許夢(mèng)萱，周明

植物RNA聚合酶IV調(diào)控DNA甲基化和發(fā)育的研究進(jìn)展

許夢(mèng)萱，周明

浙江大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物學(xué)研究所，杭州 310058

DNA甲基化是一類(lèi)穩(wěn)定可遺傳的表觀遺傳修飾，在調(diào)控基因表達(dá)、沉默轉(zhuǎn)座子和維持基因組穩(wěn)定性等方面發(fā)揮重要作用。植物中，DNA從頭甲基化通過(guò)RNA指導(dǎo)的DNA甲基化(RNA-directed DNA methylation, RdDM)途徑建立。植物特有的DNA依賴(lài)的RNA聚合酶IV (DNA-dependent RNA polymerase IV, Pol IV)是RdDM途徑核心蛋白，轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼RNA，通過(guò)RdDM途徑引導(dǎo)從頭建立DNA甲基化，進(jìn)而調(diào)控植物基因表達(dá)和生長(zhǎng)發(fā)育。Pol IV行使功能受多個(gè)蛋白調(diào)控：組蛋白閱讀器SHH1 (SAWADEE homeodomain homolog 1)識(shí)別H3K9甲基化引導(dǎo)Pol IV到基因組特定位點(diǎn)；染色質(zhì)重塑因子CLSY (CLASSY)蛋白家族協(xié)助Pol IV識(shí)別靶位點(diǎn)；RNA依賴(lài)的RNA聚合酶2 (RNA-dependent RNA polymerase 2, RDR2)將Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的單鏈RNA轉(zhuǎn)換成雙鏈RNA。本文總結(jié)了Pol IV及其調(diào)控蛋白調(diào)控植物DNA甲基化和發(fā)育的研究進(jìn)展，以期為DNA甲基化研究和農(nóng)作物育種提供參考。

DNA甲基化；RdDM途徑；RNA聚合酶IV；表觀基因組；發(fā)育

表觀遺傳是指核苷酸序列不發(fā)生改變的情況下，基因表達(dá)發(fā)生可遺傳改變，導(dǎo)致表型變化的生物學(xué)現(xiàn)象。DNA甲基化(DNA methylation)是一類(lèi)發(fā)生在胞嘧啶(cytosine, C) 5號(hào)位碳原子上、可穩(wěn)定遺傳的表觀遺傳修飾，在動(dòng)、植物基因組中廣泛存在[1～3]。DNA甲基化在基因表達(dá)調(diào)控、轉(zhuǎn)座子沉默和基因組穩(wěn)定性維持等生命活動(dòng)中起重要作用[4,5]。動(dòng)物中，調(diào)控DNA甲基化的關(guān)鍵基因突變往往導(dǎo)致胚胎致死[6～8]。植物能夠耐受較高程度的DNA甲基化改變，相關(guān)基因突變?nèi)钥梢源婊睢Ｒ虼?，植物是研究DNA甲基化的理想材料[2,9]。

植物中DNA甲基化包括CG、CHG和CHH(H指A、T或C)3種類(lèi)型，分別由不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶建立和維持。以擬南芥()為例，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MET1 (methyltransferase 1)、CMT3 (chromomethylase 3)和CMT2 (chromomethy-lase 2)分別在DNA復(fù)制過(guò)程中維持大多數(shù)CG、CHG和CHH甲基化[10～13]。DRM2 (domains rearranged methylte-ransferase 2)主要負(fù)責(zé)DNA從頭甲基化，它可以建立和維持所有類(lèi)型的DNA甲基化，以CHH甲基化為主[14]。同時(shí)，ROS1 (repressor of silencing 1)、DME (demeter)、DML2 (demeter-like protein 2)以及DML3調(diào)控DNA去甲基化[15～19]。這些DNA甲基轉(zhuǎn)移酶和去甲基化酶共同維持植物體內(nèi)DNA甲基化動(dòng)態(tài)平衡。

RNA指導(dǎo)的DNA甲基化途徑是植物DNA從頭甲基化的主要途徑[1,5,20]。該途徑由植物特有的DNA依賴(lài)的RNA聚合酶IV (Pol IV)起始，經(jīng)由一系列輔助蛋白參與，產(chǎn)生24個(gè)核苷酸小干擾RNAs (24- nucleotide small interfering RNAs, 24 nt-siRNAs)。這些24 nt-siRNAs進(jìn)一步指引DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2從頭建立DNA甲基化，調(diào)控基因表達(dá)、沉默轉(zhuǎn)座子和維持基因組穩(wěn)定性[5]。

長(zhǎng)期以來(lái)，植物如何在基因組上找到正確的位置從頭建立DNA甲基化？如何建立組織或細(xì)胞間特異的甲基化模式？如何控制DNA甲基化信息的跨代傳遞？這些都是表觀遺傳調(diào)控領(lǐng)域亟待回答的基本問(wèn)題。近期，植物Pol IV及其調(diào)控因子，如組蛋白閱讀器SHH1 (又稱(chēng)DNA-binding transcription factor, DTF1)、染色質(zhì)重塑因子CLSY蛋白家族和RDR2調(diào)控DNA甲基化從頭建立的研究，為回答這些問(wèn)題提供了十分有價(jià)值的線(xiàn)索。本文歸納并總結(jié)了Pol IV及其共純化因子調(diào)控植物DNA甲基化模式和發(fā)育的研究進(jìn)展。

1 Pol IV是RdDM途徑的核心蛋白

基因沉默是自然界普遍存在的一種調(diào)控基因表達(dá)的現(xiàn)象。早在20世紀(jì)90年代，研究人員在矮牽牛(L.)的花色轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)中發(fā)現(xiàn)了基因沉默(當(dāng)時(shí)稱(chēng)為共抑制)現(xiàn)象[21,22]。研究發(fā)現(xiàn)，除了3種典型的DNA依賴(lài)的RNA聚合酶(Pol I、Pol II和Pol III)，植物中還有第四、第五種DNA依賴(lài)的RNA聚合酶，即Pol IV和Pol V。它們轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生非編碼RNA，通過(guò)RdDM途徑引導(dǎo)從頭建立DNA甲基化，在基因沉默和維持基因組穩(wěn)定性等生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮重要作用[23,24]。

1.1 植物通過(guò)RdDM途徑從頭建立DNA甲基化

擬南芥RdDM途徑大致可以分為兩個(gè)主要步驟：Pol IV主導(dǎo)的siRNA合成和Pol V介導(dǎo)的DNA甲基化。首先，Pol IV被SHH1、CLSY家族蛋白招募到基因組特定位點(diǎn)轉(zhuǎn)錄出大量30～40個(gè)核苷酸長(zhǎng)度的單鏈RNA (single-stranded RNA, ssRNA)[25]；同時(shí)，RNA依賴(lài)的RNA聚合酶2 (RDR2)將這些ssRNA復(fù)制成雙鏈RNA (double-stranded RNA, dsRNA)[26～28]。這些dsRNA經(jīng)過(guò)核酸內(nèi)切酶Dicer樣蛋白3 (dicer- like protein 3, DCL3)切割成雙鏈24 nt-siRNAs[29]。隨后，HEN1 (HUA enhancer 1)在這些雙鏈24 nt- siRNAs的3'末端的2'OH加上一個(gè)甲基基團(tuán)，提高其穩(wěn)定性[30]。被甲基化的雙鏈24 nt-siRNAs出核后，其中一條鏈與AGO4 (argonaute)、AGO6或AGO9結(jié)合，形成復(fù)合物再次進(jìn)入細(xì)胞核[31,32]。其次，SUVH2 (SU(VAR) homologs 2)與SUVH9的SRA (SET and RING finger-associated)結(jié)構(gòu)域可以結(jié)合甲基化的DNA，且可以和DRD1 (defective in RNA-directed DNA methylation 1)、DMS3 (defective in meristem silencing 3)和RDM1 (RNA-directed DNA methylation 1)組成的DDR復(fù)合物互作[33]。DMS3和RDM1首先形成DR復(fù)合體，然后DR復(fù)合體進(jìn)一步招募DRD1形成DDR蛋白復(fù)合體。DRD1是一種染色質(zhì)重塑因子，它可能招募Pol V到基因組特定位點(diǎn)[34]。然后，Pol V轉(zhuǎn)錄出的基因間非編碼RNAs (intergenic noncoding RNAs, IGN RNAs)，與AGO蛋白內(nèi)的24 nt-siRNA通過(guò)序列互補(bǔ)配對(duì)相結(jié)合。同時(shí)，AGO復(fù)合物還能與Pol V相互作用，招募DNA甲基轉(zhuǎn)移酶DRM2，進(jìn)而在相應(yīng)位置從頭建立DNA甲基化[14,35](圖1)。在RdDM途徑中，Pol IV起始siRNA前體轉(zhuǎn)錄，在RNA指導(dǎo)的DNA從頭甲基化途徑中發(fā)揮核心作用。

1.2 Pol IV是起始RdDM途徑的關(guān)鍵蛋白

Pol IV是一個(gè)由12個(gè)亞基組成的多亞基復(fù)合物。Pol IV和Pol II共用約一半的亞基，包括NRPD6/8/ 9/10/11/12[36]。研究認(rèn)為，Pol IV的非共有亞基，是Pol II對(duì)應(yīng)亞基隨著植物的進(jìn)化，通過(guò)獨(dú)立的重復(fù)事件逐步形成[37]。與陸地植物親緣關(guān)系最近的輪藻目Charales中，RNA聚合酶II最大亞基NRPB1復(fù)制產(chǎn)生了最早的Pol IV第一大亞基NRPD1，它與Pol II共享第二大亞基。之后，Pol II第二亞基在苔蘚、蕨類(lèi)等陸地植物中復(fù)制產(chǎn)生了Pol IV的第二大亞基NRPD2[38]。Pol IV的其他Pol II對(duì)應(yīng)亞基也快速進(jìn)化，通過(guò)復(fù)制被保留并且亞功能化[39]。這些亞基經(jīng)歷逐步復(fù)制和多樣化，形成Pol IV獨(dú)特的亞基，不同亞基的進(jìn)化模式與亞基的功能有關(guān)。Pol IV亞基按照功能可以分為催化亞基和非催化亞基兩類(lèi)。其中，兩個(gè)最大亞基NRPD1、NRPD2組成催化中心；其他亞基調(diào)控聚合酶的不同功能，如模板選擇、起始、延伸和終止等步驟[40]。近期，冷凍電鏡進(jìn)一步揭示了Pol IV的三維結(jié)構(gòu)。Pol IV的結(jié)構(gòu)與Pol II類(lèi)似，形如一個(gè)蟹爪，但在其活動(dòng)中心裂隙(cleft)中關(guān)鍵基序的構(gòu)象不同。此外，Pol IV缺乏Pol II起始和延伸因子的錨定表面，說(shuō)明Pol IV具有不同于Pol II的轉(zhuǎn)錄起始機(jī)制[28]。Pol IV亞基及結(jié)構(gòu)的獨(dú)特性，決定了Pol IV在植物中發(fā)揮不同于Pol II的功能，即在RdDM途徑中轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生24 nt-siRNAs的前體ssRNA。

目前，Pol IV不同亞基的功能還不完全清楚，已有研究主要集中在Pol IV最大亞基NRPD1。在擬南芥中敲除導(dǎo)致全基因組范圍內(nèi)超過(guò)90%的24 nt-siRNAs消失[41]。DNA甲基化組研究發(fā)現(xiàn)，失活RdDM途徑的不同組分對(duì)DNA甲基化的影響程度不同。當(dāng)失活Pol IV的最大亞基NRPD1，會(huì)導(dǎo)致RdDM途徑依賴(lài)的DNA甲基化幾乎完全消失[42]。這些數(shù)據(jù)表明Pol IV是RdDM途徑的核心蛋白，起始RdDM途徑。因此，研究Pol IV如何被調(diào)控尤為重要。

圖1 RNA指導(dǎo)的DNA甲基化途徑示意圖

Pol IV被招募到靶位點(diǎn)主要依賴(lài)SHH1和CLSY家族蛋白。SHH1可以識(shí)別組蛋白H3K9甲基化，通過(guò)蛋白互作招募Pol IV至特定位點(diǎn)。CLSY家族不同成員具有不同的功能來(lái)招募或輔助Pol IV到達(dá)靶位點(diǎn)：CLSY1、CLSY2可以和SHH1相互作用共同招募Pol IV；CLSY3、CLSY4主要和CG甲基化相關(guān)。Pol V被招募到靶位點(diǎn)需要SUVH2/9蛋白以及DRD1、DMS3和RDM1形成的DDR蛋白復(fù)合體。

2 Pol IV調(diào)控蛋白

除Pol IV自身12個(gè)亞基外，對(duì)Pol IV最大亞基NRPD1進(jìn)行親和純化還鑒定出多個(gè)共純化蛋白，例如SHH1、CLSY1-4、RDR2和RDM4等[43]。研究表明，這些蛋白參與引導(dǎo)Pol IV到基因組特定位點(diǎn)，重塑染色質(zhì)協(xié)助Pol IV識(shí)別靶位點(diǎn)，將Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的ssRNA轉(zhuǎn)換成dsRNA等關(guān)鍵過(guò)程。

2.1 組蛋白閱讀器SHH1引導(dǎo)Pol IV靶向基因組位置

Pol IV如何在基因組上找到其靶位點(diǎn)是植物表觀遺傳學(xué)研究的一個(gè)熱點(diǎn)。Pol II通常被轉(zhuǎn)錄因子招募到特定的基因組位置，起始轉(zhuǎn)錄功能。到目前為止，還沒(méi)有證據(jù)表明轉(zhuǎn)錄因子能夠輔助或招募Pol IV行使轉(zhuǎn)錄功能，但Pol IV仍需要被招募到基因組特定位點(diǎn)。利用生化和質(zhì)譜手段分析發(fā)現(xiàn)，擬南芥SHH1與Pol IV直接互作[43]。染色質(zhì)免疫沉淀測(cè)序(chromatin immunoprecipitation sequencing, ChIP-seq)顯示在突變體中，Pol IV不能結(jié)合到受SHH1調(diào)控的位點(diǎn)，說(shuō)明Pol IV到達(dá)這些位點(diǎn)依賴(lài)SHH1蛋白。結(jié)構(gòu)和生化數(shù)據(jù)顯示SHH1蛋白包含一個(gè)SAWADEE結(jié)構(gòu)域，可通過(guò)獨(dú)特的串聯(lián)Tudor樣折疊(tandem Tudor-like fold)識(shí)別未甲基化的H3K4和甲基化的H3K9[44,45]。擬南芥中，組蛋白H3K9甲基化信號(hào)往往和依賴(lài)RdDM途徑的DNA甲基化位點(diǎn)重疊。這樣，SHH1蛋白將DNA從頭甲基化和組蛋白H3K9甲基化聯(lián)系起來(lái)，從而形成一個(gè)自身相互加強(qiáng)的循環(huán)。因此，SHH1可以通過(guò)識(shí)別染色質(zhì)上H3K9甲基化，招募Pol IV到基因組特定位置行使轉(zhuǎn)錄功能。然而，擬南芥基因組中僅有44%Pol IV依賴(lài)的24 nt-siRNAs受SHH1調(diào)控，說(shuō)明還存在其他蛋白調(diào)控Pol IV的功能，例如CLSY蛋白。

2.2 染色質(zhì)重塑因子CLSY家族完整調(diào)控Pol IV功能

除SHH1蛋白外，還有一類(lèi)SNF2 (sucrose nonfermenting 2)染色質(zhì)重塑因子通過(guò)共純化和遺傳實(shí)驗(yàn)被鑒定出來(lái)與Pol IV互作[43,46]。因該蛋白序列中包含一個(gè)“CLASSY”的氨基酸基序，將其稱(chēng)為CLASSY蛋白，簡(jiǎn)稱(chēng)CLSY蛋白[46]。擬南芥基因組共有4個(gè)基因，形成CLSY家族，4個(gè)成員分別稱(chēng)為CLSY1-4[43]。在進(jìn)化上，CLSY家族蛋白與DRD1同屬于植物特異性的DRD1亞家族[47]。在CLSY蛋白家族內(nèi)部，CLSY1和CLSY2屬于一個(gè)分支；CLSY3和CLSY4屬于另一個(gè)分支。這種進(jìn)化上的分化，暗示它們可能行使不同的功能[48]。CLSY蛋白包含一個(gè)SNF2_N結(jié)構(gòu)域(也稱(chēng)為DEXDc結(jié)構(gòu)域)和一個(gè)解旋酶C結(jié)構(gòu)域(helicase C domain)[46]。這兩個(gè)結(jié)構(gòu)域構(gòu)成了對(duì)染色質(zhì)重塑活性十分重要的ATPase (ATP synthase)域[49,50]。結(jié)構(gòu)模擬顯示CLSY蛋白還存在結(jié)合和水解三磷酸腺苷(adenosinetri-phosphate, ATP)的motif以及一個(gè)KKRKK核定位信號(hào)[46]。這些信息表明，CLSY家族蛋白可能在核內(nèi)通過(guò)水解ATP釋放的能量來(lái)重塑核小體，改變DNA的可及性(accession)，從而招募或調(diào)控Pol IV行使功能[51,52]。

通過(guò)對(duì)不同突變體的表觀組測(cè)序和遺傳學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，失活單個(gè)基因，會(huì)不同程度地降低24 nt-siRNAs積累和減少對(duì)應(yīng)區(qū)域的DNA甲基化水平，且不同基因調(diào)控的位點(diǎn)絕大部分都不重合，表明單個(gè)基因以位點(diǎn)特異性的方式調(diào)控DNA甲基化。其中，影響24 nt-siRNAs位點(diǎn)的范圍最大。盡管4個(gè)基因分別影響了不同基因組區(qū)域的DNA甲基化，但是它們影響的24 nt-siRNAs只占突變體的一部分，說(shuō)明它們存在功能冗余[53]。雙突變體組合(和)相對(duì)于單突變體影響更多位置的24 nt-siRNAs產(chǎn)生和DNA甲基化，且和的作用范圍不重合，與進(jìn)化分析結(jié)果吻合。四突變體()和突變體幾乎等同，影響擬南芥幾乎所有Pol IV依賴(lài)的24 nt-siRNAs的積累和DNA甲基化水平。因此，擬南芥中4個(gè)染色質(zhì)重塑因子CLSY1-4能夠完整地調(diào)控Pol IV的功能，并且單個(gè)CLSY家族成員或雙成員組合以位點(diǎn)特異性的方式調(diào)控24 nt- siRNAs的產(chǎn)生和DNA甲基化[54]。

利用ChIP-seq進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)Pol IV主要富集在24 nt-siRNAs產(chǎn)生位點(diǎn)。四突變體中，Pol IV的富集信號(hào)幾乎完全消失，表明Pol IV到基因組特定位點(diǎn)行使功能依賴(lài)4個(gè)CLSY蛋白組合[54]。遺傳分析結(jié)合小RNA測(cè)序發(fā)現(xiàn)與高度相似，而與作用位點(diǎn)不重疊，說(shuō)明SHH1和CLSY1/2一起發(fā)揮作用。生化數(shù)據(jù)證明CLSY1/2影響SHH1和Pol IV的相互作用。一方面SHH1通過(guò)識(shí)別染色質(zhì)上的H3K9甲基化，招募Pol IV到基因組特定位置；同時(shí)CLSY1/2發(fā)揮染色質(zhì)重塑因子的作用，通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象輔助或招募Pol IV起始ssRNA轉(zhuǎn)錄。另一方面，遺傳證據(jù)顯示CLSY3/4調(diào)控的位點(diǎn)與CG甲基化關(guān)聯(lián)，但CLSY3/4如何找到其靶位點(diǎn)，目前還不清楚。盡管有證據(jù)顯示CLSY3可能通過(guò)識(shí)別特定的DNA motif招募Pol IV行使功能，但還需要證明CLSY3直接結(jié)合該motif[55]。

綜上所述，CLSY家族單個(gè)蛋白可能通過(guò)改變?nèi)旧|(zhì)構(gòu)象，以位點(diǎn)特異性的方式輔助或招募Pol IV到基因組特定位點(diǎn)起始ssRNA轉(zhuǎn)錄，CLSY家族可以完整調(diào)控Pol IV功能(圖1)。

2.3 Pol IV-RDR2復(fù)合物將ssRNA轉(zhuǎn)換成dsRNA

Pol IV被招募到其靶位點(diǎn)后行使轉(zhuǎn)錄功能，產(chǎn)生ssRNA。由于Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的ssRNA被RDR2復(fù)制為dsRNA后，隨即被DCL蛋白快速切割，使得Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物很長(zhǎng)一段時(shí)間都沒(méi)有被檢測(cè)出來(lái)。在三突變體背景中，由于3個(gè)功能冗余的基因失活，Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物得以積累，因此Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物可以通過(guò)測(cè)序被鑒定出來(lái)[27]。研究發(fā)現(xiàn)，Pol IV轉(zhuǎn)錄區(qū)域的兩側(cè)富含A/T序列，這一特點(diǎn)與Pol Ⅱ轉(zhuǎn)錄區(qū)域的序列模式類(lèi)似，顯示出Pol II和Pol IV介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的相似性。但Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物具有5'單磷酸，在3'末端缺少poly(A)尾，且不含內(nèi)含子，這些特征又將它們與Pol II轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物區(qū)分開(kāi)來(lái)。在基因組上，Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物主要來(lái)自基因間區(qū)域，其中65%與轉(zhuǎn)座子或重復(fù)序列重疊，約9%與基因重疊[27]。Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物長(zhǎng)度僅為30～40個(gè)核苷酸，推測(cè)一個(gè)Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物加工成一個(gè)24 nt-siRNA[25]。此外，Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的3'末端含有堿基錯(cuò)配，研究發(fā)現(xiàn)模板鏈上的DNA甲基化導(dǎo)致不當(dāng)堿基的錯(cuò)誤整合是Pol IV轉(zhuǎn)錄終止的一種機(jī)制。在DNA甲基化位點(diǎn)附近優(yōu)先終止Pol IV轉(zhuǎn)錄將促進(jìn)先前存在的DNA甲基化位點(diǎn)附近的siRNA生成，從而形成一個(gè)自我強(qiáng)化的循環(huán)[25]。

Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的ssRNA如何被傳遞到RDR2？近期，Pol IV-RDR2復(fù)合物三維結(jié)構(gòu)的解析，為理解這一過(guò)程提供了細(xì)節(jié)。冷凍電鏡結(jié)構(gòu)顯示，擬南芥Pol IV-RDR2形成一個(gè)全酶(holoenzyme)，它們的活性位點(diǎn)是直接連接的，形成一個(gè)聚合酶RNA通道。首先，Pol IV合成一定長(zhǎng)度的ssRNA后會(huì)發(fā)生轉(zhuǎn)錄暫停并倒退，此時(shí)該ssRNA能夠直接穿過(guò)這個(gè)聚合酶RNA通道，到達(dá)RDR2活性位點(diǎn)，隨后被RDR2作為模板合成dsRNA。完成dsRNA的合成后，又回到轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)，開(kāi)始下一輪的合成。這既能保證RDR2底物的特異性，又能確保dsRNA的產(chǎn)生限制在基因組的RdDM位點(diǎn)，同時(shí)不被RNA核酸酶降解[28]。

2.4 其他蛋白

在Pol IV的親和純化中，除SHH1、4個(gè)CLSY蛋白和RDR2外，還鑒定出了RDM4 (RNA-directed DNA methylation 4；也稱(chēng)為defective in meristem silencing 4, DMS4)蛋白[43]。RDM4是一種從酵母到人類(lèi)都保守的蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)與酵母IWR1(與RNA Pol II相互作用)具有序列相似性。突變除了減少RdDM靶位點(diǎn)的DNA甲基化，還導(dǎo)致擬南芥植株變小和部分不育等發(fā)育缺陷[56]。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，RDM4的突變直接或間接影響Pol IV依賴(lài)的siRNAs、Pol V依賴(lài)的IGN RNAs合成和許多Pol II驅(qū)動(dòng)基因的表達(dá)。這些數(shù)據(jù)表明RDM4可能是這幾種RNA聚合酶的共同調(diào)節(jié)因子[57]。此外，研究還發(fā)現(xiàn)，RDM4部分通過(guò)CBF (C-repreat-binding factor)調(diào)節(jié)擬南芥對(duì)冷脅迫的反應(yīng)，RDM4在冷脅迫反應(yīng)中的作用與RdDM途徑無(wú)關(guān)[58]，也說(shuō)明RDM4在植物其他途徑中發(fā)揮作用。

3 Pol IV調(diào)控蛋白CLSY家族塑造植物表觀基因組模式

3.1 CLSY家族基因塑造組織和細(xì)胞特異性表觀基因組模式

植物中DNA甲基化模式在不同組織和細(xì)胞間存在較大差異。例如，根尖分生組織中不同類(lèi)型細(xì)胞具有獨(dú)特的DNA甲基化模式。其中，中央根冠細(xì)胞的CHH甲基化水平在根尖分生組織中最高，甚至高于生殖細(xì)胞[59]。此外，擬南芥胚發(fā)育到種子萌發(fā)過(guò)程中CG和CHG甲基化較穩(wěn)定，而CHH甲基化的變化程度較大[60,61]。這些研究表明，不同組織間差異化的CHH甲基化主要與DRM2和RdDM途徑有關(guān)，但具體的調(diào)控基因和調(diào)控機(jī)制還不清楚。最新研究發(fā)現(xiàn)，CLSY家族基因具有組織特異性表達(dá)，參與調(diào)控?cái)M南芥組織間差異化的DNA甲基化模式。

擬南芥中，CLSY家族基因表達(dá)具有很強(qiáng)的組織特異性。GUS報(bào)告基因系顯示：CLSY1主要在葉片、花苞等的維管組織中表達(dá)；CLSY3在成熟但未受精的胚珠中富集表達(dá)；CLSY2和CLSY4的表達(dá)量較低，在葉原基和花原基中有少量表達(dá)[55]。共聚焦顯微鏡觀察CLSY3-Venus熒光報(bào)告株系，在幼苗和葉片中無(wú)法觀察到熒光信號(hào)，但在心皮和花藥中熒光信號(hào)富集[62](圖2)。玉米()中(required to maintain repression1，擬南芥同源基因)主要在根尖、幼苗的葉片、芽頂端分生組織和未成熟的穗等有絲分裂程度高的組織中表達(dá)[63]。CLSY家族成員的組織特異性表達(dá)模式，暗示它們可能會(huì)協(xié)同Pol IV，通過(guò)RdDM途徑建立和調(diào)控組織特異性24 nt-siRNAs和DNA甲基化模式。

擬南芥不同組織間小RNA和DNA甲基化存在明顯差異。例如，胚珠中數(shù)百個(gè)位點(diǎn)24 nt-siRNAs的豐度就占到其所有24 nt-siRNAs的約90%，這些位點(diǎn)被高度甲基化[55]。對(duì)突變體進(jìn)行小分子RNA和DNA甲基化測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，CLSY家族基因在全基因組范圍內(nèi)調(diào)控組織特異性24 nt-siRNAs產(chǎn)生和DNA甲基化模式。CLSY1在葉片中表達(dá)最高，相應(yīng)地葉片中絕大多數(shù)24 nt-siRNAs的積累和DNA甲基化模式依賴(lài)CLSY1。胚珠中，24 nt-siRNAs和DNA甲基化模式則主要受CLSY3調(diào)控[55]。甚至改變一個(gè)到兩個(gè)CLSY基因就可以實(shí)現(xiàn)不同組織間DNA甲基化模式轉(zhuǎn)換。例如：花序中，clsy1,2突變體顯示出與野生型胚珠相似的24 nt-siRNAs特征；胚珠中，clsy3,4突變體顯示出與野生型葉片相似的24 nt-siRNAs特征；而在葉片中，clsy1突變體則顯示出與nrpd1突變體相似的24 nt-siRNAs特征[55]。這些數(shù)據(jù)表明，CLSY家族蛋白是調(diào)控?cái)M南芥不同組織間DNA甲基化模式差異的關(guān)鍵因子(圖2)。

除了調(diào)控DNA從頭甲基化，CLSY4還被發(fā)現(xiàn)在DNA去甲基化中發(fā)揮作用。突變體高甲基化區(qū)域的核小體占有率降低，說(shuō)明CLSY4可能通過(guò)核小體重塑促進(jìn)活性DNA去甲基化[53]。同時(shí)突變體中非CG序列的高甲基化取決于RdDM途徑。進(jìn)一步研究表明4個(gè)CLSY蛋白除了可以共同調(diào)控經(jīng)典RdDM途徑；每個(gè)CLSY蛋白還可以介導(dǎo)依賴(lài)RdDM途徑的DNA甲基化位點(diǎn)的去甲基化。4個(gè)CLSY蛋白在調(diào)控?cái)M南芥基因組DNA甲基化過(guò)程中發(fā)揮雙重作用，協(xié)調(diào)從頭甲基化途徑和主動(dòng)去甲基化途徑來(lái)進(jìn)行基因座特異性DNA甲基化動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)[53]。

綜上所述，CLSY家族成員的表達(dá)有很強(qiáng)的組織特異性，它們能夠單獨(dú)或組合在一起通過(guò)調(diào)控RdDM途徑和DNA去甲基化途徑共同塑造擬南芥不同組織特異的表觀基因組模式。

3.2 CLSY3調(diào)控表觀遺傳信息跨代傳遞

植物有性生殖過(guò)程中往往伴隨著表觀遺傳信息的重編程，在這個(gè)過(guò)程中，保持轉(zhuǎn)座子沉默和維持基因組的穩(wěn)定性對(duì)遺傳信息跨代傳遞十分重要[64,65]。擬南芥中，RdDM途徑介導(dǎo)雄性生殖細(xì)胞中特異性DNA甲基化模式的建立，調(diào)節(jié)生殖細(xì)胞基因表達(dá)[66]。近期研究表明，CLSY家族蛋白在表觀遺傳信息跨代傳遞過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。

擬南芥中，特異地在花藥絨氈層細(xì)胞中高度表達(dá)，而不能在減數(shù)分裂細(xì)胞中表達(dá)。小分子RNA和DNA甲基化測(cè)序發(fā)現(xiàn)，而不是其他基因，調(diào)控絨氈層細(xì)胞24 nt-siRNAs產(chǎn)生和DNA甲基化。但在突變體中不表達(dá)的雄性減數(shù)分裂細(xì)胞，原來(lái)高甲基化轉(zhuǎn)座子的DNA甲基化水平和24 nt-siRNAs豐度卻發(fā)生了丟失，表現(xiàn)出類(lèi)似于突變體的特征。這表明絨氈層細(xì)胞中依賴(lài)的24 nt-siRNAs可能從絨氈層細(xì)胞(體細(xì)胞)移動(dòng)到減數(shù)分裂細(xì)胞(雄性生殖細(xì)胞)，通過(guò)順式()或反式()作用方式引導(dǎo)建立精細(xì)胞的表觀基因組模式，沉默轉(zhuǎn)座子和維持基因組的穩(wěn)定性，使得表觀遺傳信息通過(guò)精細(xì)胞在跨代傳遞中保持穩(wěn)定(圖2)。因此，CLSY家族對(duì)雄性生殖細(xì)胞特異性DNA甲基化模式的建立十分重要。值得注意的是，絨氈層細(xì)胞產(chǎn)生的24 nt-siRNAs在減數(shù)分裂細(xì)胞中是以不完全匹配(允許3個(gè)堿基錯(cuò)配)的方式靶向目標(biāo)位點(diǎn)，引導(dǎo)建立DNA甲基化[62]。最近的研究表明，RdDM途徑的啟動(dòng)并不需要24 nt-siRNAs與其核靶序列之間完全序列配對(duì)[67]。這為人們理解RdDM途徑如何調(diào)控植物表觀遺傳信息跨代傳遞提供了重要線(xiàn)索。此外，還被發(fā)現(xiàn)在雌性器官胚珠中特異富集表達(dá)，調(diào)控siren siRNAs (small- interfering RNA in endosperm)的表達(dá)和DNA甲基化模式建立[55]。盡管還缺乏雌性器官細(xì)胞層面的數(shù)據(jù)，我們推測(cè)CLSY3可能是一個(gè)調(diào)控雄性和雌性生殖發(fā)育細(xì)胞DNA甲基化模式的關(guān)鍵蛋白。

圖2 CLSY家族調(diào)控?cái)M南芥組織和細(xì)胞特異性DNA甲基化模式

以擬南芥為例，主要在成熟的葉片和蓮座葉中表達(dá)，主要在胚珠和絨氈層細(xì)胞中特異性表達(dá)，和的表達(dá)量較低，圖中未顯示。胚珠中，CLSY3招募Pol IV與一個(gè)特定的motif相關(guān)，且可以調(diào)控siren loci的甲基化。絨氈層細(xì)胞中，CLSY3招募Pol IV產(chǎn)生的24 nt-siRNAs通過(guò)胞間連絲進(jìn)入減數(shù)分裂細(xì)胞，調(diào)控精細(xì)胞中24 nt-siRNAs水平和DNA甲基化狀態(tài)，控制擬南芥跨代遺傳信息傳遞。不同的組織中，CLSY家族基因調(diào)控?cái)M南芥組織特異性DNA甲基化模式。CLSY家族基因的DNA甲基化模式示意圖根據(jù)文獻(xiàn)[55]修改繪制。絨氈層中的表達(dá)根據(jù)文獻(xiàn)[62]修改繪制。

4 Pol IV調(diào)控植物發(fā)育

Pol IV作為RdDM途徑的核心蛋白，其功能缺失導(dǎo)致全基因組范圍內(nèi)24 nt-siRNAs丟失和DNA甲基化水平變化。如果這些變化位于基因附近，會(huì)影響基因的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致植物多種發(fā)育缺陷；在水稻()、玉米等富含轉(zhuǎn)座子的農(nóng)作物中尤為明顯。

擬南芥突變體表型較弱，突變體中誘導(dǎo)晚開(kāi)花表型的(flowering wageningen)基因啟動(dòng)子區(qū)域CHH甲基化減少，該基因表達(dá)被激活，導(dǎo)致開(kāi)花時(shí)間延遲[68,69]。擬南芥中，轉(zhuǎn)座子和重復(fù)序列集中在基因很少的著絲粒周?chē)鷧^(qū)域[70]。這可以部分解釋為什么擬南芥RdDM途徑關(guān)鍵成分突變體沒(méi)有明顯的發(fā)育異常。

盡管擬南芥突變體沒(méi)有明顯的發(fā)育表型，但在其他雙子葉植物中，缺失Pol IV會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的發(fā)育缺陷[71]。與擬南芥同為十字花科的薺菜()基因組中含有大量的轉(zhuǎn)座子，Pol IV功能喪失對(duì)薺菜的影響比擬南芥更強(qiáng)。在薺菜中，突變體花粉發(fā)育停滯在小孢子發(fā)育期、種子變小且數(shù)量變少，花粉管生長(zhǎng)調(diào)節(jié)子()、()和等基因可能參與這一過(guò)程，但詳細(xì)機(jī)制還有待進(jìn)一步驗(yàn)證[72]。白菜型油菜()突變體種皮顏色變深。是調(diào)控種皮顏色的轉(zhuǎn)錄因子，在種子發(fā)育過(guò)程中顯著上調(diào)，導(dǎo)致種皮顏色變深。此外，突變體種子變的更小、更干癟[73]。在番茄()中，突變體的花和葉也出現(xiàn)明顯的發(fā)育異常，且高度不育[74]。

在單子葉植物水稻中，轉(zhuǎn)座子占基因組的35%以上，且部分位于常染色質(zhì)區(qū)域[42]。如果DNA甲基化變化區(qū)域位于基因附近，往往會(huì)影響相鄰基因的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育。在水稻中，敲除或敲低Pol IV最大亞基的兩個(gè)同源基因和導(dǎo)致水稻株高降低、分蘗數(shù)增多、穗變小和育性變差等重要農(nóng)藝性狀改變。研究發(fā)現(xiàn)，和通過(guò)調(diào)控(ideal plant arc-hitecture 1，也稱(chēng)為)控制水稻分蘗。Pol IV可以調(diào)控啟動(dòng)子和基因下游微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座序列(miniature inverted-repeat trans-posable elements, MITE)的DNA甲基化水平。在水稻突變體中，隨著這些MITE位置DNA甲基化丟失，被激活而被抑制，導(dǎo)致水稻分蘗增多[42]。此外，Pol IV還參與水稻對(duì)病毒的抗性，水稻草狀矮化病毒(rice grassy stunt virus, RGSV)編碼的P3蛋白可以誘導(dǎo)一個(gè)U-box類(lèi)型E3泛素連接酶(P3-inducible protein 1, P3IP1)特異性高表達(dá)，與OsNRPD1a互作并導(dǎo)致其泛素化和UPS (ubiquitin-proteasome system)依賴(lài)性降解，進(jìn)而導(dǎo)致水稻植株矮化和分蘗增多(圖3)。Pol IV的缺失還能進(jìn)一步促進(jìn)RGSV的侵染[75]。Pol IV功能喪失對(duì)單子葉植物玉米的植物發(fā)育也有顯著的影響。玉米Pol IV最大亞基NRPD1參與葉片極性、性別決定、開(kāi)花時(shí)間和副突變的調(diào)控。(required to main-tain repression 6)編碼玉米Pol IV最大的亞基，突變體顯示多種發(fā)育缺陷：開(kāi)花時(shí)間延遲，營(yíng)養(yǎng)節(jié)間較短導(dǎo)致植株矮小，幼年到成年?duì)I養(yǎng)生長(zhǎng)發(fā)育轉(zhuǎn)變的時(shí)間變長(zhǎng)，同時(shí)近軸-遠(yuǎn)軸極性改變，部分頂端雌蕊不發(fā)生敗育導(dǎo)致兩性花的形成。RMR6通過(guò)限制頂端花序()的功能來(lái)維持玉米的雌雄同體的性別決定模式[76]。在玉米突變體中，(liguleless 2)表達(dá)下降，該基因可以調(diào)節(jié)營(yíng)養(yǎng)期到生殖期的轉(zhuǎn)變，最終導(dǎo)致玉米突變體開(kāi)花顯著延遲[77]。()調(diào)控花青素色素合成，等位基因純合會(huì)使?fàn)I養(yǎng)組織，花藥顏色變成深紫色，會(huì)抑制等位基因的表達(dá)。正常情況下，糊粉層中的表達(dá)會(huì)被抑制，避免色素沉積；玉米缺失不能維持抑制狀態(tài)導(dǎo)致籽粒顏色變深[78～80]。

圖3 Pol IV調(diào)控水稻重要農(nóng)藝性狀

在水稻中，水稻草狀矮化病毒(RGSV)P3蛋白可以誘導(dǎo)P3IP1特異性高表達(dá)，增強(qiáng)OsNRPD1a的泛素化，通過(guò)泛素蛋白酶體系統(tǒng)(UPS)依賴(lài)性降解。水稻和表達(dá)的降低導(dǎo)致微型反向重復(fù)轉(zhuǎn)座元件(MITE)CHH甲基化顯著降低，從而影響調(diào)控水稻分蘗的關(guān)鍵農(nóng)藝學(xué)重要基因(和)的表達(dá)，進(jìn)而導(dǎo)致水稻分蘗增多。在突變體中，Pol IV轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的ssRNA無(wú)法復(fù)制成dsRNA，進(jìn)而導(dǎo)致、、等花粉發(fā)育相關(guān)基因表達(dá)降低，水稻育性變差。在突變體中，24 nt-siRNAs數(shù)量顯著變少，同時(shí)GA和BR穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因的失衡，水稻植株出現(xiàn)株高降低和葉夾角變大的表型。

除了Pol IV之外，RdDM途徑中其他關(guān)鍵蛋白的缺失也常出現(xiàn)類(lèi)似的異常發(fā)育表型。以水稻為例，突變體株高降低、穗變小、雌蕊，雄蕊發(fā)育異常。研究表明，依賴(lài)的DNA甲基化可能會(huì)調(diào)節(jié)參與雄蕊發(fā)育、減數(shù)分裂和花粉活力的多個(gè)關(guān)鍵基因的表達(dá)。例如雄蕊發(fā)育相關(guān)基因、和的表達(dá)在突變體中下降，這些基因表達(dá)的變化可能最終導(dǎo)致育性異常[81]。的敲低導(dǎo)致植物株高降低，葉夾角變大。在突變體中，赤霉素(gibberellin, GA)和油菜素內(nèi)酯(brassinosteroid, BR)代謝穩(wěn)態(tài)失衡從而導(dǎo)致形態(tài)異常，編碼GA失活酶的(elongated uppermost internode)基因在敲低植物中表達(dá)上調(diào)，導(dǎo)致水稻矮化。外源施加赤霉素可以挽救植物的矮化表型。此外，OsDCL3a的直接靶標(biāo)(GAST family gene in rice 1)可以促進(jìn)BR合成，影響水稻的葉夾角的大小[82]。OsAGO4a通過(guò)調(diào)節(jié)位于啟動(dòng)子中的兩個(gè)串聯(lián)微型轉(zhuǎn)座子影響水稻對(duì)稻瘟病菌的抗性[83]。的敲除同樣會(huì)導(dǎo)致植物株高的降低和結(jié)實(shí)率的下降[84]。定向破壞，會(huì)損害水稻的營(yíng)養(yǎng)和生殖發(fā)育，導(dǎo)致植株變矮、抽穗延遲或無(wú)抽穗、小穗形態(tài)異常，并且完全不育[85]。綜上所述，RdDM途徑關(guān)鍵蛋白的缺失影響植物正常生長(zhǎng)發(fā)育，說(shuō)明由Pol IV起始的RdDM途徑對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育至關(guān)重要(圖3)。

5 結(jié)語(yǔ)與展望

Pol IV是植物特有的DNA依賴(lài)的RNA聚合酶，由12個(gè)亞基組成。Pol IV的三維結(jié)構(gòu)為理解Pol IV

作用方式提供了更多細(xì)節(jié)。擬南芥中Pol IV-RDR2復(fù)合物組成一個(gè)全酶，并在內(nèi)部形成一個(gè)RNA通道，使得Pol IV轉(zhuǎn)錄的ssRNA能準(zhǔn)確、及時(shí)地傳遞給RDR2，產(chǎn)生dsRNA。Pol IV的共純化蛋白中，SHH1能夠識(shí)別H3K9甲基化，進(jìn)而招募Pol IV到基因組靶位點(diǎn)。4個(gè)CLSY蛋白作為染色質(zhì)重塑因子，完整調(diào)控Pol IV的功能，協(xié)助Pol IV起始轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生24 nt-siRNAs，起始RdDM途徑，從頭建立DNA甲基化，調(diào)控基因表達(dá)、沉默轉(zhuǎn)座子和維持基因組穩(wěn)定性。

目前，盡管?chē)@Pol IV的研究很多，但還有一些機(jī)制不清楚。比如，Pol II的轉(zhuǎn)錄過(guò)程以及其不同亞基的功能已比較清楚，但Pol IV的亞基是如何組裝的，具體細(xì)節(jié)還有待厘清。組裝好的Pol IV如何被招募到CLSY3/4依賴(lài)的位點(diǎn)，詳細(xì)的分子機(jī)制還有待進(jìn)一步闡明。與擬南芥不同，水稻和玉米中存在不止一個(gè)NRPD1的同源基因，他們是否存在功能上的分化，也缺乏系統(tǒng)研究。另外，Pol IV和RdDM途徑在植物抗病方面發(fā)揮重要作用，是否參與調(diào)控其他脅迫反應(yīng)，還有待進(jìn)一步探索。

Pol IV對(duì)植物發(fā)育的影響在擬南芥、水稻、玉米等單、雙子葉模型中都有研究。敲除Pol IV最大亞基NRPD1在擬南芥中沒(méi)有明顯發(fā)育表型，但在水稻、玉米、番茄和薺菜等植物中都出現(xiàn)了嚴(yán)重的發(fā)育缺陷。Pol IV調(diào)控蛋白對(duì)植物發(fā)育也有重要影響，如調(diào)控水稻株高、分蘗和育性等重要農(nóng)藝性狀。但目前對(duì)CLSY家族和SHH1的功能研究還較缺乏，尤其是在農(nóng)作物中的研究較少。CLSY家族能夠完整調(diào)控Pol IV的功能，預(yù)示著SHH1、CLSY家族的單個(gè)基因或多基因組合可能在這些農(nóng)作物的發(fā)育中發(fā)揮重要作用。

Pol IV及其調(diào)控蛋白在農(nóng)作物生長(zhǎng)發(fā)育中發(fā)揮重要作用，為通過(guò)表觀遺傳調(diào)控改良農(nóng)作物提供了新途徑。近期，基于CRISPR技術(shù)的DNA甲基化靶向編輯已在植物中建立。例如，擬南芥中，基于細(xì)菌CG特異性DNA甲基轉(zhuǎn)移酶MQ1的變體與失活的Cas9 (nuclease-dead mutants of Cas9, dCas9)融合，開(kāi)發(fā)了基于CRISPR的CG甲基化特異性靶向系統(tǒng)，可以靶向甲基化擬南芥基因組特定CG位點(diǎn)的胞嘧啶[86]。利用帶有煙草() DRM甲基轉(zhuǎn)移酶催化結(jié)構(gòu)域的SunTag系統(tǒng)可以有效地靶向基因啟動(dòng)子，使擬南芥開(kāi)花提前[87]。在水稻中，基于SunTag系統(tǒng)的靶向DNA去甲基化系統(tǒng)可以對(duì)蛋白質(zhì)編碼基因和轉(zhuǎn)座子進(jìn)行靶向DNA去甲基化[88]。這些研究的發(fā)展為從DNA甲基化層面改良農(nóng)作物提供了技術(shù)支持。

總之，對(duì)Pol IV及其調(diào)控蛋白的研究將為植物DNA甲基化研究和從表觀遺傳調(diào)控層面改良農(nóng)作物提供有益的參考和線(xiàn)索。

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Advances of RNA polymerase IV in controlling DNA methylation and development in plants

Mengxuan Xu, Ming Zhou

DNA methylation is a type of stable epigenetic modifications that plays crucial roles in regulating gene expression, silencing transposons and maintaining genome stability. In plants, theDNA methylation is established via a pathway termed as RNA-directed DNA methylation (RdDM). The plant-specific DNA-dependent RNA polymerase IV (Pol IV) as the core protein in RdDM pathway produces non-coding RNAs that direct the establishment of DNA methylation, regulates gene expression and controls plant development.Pol IV function is regulated by several proteins including SHH1, which recognizes H3K9 methylation and guides Pol IV to genome specific sites, the chromatin remodeling factor CLSY family that is involved in assisting Pol IV chromatin association and RDR2 that converts Pol IV produced single-stranded RNA into double-stranded RNA. In this review, we summarize the latest progress on Pol IV and its co-regulators, and focus on their functions in shaping epigenome and development in plants, which might provide implications for studying of DNA methylation and crop breeding.

DNA methylation; RdDM pathway; Pol IV; epigenome; development

2022-03-08;

2022-06-07;

2022-06-21

中央高校111計(jì)劃(編號(hào)：B14027)和浙江大學(xué)“百人計(jì)劃”資助[Supported by 111 Project (No. B14027) and the Hundred-Talent Program of Zhejiang University]

許夢(mèng)萱，在讀碩士研究生，專(zhuān)業(yè)方向：植物學(xué)。E-mail: 21907017@zju.edu.cn

周明，博士，研究員，研究方向：溫度調(diào)控植物發(fā)育的遺傳和表觀遺傳基礎(chǔ)。E-mail: mingzhou@zju.edu.cn

10.16288/j.yczz.22-063

(責(zé)任編委: 陸發(fā)隆)