xì)胞壁和細(xì)胞膜，從而提高從天然產(chǎn)物中提取生物活性化合物的效率，該方法用時(shí)短、無需高溫處理便能使活性成分高效率的溶出，從而達(dá)到系統(tǒng)性評價(jià)其成分組成的目的。

為了全面深入地探究青藏高原特色漿果資源狹果茶藨子的綜合品質(zhì)及食用價(jià)值，本試驗(yàn)對狹果茶藨子果實(shí)中粗脂肪、粗蛋白、粗纖維、礦質(zhì)元素及總糖含量進(jìn)行測定，采用超聲波輔助提取法結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化氨基酸提取工藝參數(shù)，并利用氨基酸分析儀對其成分組成進(jìn)行分析，以期從營養(yǎng)學(xué)角度較系統(tǒng)地闡述狹果茶藨子的使用價(jià)值，同時(shí)也為該漿果資源功能性食品的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

狹果茶藨子果實(shí)采自青?；ブ?，采集地海拔3 029 m，經(jīng)度101°50.926，緯度36°57.670。狹果茶藨子清洗后經(jīng)實(shí)驗(yàn)室高能球磨儀處理成漿，4 ℃冰箱冷藏，備用。

Cu、Zn、Fe、Mn、Ca、Na、Mg、P、K、Se、Cd、Pb、Cr、V、Ge元素的1 000 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，國家標(biāo)準(zhǔn)品試劑中心；無水乙醇、KH2PO4、Na2HPO4、水合茚三酮、谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品為化學(xué)純，天津化工有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KQ-5200DB超聲波清洗機(jī)，江蘇昆山超聲儀器有限公司；UV-1780紫外可見分光光度計(jì)，蘇州島津儀器有限公司；UBE-V0.2L實(shí)驗(yàn)室高能球磨儀，長沙德科儀器有限公司；K9840凱氏定氮儀，海能儀器股份有限公司；L-8900型氨基酸自動(dòng)分析儀，日本日立公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 營養(yǎng)成分測定方法

參考GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中索氏抽提法測定粗脂肪含量；參考GB 5009.5—2016《食品中蛋白質(zhì)的測定》中凱氏定氮法測定粗蛋白含量；參照GB 5009.8—2016《食品中果糖、葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖的測定》中高效液相色譜法測定總糖含量；參考GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測定》中化學(xué)分析法測定粗纖維含量；按照GB 5009.268—2016《食品中多元素的測定》中電感耦合等離子體-原子發(fā)射光譜法(inductively coupled plasma-atomic emission spectrometry，ICP-AES)和電感耦合等離子體-質(zhì)譜法(inductively coupled plasma-MS，ICP-MS)測定各元素含量。

1.3.2 狹果茶藨子氨基酸提取單因素試驗(yàn)

準(zhǔn)確稱取數(shù)份10 g狹果茶藨子鮮果漿液，以氨基酸提取量為評價(jià)指標(biāo)，研究超聲時(shí)間(10、20、30、40、50 min)、超聲溫度(25、35、45、55、65 ℃)、超聲功率(200、250、300、350、400 W)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(30%、40%、50%、60%、70%)、液料比[25∶1、30∶1、35∶1、40∶1、45∶1(mL∶g)]及提取次數(shù)(1、2、3、4、5次)對狹果茶藨子果實(shí)中游離氨基酸提取效果的影響。每組試驗(yàn)均平行測定3次。

1.3.3 Plackett-Burman(PB)試驗(yàn)設(shè)計(jì)

Plackett-Burman 設(shè)計(jì)是一種成熟且廣泛使用的統(tǒng)計(jì)技術(shù)，通過忽略變量之間的相互作用，能夠從多因素試驗(yàn)中選擇具有高顯著性水平的最有效因子以便進(jìn)行更深一步優(yōu)化[15]。在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以游離氨基酸提取量為考察指標(biāo)，選取超聲時(shí)間(A)、超聲功率(B)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)、液料比(D)、超聲溫度(E)、浸提次數(shù)(F)6個(gè)因素進(jìn)行PB試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 PB試驗(yàn)因素與水平Table 1 PB test factors and levels

1.3.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

根據(jù)PB試驗(yàn)篩選得到對氨基酸提取量影響較大的3個(gè)因素，即超聲時(shí)間(A)、乙醇體積分?jǐn)?shù)(C)和超聲溫度(E)，以狹果茶藨子鮮果中氨基酸提取量為考察指標(biāo)，通過Box-Behnken模型進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)，優(yōu)化提取工藝參數(shù)。因素水平見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)試驗(yàn)因素與水平Table 2 Response surface design test factors and levels

1.3.5 狹果茶藨子氨基酸提取量的測定

在楊玲引等[16]方法的基礎(chǔ)上，略有改動(dòng)，測定樣品中氨基酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)。取5 mg/mL的谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)品溶液 0.00、0.20、0.40、0.60、0.80、1.00、1.20 mL于試管，蒸餾水補(bǔ)至10 mL，移取上述溶液各2 mL于10 mL容量瓶，分別加入磷酸鹽緩沖液2 mL，茚三酮溶液1 mL，搖勻，沸水浴20 min，冷卻后定容，于566 nm處測定吸光度值，得到回歸方程y=1.649 1x-0.011 6，R2=0.995 7。準(zhǔn)確移取稀釋到一定濃度的狹果茶藨子果實(shí)中游離氨基酸溶液2 mL，按上述標(biāo)準(zhǔn)曲線操作方法測定吸光度，按照回歸方程計(jì)算狹果茶藨子中游離氨基酸提取量，如公式(1)所示：

(1)

式中：ρ，狹果茶藨子氨基酸質(zhì)量濃度，mg/mL；V，提取液總體積，mL；n，稀釋倍數(shù)；m，狹果茶藨子鮮果漿液的質(zhì)量，g。

1.3.6 狹果茶藨子氨基酸的成分分析

將最優(yōu)工藝參數(shù)得到的氨基酸提取液按照GB/T 5009.124—2016《食品中氨基酸的測定》采用氨基酸自動(dòng)檢測儀測定成分組成。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Origin 6.0軟件對單因素結(jié)果進(jìn)行處理；采用Design-Expert.V8.0.6軟件對響應(yīng)面進(jìn)行模型構(gòu)建。

2 結(jié)果與分析

2.1 狹果茶藨子果實(shí)中營養(yǎng)成分測定

狹果茶藨子鮮果中富含營養(yǎng)成分，其中蛋白質(zhì)是人體必需的營養(yǎng)素，研究表明，植物蛋白含量較高的食物中的脂肪及膽固醇含量往往都很低, 同時(shí)含有大量膳食纖維, 正好與動(dòng)物蛋白食物相反, 更有利于人的身體健康[17]。茶藨子果實(shí)中粗纖維含量為(24.4±0.61)%，蛋白質(zhì)含量為(7.9±0.76)%，同時(shí)，糖也是人體所需能量的主要提供者，測得含量為(17.0±0.82)%，而粗脂肪含量很低，為(2.2±0.57)%，屬于典型的低脂高纖維水果，是當(dāng)代青年的瘦身食源。由表3可知，茶藨子果實(shí)含量較高的必需元素依次為K、Ca、P、Mg，其中K的含量高達(dá)9 770 μg/g，且K/Na將近280，體現(xiàn)了高鉀低鈉的特點(diǎn)，對于促進(jìn)新陳代謝、調(diào)節(jié)血壓、提高免疫等發(fā)揮著重要作用[18]。而微量元素?cái)z入不足或過量均會影響機(jī)體正常功能。Zn、Fe、Ca、Mn這幾種對人體有益的微量元素含量分別為27.8、215、2 970、6.24 μg/g，綜合分析表明狹果茶藨子不僅具有酸甜爽口的漿果風(fēng)味，而且營養(yǎng)保健價(jià)值頗高。

表3 狹果茶藨子果實(shí)中礦質(zhì)元素含量 單位：μg/gTable 3 Mineral element content in R.stenocarpum fruit

2.2 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 超聲波處理時(shí)間

由圖1可知，狹果茶藨子鮮果氨基酸提取量隨超聲時(shí)間的增加而呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在30 min時(shí)達(dá)到峰值，這可能是由于在提取時(shí)間為30 min時(shí)，狹果茶藨子中的氨基酸已基本被提取出來，故氨基酸含量達(dá)到峰值，再延長超聲時(shí)間，可能會造成氨基酸結(jié)構(gòu)的改變，氨基酸含量反而下降，因此選取超聲時(shí)間30 min為宜。

圖1 超聲時(shí)間對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.1 Effect of ultrasonic time on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.2 超聲波溫度

由圖2可知，狹果茶藨子氨基酸提取量隨超聲溫度的增加呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，45 ℃時(shí)游離氨基酸提取量達(dá)33.61 mg/g，這可能是因?yàn)檩^高的溫度會導(dǎo)致擴(kuò)散率增加，相應(yīng)地使提取效率升高，此外，過高溫度引起的氨基酸降解是導(dǎo)致提取率下降的重要原因。因此選取超聲溫度45 ℃為宜。

圖2 超聲溫度對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.2 Effect of ultrasonic temperature on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.3 超聲波功率

由圖3可知，狹果茶藨子果實(shí)中氨基酸提取量隨超聲功率的增大而增加，在300 W時(shí)達(dá)到峰值，當(dāng)超聲功率不足300 W時(shí)，出現(xiàn)上升趨勢。這可能是因?yàn)槌暪β实脑黾樱岣吡藷嵝?yīng)和空化作用之間的相互協(xié)調(diào)[19]，利于氨基酸的溶出。當(dāng)超聲功率>300 W，超聲引起的空化效應(yīng)得到抑制，從而降低了氨基酸的提取量，故選取超聲功率300 W為宜。

圖3 超聲功率對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.3 Effect of ultrasonic power on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)

由圖4可知，狹果茶藨子氨基酸提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，在40%時(shí)達(dá)到峰值，這可能是由于相似相溶原理，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)與氨基酸極性接近時(shí)，氨基酸易于溶出，當(dāng)增大乙醇體積分?jǐn)?shù)后，其他醇溶性物質(zhì)相繼溶出，導(dǎo)致氨基酸提取量下降，因此選取乙醇體積分?jǐn)?shù)40%為宜。

圖4 乙醇體積分?jǐn)?shù)對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.4 Effect of ethanol concentration on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.5 液料比

由圖5可知，隨液料比的增加，狹果茶藨子氨基酸提取量呈現(xiàn)不斷增加的趨勢，在35∶1(mL∶g)時(shí)達(dá)到峰值，這可能是由于溶劑用量不足，氨基酸提取被限制，隨著溶劑用量的加大，狹果茶藨子中氨基酸被充分提出，再增大用量，對提取量影響較小，且造成浪費(fèi)。因此選取液料比35∶1(mL∶g)為宜。

圖5 液料比對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.5 Effect of liquid-solid ratio on amino acid extraction from R.stenocarpum

2.2.6 浸提次數(shù)

由圖6可知，狹果茶藨子氨基酸提取量隨浸提次數(shù)的增加而增加，浸提2次后氨基酸提取量達(dá)到峰值47.75 mg/g，隨后基本趨于穩(wěn)定。這可能是因?yàn)榻?jīng)過前2次的提取，氨基酸已經(jīng)基本提取完全，繼續(xù)增加浸提次數(shù)，對氨基酸提取量影響較小且耗時(shí)較久，因此選取2次為最佳浸提次數(shù)。

圖6 浸提次數(shù)對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.6 Effect of extraction times on the extraction amount of amino acids from R.stenocarpum

2.3 PB試驗(yàn)結(jié)果

PB試驗(yàn)的結(jié)果如表4和表5所示。模型P值為 0.016 1，呈顯著性差異(P<0.05)，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。從各因素的P值可知，影響?yīng)M果茶藨子氨基酸提取量的主次因素為：乙醇體積分?jǐn)?shù)>超聲溫度>超聲時(shí)間>料液比>浸提次數(shù)>超聲功率，其中超聲時(shí)間和超聲溫度對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響呈顯著(P<0.05)差異，乙醇體積分?jǐn)?shù)呈極顯著差異(P<0.01)，其他因素差異均不顯著(P>0.05)，因此，選擇超聲時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)。

表4 PB試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 4 PB test design and results

表5 PB 試驗(yàn)結(jié)果分析Table 5 Analysis of PB test results

2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果

2.4.1 響應(yīng)模型建立與分析

根據(jù)PB試驗(yàn)結(jié)果，按照表2進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，結(jié)果見表6。通過Design-Expert軟件展開二次多元回歸擬合，獲得狹果茶藨子氨基酸提取量與超聲波時(shí)間、乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度的二次多項(xiàng)式回歸方程：Y=47.57+0.12A-2.12C+0.77E+1.41AC-0.71AE-1.72CE-6.23A2-5.22C2-5.65E2。回歸方程表明，影響?yīng)M果茶藨子游離氨基酸提取量的最大因素是乙醇體積分?jǐn)?shù)，其次是超聲溫度、超聲時(shí)間。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 6 Response surface test design and results

表7 回歸模型方差分析Table 7 Analysis of variance of regression model

2.4.2 響應(yīng)面交互作用分析

通過3D擬合得到等高線圖和響應(yīng)面圖，便于直觀分析各因素之間交互作用的影響。如圖7所示，試驗(yàn)考察3個(gè)因素中兩兩間所形成的曲面圖均有一定坡度，其中超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度的曲面坡度較陡，等高線圖呈橢圓形，說明超聲時(shí)間與乙醇體積分?jǐn)?shù)、乙醇體積分?jǐn)?shù)與超聲溫度兩兩因素間呈現(xiàn)的交互作用均較明顯，而超聲時(shí)間與超聲溫度的等高線呈圓形，表明超聲時(shí)間和超聲溫度對狹果茶藨子游離氨基酸提取量無顯著影響。通過擬合得到狹果茶藨子游離氨基酸的最佳提取工藝為：超聲時(shí)間30.4 min、液料比35∶1(mL∶g)、提取2次、超聲溫度54.8 ℃、超聲功率300 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)40.2%，預(yù)測狹果茶藨子游離氨基酸提取量可達(dá)47.74 mg/g。

圖7 兩因素交互作用對狹果茶藨子氨基酸提取量的影響Fig.7 Effect of the interaction of two factors on the extraction of amino acids from R.stenocarpum

2.4.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

為驗(yàn)證該響應(yīng)面擬合得到的工藝條件是否準(zhǔn)確，按此工藝條件進(jìn)行3次提取，考慮到實(shí)際操作條件，將其修正為：超聲時(shí)間30 min、液料比35∶1(mL∶g)、提取次數(shù)2、超聲溫度55 ℃、超聲功率300 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%。狹果茶藨子游離氨基酸平均提取量達(dá)(47.57±0.67)mg/g，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.014 mg/g，與預(yù)測值相當(dāng)，表明利用響應(yīng)面法建立的回歸模型可較好地預(yù)測狹果茶藨子中游離氨基酸的實(shí)際提取量。

2.5 狹果茶藨子氨基酸組成與評價(jià)

基于現(xiàn)代營養(yǎng)學(xué)理論，食物蛋白質(zhì)氨基酸的種類、數(shù)量及組成比例決定著食物本身的營養(yǎng)價(jià)值，當(dāng)氨基酸各組分越接近FAO/WHO模式要求，則該食物的營養(yǎng)價(jià)值越高，越有利于人體健康[20]。在FAO/WHO提出的理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)模式中, 當(dāng)組成蛋白質(zhì)的必需氨基酸/總氨基酸為0.4左右，必需氨基酸/非必需氨基酸為0.6以上時(shí)，表明該食品的營養(yǎng)價(jià)值較好[21]。本實(shí)驗(yàn)通過氨基酸自動(dòng)分析儀測得狹果茶藨子中含有17種氨基酸，結(jié)果見表8，其中必需氨基酸總量為1.81 g/100 g，占總游離氨基酸的38.51%，基本符合理想蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)。在必需氨基酸中苯丙氨酸含量最高，達(dá)0.60 g/100 g，非必需氨基酸中谷氨酸含量最高，其次為天冬氨酸、組氨酸、絲氨酸等，這與孫晴等[5]的研究結(jié)果較為接近。谷氨酸是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)，不僅能夠提高免疫功能，而且具有調(diào)節(jié)大腦學(xué)習(xí)、記憶、認(rèn)知等功能[22]。天冬氨酸是機(jī)體內(nèi)重要的內(nèi)源性氨基酸，在調(diào)節(jié)腸道微生物菌群及肝臟功能衰竭等方面發(fā)揮了重要的生物學(xué)效應(yīng)。同時(shí)，谷氨酸和天冬氨酸也是重要的鮮味氨基酸，因此，從氨基酸角度分析狹果茶藨子果實(shí)具有極其重要的營養(yǎng)價(jià)值，可以用來開發(fā)成為具有特定功能性的食品。

表8 狹果茶藨子果實(shí)中氨基酸組成 單位：g/100 gTable 8 Amino acid composition in R.stenocarpum fruit

3 結(jié)論

研究發(fā)現(xiàn)，對于天然產(chǎn)物中氨基酸成分的提取，不同的提取方法對其含量具有很大的影響，這可能是由于方法的不同機(jī)制導(dǎo)致了氨基酸的未完全溶出或成分的損失。早期主要以傳統(tǒng)的浸提法為主，隨著科學(xué)研究的不斷發(fā)展，逐漸演變出水浴回流法、微波消解提取法及超聲提取法。較傳統(tǒng)方法而言，這些方法都不同程度地提高了提取效率，優(yōu)化了提取時(shí)間。但微波消解法由于其微波功率的不穩(wěn)定性以及溫度的不可控性，導(dǎo)致有效成分的結(jié)構(gòu)破壞，而超聲提取法通過自身產(chǎn)生的機(jī)械振動(dòng)作用可以有效避免該不足。因此本研究采用超聲波輔助提取法對青藏高原特色生物資源狹果茶藨子中氨基酸提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，得到最佳工藝參數(shù)為：超聲時(shí)間30 min、液料比35∶1(mL∶g)、提取次數(shù)為2次、超聲溫度55 ℃、超聲功率300 W、乙醇體積分?jǐn)?shù)40%。此條件下，得到的氨基酸平均提取量為(47.57±0.67)mg/g。通過對氨基酸組分進(jìn)行分析，根據(jù)EAA/TAA和EAA/NEAA 比值, 狹果茶藨子中氨基酸基本滿足FAO/WHO的理想模式，說明其富含人體必需氨基酸, 且組成合理均衡。

通過對狹果茶藨子果實(shí)中的營養(yǎng)成分進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)其果實(shí)中蘊(yùn)含著豐富的對人體有益成分。與常規(guī)鮮果如藍(lán)莓、桑葚、草莓相比[23-25]，狹果茶藨子果實(shí)中的膳食纖維及蛋白質(zhì)含量均顯著較高，同時(shí)脂肪含量偏低，是一種典型的低脂高纖維漿果資源。果實(shí)中富含K、Ca、P、Mg等多種有益元素,是補(bǔ)充機(jī)體所需礦質(zhì)微量元素的天然食物來源，營養(yǎng)價(jià)值與使用價(jià)值較高。目前，對于狹果茶藨子的研究多集中在活性成分上，本試驗(yàn)填補(bǔ)了營養(yǎng)成分及氨基酸提取工藝參數(shù)和組分研究的空缺，為進(jìn)一步開發(fā)與利用我國野生狹果茶藨子資源提供了重要的指導(dǎo)意義。