酶標(biāo)儀分光光度法在微生物耐性研究上的應(yīng)用

肖 蓉， 胡 展， 羅容珺， 楊 華， 雷 平， 郭照輝， 李詠梅， 付祖姣

(湖南省微生物研究院 湖南省農(nóng)用微生物應(yīng)用工程技術(shù)研究中心，湖南 長沙 410009)

活體微生物制劑利用微生物在不同環(huán)境中的自我繁殖能力，在改善微生物群落結(jié)構(gòu)、降低污染、提升土壤地力、促進(jìn)作物生長和抗病能力等方面發(fā)揮著越來越重要的作用[1-4]。截至2019年11月，在農(nóng)業(yè)部登記的微生物肥料產(chǎn)品達(dá)6 617個，其中農(nóng)用微生物菌劑約3 000個，占比近50%，使用的微生物種類超過170個，涵蓋了細(xì)菌、放線菌和真菌各大類別(http://www.biofertilizer95.cn/zhdjcpml)。至2019年11月，登記的微生物農(nóng)藥產(chǎn)品有468個，主要涉及芽胞桿菌、真菌和病毒等微生物(http://www.chinapesticide.org.cn/hysj/index.jhtml)[5]。此外，微生物在飼料、食品、環(huán)保和能源等領(lǐng)域的應(yīng)用也在逐年增加。雖然微生物在農(nóng)業(yè)、飼料業(yè)、環(huán)境等領(lǐng)域已經(jīng)取得了很好的成績，但微生物在環(huán)境中的應(yīng)用效果嚴(yán)重受限于其定殖水平和對環(huán)境的耐受能力[6-8]。耐受能力弱的微生物在產(chǎn)品貨架期或投入環(huán)境后，可能因為存活率過低很難被檢測到[9]，或者即便能檢測到，也因為增殖力弱而難以達(dá)到預(yù)期效果。因此，對微生物進(jìn)行包括紫外線、鹽、酸堿度和溫度等環(huán)境條件的耐受水平分析是對于功能微生物的應(yīng)用具有重要意義。傳統(tǒng)微生物環(huán)境耐受水平分析主要是通過平板分離獲得對單克隆菌落數(shù)量的統(tǒng)計，或通過試管、搖瓶進(jìn)行微生物培養(yǎng)，再根據(jù)菌體光密度分析其生長曲線[10-11]。為了摸索簡便可行的操作方法，研究人員采用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)微生物，以獲得微生物對不同抗生素的耐受水平[12]，或?qū)崿F(xiàn)對功能菌株的高通量篩選[13]，證實了96孔培養(yǎng)板對微生物進(jìn)行微量培養(yǎng)的可行性和便利性。還有學(xué)者比較了酶標(biāo)儀微量法和分光光度法在測定大腸埃希菌發(fā)酵菌液濃度上的差異，結(jié)果顯示兩者獲得的菌液吸光度值無顯著性差異，但酶標(biāo)儀微量法測得的結(jié)果準(zhǔn)確度和精密度更高[14]。平板分離法是評價微生物環(huán)境耐受水平的最經(jīng)典方法，但該方法操作繁瑣、耗時長，且因為操作繁瑣會導(dǎo)致結(jié)果誤差較大。隨著酶標(biāo)儀應(yīng)用的不斷深入[15-17]，其在微生物檢測上的便利性和重要性也日益凸顯。本研究通過比較酶標(biāo)儀分光光度法和傳統(tǒng)平板分離法檢測微生物對不同環(huán)境條件耐受水平上的差異，期望為微生物的耐性研究提供一種快速、簡便且高效的方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 解淀粉芽胞桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)20-10、嗜線蟲沙雷氏菌(Serratianematodiphila)C7-1、鏈霉菌(Streptomycessp.)Ahn30和TJA4由湖南省微生物研究院植物營養(yǎng)與保護(hù)室分離并保存。

1.1.2 培養(yǎng)基 ①LB培養(yǎng)基用于細(xì)菌的培養(yǎng)。②ISP2培養(yǎng)基 (g/L)：酵母提取物10，麥芽提取物4，葡萄糖4，用于放線菌的培養(yǎng)[18]。

1.1.3 主要儀器與設(shè)備 微孔板恒溫震蕩器(MB100-4A，杭州奧盛)；全波長酶標(biāo)儀(Multiskan SkyHigh，Thermo Fisher Scientific)；8通道移液器(1～10 μL 和30～300 μL，Thermo Fisher Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 微生物菌懸液的制備 細(xì)菌在LB培養(yǎng)基上劃線純化，挑取單菌落接入10 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)過夜，備用。鏈霉菌在ISP2固體培養(yǎng)基上28 ℃劃線純化，挑取單菌落轉(zhuǎn)接新鮮ISP2培養(yǎng)皿28 ℃培養(yǎng)3～5 d，待孢子長好，用滅菌不銹鋼稱量勺輕輕刮取孢子于適量的含0.5%吐溫-80的水溶液中懸浮，制成孢子懸浮液。

1.2.2 平板分離法檢測菌株紫外線耐受水平 取1～2 mL菌懸液加入24孔培養(yǎng)板中，置于30 W、254 nm波長紫外線燈正下方30 cm處分別照射2、5、10、30 min，以未經(jīng)紫外線照射的處理為對照，每個處理重復(fù)3次。取1～2 mL鏈霉菌孢子懸浮液加入24孔培養(yǎng)板中，在相同紫外線條件下分別照射10、30、60 min。將紫外線照射后的菌懸液按比例用無菌水稀釋至合適濃度，并分別取100 μL稀釋樣品涂布LB或ISP2平板，每個稀釋樣品重復(fù)涂布2個平板，細(xì)菌30 ℃培養(yǎng) 48 h，鏈霉菌28 ℃培養(yǎng)72 h，統(tǒng)計菌落數(shù)。

1.2.3 酶標(biāo)儀分光光度法檢測菌株紫外線耐受水平 菌懸液或孢子懸浮液按1.2.2進(jìn)行紫外線照射后，按2%(體積分?jǐn)?shù))的接種量接入預(yù)先添加200 μL/孔 LB或ISP2培養(yǎng)液的96孔培養(yǎng)板中，每個樣品重復(fù)2次。以2%無菌水接種的培養(yǎng)液做空白對照。接種完成后在96孔板上貼上一層無菌專用封膜，再蓋上96孔板蓋，以避免孔內(nèi)培養(yǎng)液在振蕩過程中濺出互相污染。將96孔板放入微孔板恒溫振蕩器上，細(xì)菌30 ℃、500 r/min培養(yǎng)2、4、6、8 h，鏈霉菌28 ℃、500 r/min培養(yǎng)6、12、18、21、24、27 h，用酶標(biāo)儀檢測各培養(yǎng)液在600 nm的吸光度(OD600)，以時間為橫坐標(biāo)，以吸光度為縱坐標(biāo)，繪制菌株生長曲線。

1.2.4 酶標(biāo)儀分光光度法檢測細(xì)菌的pH耐受水平 將LB培養(yǎng)液用HCl或NaOH調(diào)整pH值分別為4、5、6、7、8、9。在96孔板中加入200 μL不同pH值的LB液體，以2%的接種量接入培養(yǎng)過夜的菌懸液，貼上封膜，并蓋上板蓋，放入微孔板恒溫震蕩器上30 ℃，700 r/min培養(yǎng)2、4、6、8 h。分別以不同pH值的未接菌培養(yǎng)液做空白對照，每個pH重復(fù)6次。用酶標(biāo)儀檢測各培養(yǎng)液的OD600，并繪制菌株生長曲線。

1.2.5 酶標(biāo)儀分光光度法檢測細(xì)菌的鹽耐受水平 配制含1%、3%、5%、7%、9%NaCl的LB培養(yǎng)液。按1.2.4的方法加入培養(yǎng)液和菌懸液并培養(yǎng)，分別以不同鹽濃度的未接菌培養(yǎng)液做空白對照。用酶標(biāo)儀檢測各培養(yǎng)液的OD600，繪制不同鹽濃度下菌株的生長曲線。

1.2.6 數(shù)據(jù)處理 采用Excel軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和統(tǒng)計，采用SPSS19.0軟件(Duncan法)對不同處理間的差異進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 傳統(tǒng)平板分離法和酶標(biāo)儀分光光度法在細(xì)菌紫外線耐受性能檢測上的差異分析

將解淀粉芽胞桿菌20-10、嗜線蟲沙雷氏菌C7-1分別紫外線照射0～30 min，采用傳統(tǒng)平板分離菌落計數(shù)方法統(tǒng)計活菌數(shù)，結(jié)果如圖1所示。兩種細(xì)菌分別經(jīng)紫外線照射2、5、10和30 min后，活菌數(shù)均有所下降。其中，菌株20-10經(jīng)紫外線照射2～10 min時，活菌濃度下降約一個數(shù)量級，菌株存活率為(28.58±2.23)%～(12.04±1.42)%，但當(dāng)該菌株經(jīng)紫外線照射30 min時，活菌濃度下降非常顯著，直接下降2個數(shù)量級，降至(7.27×107±7.02×106) cfu/mL(表1)，菌株存活率為(0.64±0.06)%。沙雷氏菌C7-1經(jīng)紫外線照射后的活菌濃度下降趨勢與菌株20-10一致，但活菌下降比例更多，菌株存活率僅為(10.32±0.57)%～(0.26±0.09)%。該結(jié)果說明嗜線蟲沙雷氏菌耐紫外線性能比解淀粉芽胞弱。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析不同處理間的數(shù)據(jù)差異，發(fā)現(xiàn)無論紫外線照射多長時間，其活菌濃度均在對照基礎(chǔ)上呈顯著性下降(P<0.05)，但照射2～5 min差異不顯著，而照射(2～5)、10、30 min差異顯著(表1)。

表1 細(xì)菌經(jīng)紫外線照射后的活菌濃度

采用酶標(biāo)儀分光光度法分析菌株20-10、C7-1經(jīng)紫外線照射后的生長曲線(圖2)。從生長曲線分析，菌株20-10經(jīng)紫外線照射2、5、10 min后，生長曲線與對照基本一致，4～6 h的平均生長速度比對照分別下降了7.24%、11.96%和12.83%，但該菌株經(jīng)紫外線照射30 min后的生長曲線與對照有明顯差異，對數(shù)期時間延長，4～6 h的平均生長速度比對照下降了24.34%。不同處理間的數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，菌株20-10經(jīng)紫外線照射不同時間后，生長所至的最高細(xì)胞光密度值之間差異不顯著，但均顯著低于對照(P<0.05)。菌株C7-1經(jīng)紫外線照射2～30 min后，生長曲線基本與對照一致，對數(shù)期和穩(wěn)定期時間也基本保持一致。對不同紫外線照射時間后的細(xì)胞光密度進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，菌株在培養(yǎng)前2 h，紫外線照射后的菌株生長光密度均顯著低于對照，當(dāng)培養(yǎng)4 h時，除了紫外線照射30 min的處理外，其他處理的光密度與對照無顯著差異，隨后各處理分別達(dá)到各自的生長頂峰，但所有紫外線照射后的最高光密度值均顯著低于對照(P<0.05)。

圖1 細(xì)菌經(jīng)紫外線照射后的活菌數(shù)(平板分離法)Fig.1 The number of viable bacteria after UV irradiation(Plate separation method)

圖2 菌株20-10和C7-1經(jīng)紫外線照射后的生長情況(酶標(biāo)儀分光光度法)Fig.2 The growth of strain 20-10 and C7-1 after UV irradiation(Microplate reader method)

通過比較兩種方法檢測菌株耐紫外線性能的差異(表2)，發(fā)現(xiàn)兩者存在顯著不同。傳統(tǒng)平板分離法獲得存活菌株的數(shù)目，一個菌株經(jīng)紫外照射4個時間，重復(fù)3次，稀釋3個濃度，每個濃度2個平行，所需平板數(shù)量90個，且每個平板都涉及加樣、涂布，若2個菌株，則需至少0.5 d以上。此外，該方法培養(yǎng)時間較長，約需2 d，最后平板菌落數(shù)量統(tǒng)計依然還需要大量時間。而采用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)，一塊板可以同時檢測2個菌株，即便每個時間段使用單獨培養(yǎng)板進(jìn)行檢測，平均一個菌株最多使用2塊板。8通道移液器的使用，使96孔培養(yǎng)板加樣時間大大縮減，培養(yǎng)時間只需8 h，酶標(biāo)儀檢測僅需幾分鐘就能完成檢測，整個實驗可控制在1 d內(nèi)完成。結(jié)果分析表明，兩種檢測方法均能體現(xiàn)菌株對紫外線的耐受水平，均能進(jìn)行顯著性差異分析，且兩者獲得的顯著性程度基本一致，經(jīng)紫外線照射后，兩個菌株的活菌濃度及生長所至最高光密度均顯著低于對照。只是兩種方法檢測的結(jié)果不同，前者檢測的是存活菌株的濃度，而后者獲得的是存活菌株的生長曲線。

表2 兩種方法檢測細(xì)菌紫外線耐受性能的差異

2.2 傳統(tǒng)平板分離法和酶標(biāo)儀分光光度法分析鏈霉菌紫外線耐受性能的差異分析

考慮到鏈霉菌在實際中的廣泛應(yīng)用，本研究同樣比較了兩種方法在檢測鏈霉菌紫外線耐受性能上的差異。傳統(tǒng)平板分離法檢測發(fā)現(xiàn)兩株鏈霉菌Ahn30、TJA4的孢子經(jīng)紫外線照射后，存活趨勢一致(圖3)。兩個菌株的孢子懸浮液在紫外線照射10～60 min時，孢子濃度與對照相比，均顯著下降1～2個數(shù)量級，且下降比例與時間呈正相關(guān)(表3)。經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析，兩株鏈霉菌經(jīng)紫外線照射10～60 min后的活菌濃度與對照相比差異均顯著(P<0.05)，但不同紫外線照射時間的處理差異不顯著(P>0.05)。

圖3 鏈霉菌經(jīng)紫外線照射后的活菌數(shù)(平板分離法)Fig.3 The number of viable streptomyces after UV irradiation(Plate separation method)

表3 鏈霉菌經(jīng)紫外線照射后的活菌濃度

采用96孔培養(yǎng)板培養(yǎng)并經(jīng)紫外線照射不同時間的孢子懸浮液，通過酶標(biāo)儀檢測不同時間培養(yǎng)物在600 nm處的吸光度，發(fā)現(xiàn)兩株鏈霉菌經(jīng)紫外線照射后，孢子萌發(fā)和菌絲延伸速度明顯變緩(圖4)。與未經(jīng)紫外線照射的菌株相比，菌株Ahn30和TJA4在培養(yǎng)的前24 h光密度均顯著低于對照(P<0.05)，但這種差異在隨后的培養(yǎng)中逐漸降低，菌株Ahn30培養(yǎng)至27 h差異已不顯著，但菌株TJA4所需時間可能更長。兩株鏈霉菌經(jīng)紫外線照射后的孢子培養(yǎng)所至最高光密度的時間隨著紫外線照射時間的延長而延后，但最高值均顯著低于對照。

2.3 酶標(biāo)儀分光光度法在檢測微生物其他耐受特性上的應(yīng)用

為了檢測該方法的適用性，本研究分析了其在細(xì)菌和放線菌對pH和鹽耐受上的檢測效果(圖5～7)。圖5結(jié)果顯示，菌株C7-1比20-10具有更廣泛的pH適應(yīng)性，前者在pH 5～9的范圍內(nèi)均能很好地生長，僅在pH 4的條件下生長變緩，而后者在pH 8的條件下生長最佳，其次為pH 6和pH 7，在pH 4下幾乎不生長。從圖6可以看出，菌株20-10能在1%～7%的鹽濃度下生長，但隨著鹽濃度增加，遲緩期延長，當(dāng)鹽濃度達(dá)到7%時生長非常緩慢；而菌株C7-1在低于3%的鹽濃度下能夠生長，而當(dāng)鹽濃度提高至5%以上時幾乎不生長。圖7為鏈霉菌對鹽的耐受水平，從圖7可看出，菌株Ahn30能在0%～3%的鹽濃度下生長，當(dāng)鹽濃度高于5%時幾乎不生長；而菌株TJA4在0%～9%的鹽濃度下均能生長，但隨著鹽濃度的升高延滯期延長，生長速度和最高活菌體密度都會降低。與細(xì)菌生長曲線相比較，雖然酶標(biāo)儀分光光度法能檢測放線菌在不同鹽濃度下的生長情況，但鏈霉菌在96孔板中培養(yǎng)的平行差異非常大，這可能是因為隨著培養(yǎng)時間的延長放線菌菌絲成團(tuán)所致。鑒于此，本研究未分析該方法對鏈霉菌pH耐受的適用性。

圖4 鏈霉菌Ahn30和TJA4經(jīng)紫外線照射后的生長情況(酶標(biāo)儀分光光度法)Fig.4 The growth of strain Ahn30 and TJA4 after UV irradiation(Microplate reader method)

圖5 菌株20-10和C7-1在不同pH條件下的生長情況(酶標(biāo)儀分光光度法)Fig.5 The growth of strain 20-10 and C7-1 at different pH(Microplate reader method)

圖6 菌株20-10和C7-1在不同鹽濃度下的生長情況(酶標(biāo)儀分光光度法)Fig.6 The growth of strain 20-10 and C7-1 at different salt concentrations(microplate reader method)

圖7 鏈霉菌Ahn30和TJA4在不同鹽濃度下的生長情況Fig.7 The growth of strain Ahn30 and TJA4 at different salt concentrations

3 討 論

本研究采用傳統(tǒng)平板分離法和酶標(biāo)儀分光光度法分別檢測了細(xì)菌和鏈霉菌對紫外線的耐受性能，并比較分析了兩種方法的優(yōu)缺點。兩種方法均能分析微生物的紫外線耐受水平，但傳統(tǒng)平板分離法是通過統(tǒng)計菌株經(jīng)紫外線照射后的存活量來進(jìn)行判斷，而酶標(biāo)儀分光光度法不能獲得菌株的存活量，卻可以根據(jù)其生長曲線分析存活菌株的增殖水平，進(jìn)而判斷該菌株的紫外線耐受性。兩種方法都能獲得菌株的耐受性，其結(jié)果也存在一定的互補性。本研究結(jié)果顯示，傳統(tǒng)平板分離法檢測嗜線蟲沙雷氏菌C7-1在紫外線照射下存活率要遠(yuǎn)低于解淀粉芽胞桿菌20-10，說明菌株C7-1對紫外線更敏感，但這種敏感性在菌株的增殖速度上并沒有相應(yīng)的體現(xiàn)。酶標(biāo)儀分光光度法檢測到菌株C7-1即使經(jīng)紫外線照射后，其菌株增殖速度和水平也依然高于菌株20-10，這可能是因為菌株C7-1的生長速度本來就比菌株20-10快，雖然經(jīng)過紫外線照射后的生長速度低于未經(jīng)紫外線照射的對照，但相對于生長速度較低的菌株20-10，其生長速度依然較高，故其在相同時間的OD值也就比菌株20-10要高。兩種方法除了在結(jié)果上表現(xiàn)出一定的差異外，在操作上的差異更大。傳統(tǒng)平板分離法工作量大、耗時長，且經(jīng)常會因為對初始活菌體密度判斷不準(zhǔn)，導(dǎo)致稀釋梯度不合理，稀釋平板菌落數(shù)過高或過低，而需要重做，后者操作簡便、快速，且受初始活菌體密度影響小，即便初始活菌體密度很低，也僅影響生長曲線的延滯期，通過延長檢測時間即可解決問題并獲得理想的生長曲線。同時，因為酶標(biāo)儀分光光度法操作簡便，可通過增加平行，在數(shù)據(jù)分析時去掉人為因素導(dǎo)致的偏差較大的數(shù)據(jù)，即可減少平行間的誤差，使結(jié)果更準(zhǔn)確，平板分離法因為操作較復(fù)雜，很難再通過增加平行來減少人為誤差。因此，若只需分析微生物在不同環(huán)境下的耐受水平，則可選擇操作簡便快速的酶標(biāo)儀分光光度法，若需要獲得微生物在不同環(huán)境下的存活量，則可采用傳統(tǒng)平板分離法，若為田間應(yīng)用參考，則可結(jié)合兩種方法進(jìn)行評估。

在采用酶標(biāo)儀分光光度法進(jìn)行微生物耐性分析時，需要批量培養(yǎng)微生物。本研究采用96孔細(xì)胞培養(yǎng)板批量培養(yǎng)不同處理的微生物。為了避免不同樣品在高速振蕩下產(chǎn)生孔間交叉感染，采用無菌封口膜對每個孔進(jìn)行封口。但無菌封口膜的使用同樣限制了每個小孔中的供氧量，使得好氧菌在培養(yǎng)4～8 h后即進(jìn)入穩(wěn)定期或衰亡期。因此，96孔培養(yǎng)板獲得的微生物生長曲線與搖瓶培養(yǎng)狀態(tài)下的微生物生長曲線不一致，對數(shù)期時間變短，且穩(wěn)定期、衰亡期時間提前。這種情況可通過不加封口膜進(jìn)行緩解。本研究嘗試采用96孔板，但不使用封口膜進(jìn)行菌株20-10和C7-1在不同鹽濃度下的培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)兩株細(xì)菌500 r/min培養(yǎng)8 h，平行間標(biāo)準(zhǔn)差基本都保持在10%以下，未見明顯的相互污染現(xiàn)象，且由于培養(yǎng)過程未密封，保持自然供氧，菌株的對數(shù)期延長，生長曲線更趨向于搖瓶狀態(tài)下的生長情況(結(jié)果未顯示)。但無論封口與否，從兩株細(xì)菌的生長曲線反映其對鹽的耐受水平是一致的。

此外，本研究分析了酶標(biāo)儀分光光度法在檢測微生物對pH和鹽的耐受水平中的適用性，發(fā)現(xiàn)該方法能很好地檢測細(xì)菌對不同pH和鹽濃度的耐受水平，但在進(jìn)行鏈霉菌鹽耐受試驗時，其結(jié)果不如細(xì)菌理想：生長曲線不如細(xì)菌一樣呈現(xiàn)典型的S型，且標(biāo)準(zhǔn)誤差較大。這可能是因為鏈霉菌在液體培養(yǎng)后期菌絲體易成團(tuán)，菌體密度與OD值之間很難呈現(xiàn)線性關(guān)系，使得平行間誤差較大，且鏈霉菌孢子懸浮液即便添加吐溫-80作分散劑，但其在液體中的分散性依然不如細(xì)菌，且接種量少，接種引起的人為和儀器誤差較大。因此，該方法雖然能用于鏈霉菌對不同環(huán)境耐受性的檢測，但僅限于對鏈霉菌培養(yǎng)早期生長狀態(tài)的監(jiān)測。

總之，直接采用96孔培養(yǎng)板對微生物進(jìn)行批量培養(yǎng)，結(jié)合酶標(biāo)儀對不同時間的96孔培養(yǎng)板進(jìn)行吸光度測定，可以在短時間內(nèi)檢測大量菌株的生長性能、增殖活力、生長速率等指標(biāo)。該方法相對傳統(tǒng)平板分離法，減少了大量樣本的稀釋、涂布和計數(shù)，相對于搖瓶培養(yǎng)微生物再進(jìn)行光密度檢測法，減少了多個搖瓶的接種和頻繁取樣，大大縮減了工作量，且能獲得同樣準(zhǔn)確的結(jié)果，對于研究微生物在不同環(huán)境因子中的耐受水平、優(yōu)勢菌株的誘變選育、微生物菌株的抗性篩選及活性分析等均是非?？焖偾矣行У姆椒?，具有廣泛的適用性，是高通量操作的好幫手。