黃敏, 江標(biāo), 高大中, 謝冰, 韋姝羽, 邢韶華

大黃花蝦脊蘭內(nèi)生真菌及土壤真菌的群落特征研究

黃敏, 江標(biāo), 高大中, 謝冰, 韋姝羽, 邢韶華*

北京林業(yè)大學(xué)生態(tài)與自然保護(hù)學(xué)院, 北京 100083

大黃花蝦脊蘭是列入我國(guó)《全國(guó)極小種群野生植物拯救保護(hù)工程規(guī)劃》中亟待拯救的極小種群物種之一。內(nèi)生真菌及土壤微生物是影響蘭科植物生長(zhǎng)繁育的重要因素, 為摸清大黃花蝦脊蘭內(nèi)生真菌及土壤微生物的群落特征, 促進(jìn)其種群擴(kuò)繁, 對(duì)采自安徽涇縣大黃花蝦脊蘭開(kāi)花期和果期的根、根際土、根圍土進(jìn)行了高通量測(cè)序, 對(duì)所得序列進(jìn)行聚類(lèi)分析、α多樣性分析、β多樣性分析和LEfSe分析, 探究不同時(shí)期下大黃花蝦脊蘭的內(nèi)生真菌和土壤真菌的組成及多樣性變化。結(jié)果: 測(cè)序得到1127529條有效真菌序列, 通過(guò)聚類(lèi)分析將其劃分為761個(gè)OTUs, 分屬于8門(mén)、93科、121屬; Venn圖分析發(fā)現(xiàn)根和土壤中有24個(gè)屬的菌類(lèi)屬于共有真菌, 植物根存在特有的菌類(lèi); 在不同時(shí)期大黃花蝦脊蘭的優(yōu)勢(shì)菌群不同, 花期和果期的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌分別為T(mén)ulasnellaceae(15.68%)和(56.75%), 優(yōu)勢(shì)土壤真菌分別為(12.19%)和(15.93%); 優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌在根、根際土、根圍土的三個(gè)不同的水平距離上, 真菌豐度呈梯度性遞減趨勢(shì); 大黃花蝦脊蘭的微生境真菌群落在群落結(jié)構(gòu)和組成上有明顯的季節(jié)變化特征。

大黃花蝦脊蘭; 內(nèi)生真菌; 土壤真菌; 群落結(jié)構(gòu); 高通量測(cè)序

0 前言

大黃花蝦脊蘭(Decne.)是蘭科蝦脊蘭屬植物, 花的形態(tài)美觀, 在對(duì)12種蘭科蝦脊蘭屬植物的分析與評(píng)價(jià)中, 其觀賞性得分最高, 生長(zhǎng)適宜性?xún)H次于三褶蝦脊蘭()和銀帶蝦脊蘭()[1], 極具觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。大黃花蝦脊蘭對(duì)生境要求苛刻, 種群數(shù)量極少, 屬于亟待拯救的極小種群物種[2]。然而該如何拯救？影響該物種種群擴(kuò)繁的關(guān)鍵因素又是什么？目前尚未有明確的答案。早在1903年, Bernard就證實(shí)了在自然環(huán)境下的蘭科植物種子只有感染了合適的真菌后才能正常萌發(fā)生長(zhǎng)[3]。近年來(lái), 國(guó)內(nèi)外對(duì)蘭科植物的研究日漸增多, 關(guān)于蘭科植物內(nèi)生真菌的研究更是研究熱點(diǎn)。不過(guò), 目前針對(duì)大黃花蝦脊蘭的研究?jī)H涉及生態(tài)學(xué)、組培學(xué)[4–5], 而關(guān)于其內(nèi)生真菌的研究還少有報(bào)道。最新的研究成果解決了大黃花蝦脊蘭的無(wú)菌播種技術(shù)問(wèn)題[5], 但是組培苗往往存在移栽成活率低、生長(zhǎng)緩慢、開(kāi)花延遲甚至不開(kāi)花等問(wèn)題[6], 而內(nèi)生真菌可以顯著提高組培苗的移栽成活率以及鮮重、株高等植株品質(zhì)[7]。例如, 天麻種子與紫萁小菇等萌發(fā)菌伴播技術(shù)的研發(fā)極大推動(dòng)了天麻的量產(chǎn), 提高了天麻的質(zhì)量[8]。內(nèi)生真菌還能提高宿主植物對(duì)病蟲(chóng)害的抗脅迫性, 目前已成功應(yīng)用到多種植物病害的防治研究中。劉艷明等從鐵皮石斛中篩選出34株具有拮抗炭疽菌的內(nèi)生真菌, 它們對(duì)致病菌的抑制率高達(dá)85%—95%[9]。此外, 蘭科植物的內(nèi)生真菌群落并不是一成不變的, 且內(nèi)生真菌群落結(jié)構(gòu)的變化很可能與寄主植物的物候相關(guān)。侯天文等發(fā)現(xiàn)蘭科菌根的真菌群落多樣性在生長(zhǎng)期達(dá)到頂峰, 到果期時(shí)則大幅下降[10]。為了較為全面地了解瀕危植物大黃花蝦脊蘭的內(nèi)生真菌, 本研究通過(guò)高通量測(cè)序技術(shù), 獲取植物根和土壤的大部分真菌序列, 研究大黃花蝦脊蘭的根部?jī)?nèi)生真菌和土壤真菌的群落結(jié)構(gòu)和多樣性特點(diǎn), 對(duì)比分析真菌群落在兩個(gè)重要生殖生長(zhǎng)期之間的變化, 以及優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌在水平距離上的分布規(guī)律, 對(duì)了解大黃花蝦脊蘭與其內(nèi)生真菌的共生關(guān)系具有重要意義, 為該種群的高效擴(kuò)繁、原地保護(hù)和種群再引入提供參考數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料采集及預(yù)處理

于2019年4月(花期)和9月(果期), 在安徽省宣城涇縣, 取同一地點(diǎn)大黃花蝦脊蘭的根圍土、根際土、根三類(lèi)樣品, 考慮到大黃花蝦脊蘭是極小種群物種, 因此在相鄰不超過(guò)0.5 m的3個(gè)植株上每類(lèi)樣品各取1份, 每次取樣9份, 共計(jì)18份樣品。

大黃花蝦脊蘭所在生境的土層薄, 約10—15 cm。清除土壤表面的枯枝落葉, 挖土壤剖面(從土壤表面挖到巖石表面), 每株植物取3根完整的植株根, 清除根表面明顯的枯落物和大土塊, 置于無(wú)菌自封袋中, 放入干冰桶內(nèi)帶回。本研究將距離根系表面0—1 cm的土壤視為根圍土, 采用抖落的方法, 經(jīng)2 mm土壤標(biāo)準(zhǔn)篩過(guò)篩后存于無(wú)菌自封袋中。將距離根表面0.1 mm范圍內(nèi)的土壤視為根際土, 采用超聲波震蕩的方法將土粒從根表面剝離, 存于無(wú)菌自封袋中。土壤樣本中每株植物都盡可能地多取, 每份土壤樣品＞5g即可。選取新鮮健康的營(yíng)養(yǎng)根, 用自來(lái)水將根沖洗干凈, 將根剪成2—3 cm長(zhǎng)的小段, 再用蒸餾水清洗, 隨后放入0.1%的升汞溶液中浸泡5—8 min, 取出后用蒸餾水沖洗1—2次, 再放入75%的酒精中浸泡20 s左右, 最后用蒸餾水沖4—6次, 晾干后放入無(wú)菌EP管。經(jīng)初步處理后, 將以上樣品移至-80 ℃冰箱中保存。

1.2 真菌基因組DNA提取、擴(kuò)增及測(cè)序

利用DNA提取試劑盒(MN NucleoSpin 96 Soi)對(duì)樣品中的DNA進(jìn)行提取。根據(jù)張志東等的研究, 內(nèi)生真菌多樣性分析中采用ITS1-5F引物對(duì), 可獲得更全面的內(nèi)生真菌的多樣性數(shù)據(jù)[11]。因此, PCR擴(kuò)增采用真菌通用引物ITS1-5F引物對(duì)(ITS5: 5’－GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG; ITS2: 5’－GCTGCGTTCTTCATCGATGC－3’)對(duì)樣品中真菌的ITS1區(qū)域進(jìn)行擴(kuò)增, 引物合成和測(cè)序由北京百邁客生物科技有限公司進(jìn)行。PCR反應(yīng)體系為10 μL體系, 即1 μL DNA模板, 3 μM上游引物, 3 μM下游引物, 5 μL KOD FX Neo Buffer, 4 mM dNTP, 0.2 μL KOD FX Neo, 用ddH2O補(bǔ)足至10 μL。PCR擴(kuò)增程序?yàn)? 95 ℃預(yù)變性5 min; 95 ℃變性30 s, 50 ℃退火30 s, 72 ℃延伸40 s, 循環(huán)35次; 72 ℃延伸7 min, 最后于4 ℃保溫。在1.8%的瓊脂糖凝膠, 電壓120 V的條件下通過(guò) Solexa PCR(20 μL體系)運(yùn)行40 min。根據(jù)電泳定量結(jié)果, 將產(chǎn)物按照質(zhì)量比1: 1進(jìn)行混樣。混樣后, 采用OMEGA DNA 純化柱進(jìn)行過(guò)柱純化。在1.8%的瓊脂糖凝膠中, 120 V電壓下電泳40 min后, 切目的片段, 并用Monarch DNA 膠回收試劑盒進(jìn)行回收, 使用Illumina Hiseq2500 PE250進(jìn)行雙向測(cè)序。

1.3 序列分析

對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接(FLASH, v1.2.11), 將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾(Trimmomatic, v0.33), 并去除嵌合體(UCHIME, v8.1), 得到高質(zhì)量的Tags序列。使用USEARCH(v10.0)軟件對(duì)Tags在97%的相似度水平下進(jìn)行聚類(lèi)、獲得OTU, 以測(cè)序所得的所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾OTU[12], 并基于UNITE(Release8.0)分類(lèi)學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù), 在置信度閾值為0.8的水平下, 通過(guò)RDP Classifier(v2.2)軟件對(duì)OTU進(jìn)行分類(lèi)學(xué)注釋。由于本次測(cè)序所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)量不一致, 因此需要在隨機(jī)抽樣的基礎(chǔ)上進(jìn)行序列拉平處理。

在Mothur(v.1.30)中使用summary.single指令對(duì)各個(gè)樣品進(jìn)行α多樣性指數(shù)評(píng)估[13], 包括ACE豐富度指數(shù), Chao1豐富度指數(shù), Shannon多樣性指數(shù), 以及Simpson多樣性指數(shù)。Chao1和Ace指數(shù)分別用于衡量樣品和群落中的真菌種類(lèi)的多寡。Shannon和Simpson指數(shù)用于衡量樣品的真菌多樣性。真菌豐度一定時(shí), 群落中各物種的均勻度越大, 則Shannon指數(shù)值越大, Simpson指數(shù)值越小, 群落的多樣性越大。相關(guān)計(jì)算公式如下[14–17]:

其中,是指實(shí)際測(cè)量出的OTU數(shù)目;n指含有條序列的OTU數(shù)目;1指僅包含1條序列的OTU數(shù)目;2, 僅包含2條序列的OTU數(shù)目;abund指豐富物種數(shù)(豐度閾值大于);rare指稀有物種數(shù)(豐度閾值小于或等于); γ2ACE指稀有物種變異系數(shù)的估算值, 具體計(jì)算公式請(qǐng)參考文獻(xiàn)[17]。

基于Binary Jaccard和Bray Curtis距離算法, 通過(guò)QIIME軟件中的beta_diversity_through_plots.py計(jì)算β多樣性距離矩陣, 利用R語(yǔ)言中的vegan包中的metaMDS()函數(shù)和adonis()函數(shù)分別進(jìn)行NMDS分析[18]和PERMANOVA分析, 使用python繪圖展現(xiàn)樣本之間的差異。NMDS分析通過(guò)函數(shù)將樣品之間的差異程度量化為點(diǎn)與點(diǎn)之間的距離來(lái)展現(xiàn)樣品間的差異。PERMANOVA分析的本質(zhì)是基于統(tǒng)計(jì)的方差分析, 依據(jù)距離矩陣對(duì)總方差進(jìn)行分解的非參數(shù)多元方差分析方法, 可體現(xiàn)不同分組因素對(duì)樣品間差異的解釋度, 并使用置換檢驗(yàn)進(jìn)行顯著性統(tǒng)計(jì), 以此來(lái)尋找造成顯著差異的關(guān)鍵因素。

基于QIIME軟件的sumarize_taxa.py實(shí)現(xiàn)樣本分類(lèi)信息的統(tǒng)計(jì), 借助LEfSe在線分析工具實(shí)現(xiàn)LEfSe分析, LEfSe分析在樣本內(nèi)真菌的種屬關(guān)系的基礎(chǔ)上結(jié)合具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)(Kruskal- Wallis檢驗(yàn)和兩兩Wilcoxon檢驗(yàn))和線性判別分析的方法進(jìn)行特征選擇, 尋找在所有組間具有顯著性差異的物種[19]。

2 結(jié)果與分析

根據(jù)優(yōu)質(zhì)序列的鑒定結(jié)果, 我們剔除了數(shù)據(jù)中的非真菌序列和生物學(xué)重復(fù)表現(xiàn)不理想的樣本, 僅保留真菌序列與沒(méi)有鑒定結(jié)果的序列, 最終獲得1127529條優(yōu)質(zhì)序列, 聚類(lèi)分析獲得761個(gè)OTUs。其中, 來(lái)自根部的真菌序列有453194(占40.19%), 來(lái)自土壤的真菌序列有674335(占59.81%)。經(jīng)分析, 所有樣本中的序列長(zhǎng)度主要分布在100 bp—460 bp之間。通過(guò)分類(lèi)學(xué)注釋, 得到70%以上的真菌序列在各個(gè)分類(lèi)水平上的分類(lèi)地位, 包括8門(mén)20綱51目93科121屬103種。在所有序列中, 屬于子囊菌門(mén)(Ascomycota)真菌的序列占所有序列的49.31%, 擔(dān)子菌門(mén)(Basidiomycota)真菌則占了19.25%, 其余菌類(lèi)的分類(lèi)鑒定結(jié)果如圖1, 另有25.65%的序列沒(méi)有明確的鑒定結(jié)果。

2.1 內(nèi)生真菌群落特征

在大黃花蝦脊蘭的開(kāi)花期, 于其根內(nèi)獲取223194條優(yōu)質(zhì)序列。其中, 屬于子囊菌門(mén)的真菌序列占12.57%, 屬于擔(dān)子菌門(mén)的序列占22.32%, 有高達(dá)64.81%的序列沒(méi)有明確的鑒定結(jié)果。在所有序列中, 有15.68%屬于Tulasnellaceae, 1.95%屬于Hydnodontaceae, 1.82%屬于Herpotrichiellaceae, 1.5%屬于, 1.37%屬于Meruliaceae, 其余真菌類(lèi)群所占比例均小于1%。在這些內(nèi)生真菌中, Tulasnellaceae的豐度最大, 為該生長(zhǎng)時(shí)期的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌, 其余的內(nèi)生真菌占比少。

注: 為使視圖效果最佳, 只顯示豐度水平前十的物種; Root1: 花期根; Root2: 果期根; Soil1: 花期根際土; Soil2: 花期根圍土; Soil3: 果期根際土; Soil4: 果期根圍土。

Figure 1 Distribution of species on the level of the Phylum(a) and Family(b)

在大黃花蝦脊蘭的果期, 于其根內(nèi)獲取1060648條優(yōu)質(zhì)序列。為了讓開(kāi)花和結(jié)果時(shí)期的數(shù)據(jù)具有更好的可比性, 從上述序列中隨機(jī)抽取230000條序列作為代表序列進(jìn)行后續(xù)分析。在所有序列中, 屬于子囊菌門(mén)的真菌序列占84.88%, 擔(dān)子菌門(mén)的真菌序列占3.66%, 有9.94%的序列沒(méi)有明確的鑒定結(jié)果。在所有序列中, 有56.75%屬于, 4.53%屬于Didymellaceae, 2.83%屬于Helotiaceae, 1.95%屬于 Chaetosphaeriaceae, 1.78%屬于, 1.59%屬于, 1.11%屬于Leotiaceae, 1.07%Ophiocordycipitaceae, 其余真菌類(lèi)群所占比例均小于1%。在這些內(nèi)生真菌中,真菌占所有序列的一半以上, 說(shuō)明真菌在果期的大黃花蝦脊蘭中占有絕對(duì)優(yōu)勢(shì), 屬于該生長(zhǎng)時(shí)期的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌。

在logarithmic LDA score為4的基礎(chǔ)上, 通過(guò)LEfSe分析, 發(fā)現(xiàn)和Tulasnellaceae在兩個(gè)生殖生長(zhǎng)期的內(nèi)生真菌和土壤真菌的群落之間具有顯著性差異, 說(shuō)明這兩類(lèi)真菌很可能是影響大黃花蝦脊蘭生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵因子之一。

2.2 土壤真菌群落特征

在花期, 從根際土壤中獲得152577條真菌序列。在所有序列中, 有43.29%屬于子囊菌門(mén)真菌, 26.57%屬于擔(dān)子菌門(mén)真菌, 19.04%沒(méi)有明確的鑒定結(jié)果; 主要真菌類(lèi)群有(10.21%),(7.81%), Hydnodontaceae(6.57%), Didymella-ceae(5.87%),(5.3%), 其余真菌類(lèi)群所占比例均小于5%。從根圍土壤中獲取201041條真菌序列。在所有序列中, 有49.63%的序列屬于子囊菌門(mén)真菌, 15.51%的序列屬于Mortierellomycota, 22.09%的序列沒(méi)有明確的鑒定結(jié)果; 主要的真菌類(lèi)群有(15.51%),(9.43%), Clavici-pitaceae(8.85%), Chaetomiaceae(8.4%), Ophio-cordy-cipi-taceae(5.88%), Chaetosphaeriaceae(5.53%), 其余真菌類(lèi)群所占比例均小于5%。

在果期, 從根際土壤中獲得205341條真菌序列。在所有序列中, 有66.78%屬于子囊菌門(mén)真菌, 17.95%屬于擔(dān)子菌門(mén)真菌, 15.69%沒(méi)有明確的鑒定結(jié)果; 主要的真菌類(lèi)群為Aspergillaceae(13.07%),(9.75%),(9.59%), Helotiaceae (8.72%), 其余真菌類(lèi)群所占比例均小于5%。從根圍土壤中獲取115376條真菌序列。在所有序列中, 有31.1%屬于子囊菌門(mén)真菌, 53.76%屬于擔(dān)子菌門(mén)真菌, 13.87%沒(méi)有明確的鑒定結(jié)果; 主要的真菌類(lèi)群為(37.36%), Clavicipitaceae(13.92%), Hydno-dontaceae(11.49%), Aspergillaceae(5.35%), 其余真菌類(lèi)群所占比例均小于5%。

2.3 不同時(shí)期真菌群落結(jié)構(gòu)的比較

不同生長(zhǎng)季節(jié)的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌不同: 在大黃花蝦脊蘭的根內(nèi), 花期和果期的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌分別為T(mén)ulasnellaceae和; 在土壤中, 花期和果期的優(yōu)勢(shì)真菌分別為。此外, 在屬的分類(lèi)水平上,等24個(gè)屬的菌類(lèi)在所有樣品中均存在, 屬于共有真菌;等7個(gè)屬的菌類(lèi)僅存于果期的植物根及其根圍土中;真菌僅存在花期的植物根及其周?chē)寥乐?真菌在花期和果期的植物根內(nèi)均有發(fā)現(xiàn), 但在土壤中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)該真菌, 如圖2所示, Venn圖中顏色越深代表所含菌類(lèi)的種類(lèi)越多。

以上結(jié)果表明, 受宿主植物的物候影響, 優(yōu)勢(shì)真菌會(huì)發(fā)生一定程度的改變。

在兩個(gè)生殖生長(zhǎng)期的真菌群落中, 優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌Tulasnellaceae和在根、根際土、根圍土的三個(gè)不同的距離上, 真菌豐度呈梯度性遞減的趨勢(shì), 即隨著離大黃花蝦脊蘭距離的增加, 真菌豐度減少, 如圖3。說(shuō)明根、根際土和根圍土之間的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌在不同的水平距離上存在梯度性差異。

在OTU水平上, 計(jì)算各樣品真菌群落的α多樣性指數(shù), 通過(guò)獨(dú)立樣本T檢驗(yàn), 發(fā)現(xiàn)兩個(gè)生殖生長(zhǎng)期的大黃花蝦脊蘭的內(nèi)生真菌群落的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)均顯著低于其土壤真菌群落, 說(shuō)明內(nèi)生真菌群落的真菌多樣性和真菌豐富度遠(yuǎn)小于土壤真菌群落; 在同一時(shí)期的所有樣品中, 根際土的真菌群落的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù)最大, 說(shuō)明大黃花蝦脊蘭根表面的真菌種類(lèi)豐富, 根表面的真菌豐富度要比周?chē)寥乐械恼婢S富度大, 如表1所示。

注: ⅠRoot: 花期根; ⅡRoot: 果期根; ⅠSoil: 花期土; Ⅱ Soil: 果期土。

Figure 2 Venn diagram showing endophytic fungi and soil fungi in different growing seasons

在OTU水平上, 通過(guò)Bray Curtis(考慮真菌豐度和物種有無(wú))距離算法和Binary Jaccard(僅考慮物種有無(wú))距離算法, 對(duì)花期和果期的大黃花蝦脊蘭的根、根際土、根圍土的真菌群落進(jìn)行NMDS分析和PERMANOVA分析, 結(jié)果如圖4、5。結(jié)果顯示, 每類(lèi)樣品的真菌群落各自聚在一起, 不同類(lèi)別樣品的真菌群落互相分開(kāi), 且存在一定距離, 表明各類(lèi)樣品之間的真菌群落結(jié)構(gòu)有一定的差異, 如圖4(a)。除了花期的根際土和根圍土在真菌群落組成上沒(méi)有明顯差別之外, 其余樣品的真菌群落組成均有一定差異, 如圖4(b)。其中, 內(nèi)生真菌之間的距離比土壤真菌之間的距離遠(yuǎn), 說(shuō)明花期和果期之間內(nèi)生真菌群落的差異最大, 且果期內(nèi)生真菌的多樣性遠(yuǎn)大于花期。這進(jìn)一步證明, 大黃花蝦脊蘭的內(nèi)生真菌群落在一定時(shí)間內(nèi)發(fā)生了一定程度的變化, 而這種變化遠(yuǎn)大于土壤真菌群落的變化。在兩個(gè)生殖生長(zhǎng)期中, 大黃花蝦脊蘭的微生境真菌在真菌群落結(jié)構(gòu)(2= 0.223,=0.001)和真菌群落組成(2= 0.287,=0.001)上存在明顯差異, 且這種差異大于生殖生長(zhǎng)期內(nèi)土壤真菌和內(nèi)生真菌群落之間的差異, 如圖5。這說(shuō)明大黃花蝦脊蘭的微生境真菌群落在群落結(jié)構(gòu)和組成上存在明顯的季節(jié)變化特征。

注: 為使視圖效果最佳, 只顯示相對(duì)豐度＞10%的物種; Root1: 花期根; Root2: 果期根; Soil1: 花期根際土; Soil2: 花期根圍土; Soil3: 果期根際土; Soil4: 果期根圍土。

Figure 3 The dominant fungi of relative abundance of mycorrhizal fungi at different sites of the orchids

表1 大黃花蝦脊蘭內(nèi)生真菌和土壤真菌的α多樣性分析

注: 表中數(shù)據(jù)為數(shù)字±標(biāo)準(zhǔn)誤; 同一列中均值統(tǒng)一采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行比較, 同列相同字母表示兩組樣品間沒(méi)有顯著性差異(>0.05); Root1: 花期根; Root2: 果期根;Soil1: 花期根際土;Soil2: 花期根圍土;Soil3: 果期根際土; Soil4: 果期根圍土。

注: Root1: 花期根; Root2: 果期根; Soil1: 花期根際土; Soil2: 花期根圍土; Soil3: 果期根際土; Soil4: 果期根圍土。

Figure 4 The NMDS analysis of fungi in soil and the roots of the orchids

圖5 在開(kāi)花期和結(jié)果期的PERMANOVA分析

Figure 5 PERMANOVA analysis of fungi in flowering and fruiting

3 討論

在花期, 大黃花蝦脊蘭的內(nèi)生真菌Tula-snellaceae占優(yōu)勢(shì), 而果期的內(nèi)生真菌占優(yōu)勢(shì), 其絕對(duì)豐度和相對(duì)豐度遠(yuǎn)大于花期的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌。這和預(yù)期結(jié)果一致, 大黃花蝦脊蘭的優(yōu)勢(shì)真菌類(lèi)群具有階段性變化的特點(diǎn), 至少在花期和果期這兩個(gè)生殖生長(zhǎng)期之間, 優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌類(lèi)群發(fā)生徹底的轉(zhuǎn)變。造成這種轉(zhuǎn)變可能是外在環(huán)境因素和植物內(nèi)在生理生化作用共同促成的結(jié)果, 但哪個(gè)因素作為主導(dǎo)仍需進(jìn)一步研究驗(yàn)證。許國(guó)琪等研究表明土壤電導(dǎo)率、空氣CO2濃度以及土壤溫度等環(huán)境因子與大部分優(yōu)勢(shì)菌顯著相關(guān)[20]。蘭科植物幼苗可與多種真菌共生萌發(fā), 但是進(jìn)一步發(fā)育成成熟植株則會(huì)選擇只留下與之共生效益最佳的真菌[21]。這在一定程度上解釋了優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌改變的內(nèi)在原因: 在不同生長(zhǎng)時(shí)期, 大黃花蝦脊蘭會(huì)允許與其共生效益最佳的內(nèi)生真菌大量增殖, 逐漸替代別的菌類(lèi)成為優(yōu)勢(shì)種。

根據(jù)FUNGuild數(shù)據(jù)庫(kù)[22], Tulasnellaceae是被普遍承認(rèn)的蘭科菌根真菌, 而作為蘭科菌根真菌則少有報(bào)道。且這兩類(lèi)真菌在兩個(gè)生殖生長(zhǎng)期之間存在顯著性差異, 推測(cè)這兩種菌類(lèi)是大黃花蝦脊蘭的菌根真菌, 對(duì)大黃花蝦脊蘭的生長(zhǎng)繁殖起主要作用。但要確定這些真菌是否是大黃花蝦脊蘭的菌根真菌, 還需要確認(rèn)其在植物根內(nèi)的形態(tài)是否為“菌絲結(jié)”, 或進(jìn)行真菌的分離純化, 再進(jìn)行真菌回接試驗(yàn), 確定其是否對(duì)大黃花蝦脊蘭種子的萌發(fā)、生長(zhǎng)起促進(jìn)作用。有的植物內(nèi)生真菌的生態(tài)狀態(tài)極不穩(wěn)定, 隨著生活史進(jìn)程會(huì)在不同的功能營(yíng)養(yǎng)型之間轉(zhuǎn)換, 采取不同的生存策略來(lái)適應(yīng)環(huán)境的變化[23]。相對(duì)于內(nèi)生真菌, 動(dòng)植物病原菌和木質(zhì)腐生菌是真菌更常見(jiàn)的生態(tài)型[22]。這可能與真菌具有復(fù)雜的生活史有關(guān), 當(dāng)其作為植物內(nèi)生真菌時(shí)能提高植株對(duì)各種礦物質(zhì)元素的吸收進(jìn)而增大植株生長(zhǎng)量, 當(dāng)植物組織衰敗其作為腐生菌時(shí), 以分解死亡有機(jī)物為生。

大黃花蝦脊蘭的內(nèi)生真菌與土壤真菌共享了至少24個(gè)屬(12.8%)的真菌類(lèi)群, 說(shuō)明有一部分內(nèi)生真菌可能來(lái)自根際土壤。這可能由于土壤真菌長(zhǎng)期與植物根緊密接觸而有機(jī)會(huì)突破根的表皮進(jìn)入植物根內(nèi)定植[24], 但不是所有的真菌都能突破根的表皮進(jìn)入植物體, 與植物互利共生成為內(nèi)生真菌, 這可能是本研究中內(nèi)生真菌多樣性比根際土真菌多樣性低的原因。在花期和果期,作為只存在于植物根內(nèi)而不存在土壤中的真菌, 可能以菌絲或孢子的形式通過(guò)花粉或傳粉昆蟲(chóng)等載體進(jìn)入植物體內(nèi), 且已有研究表明作為內(nèi)生真菌對(duì)植物的生長(zhǎng)有促進(jìn)作用[25–26], 不排除其作為蘭科植物的內(nèi)生真菌也具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力的可能性, 但目前該菌類(lèi)作為蘭屬植物的內(nèi)生真菌還少有報(bào)道。

在大黃花蝦脊蘭中, 優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌Tulasnella-ceae和在根、根際土、根圍土3個(gè)水平距離上, 真菌豐度呈梯度性遞減的趨勢(shì)。這可能是植物通過(guò)分泌某種真菌自身無(wú)法合成的化學(xué)物質(zhì)吸引真菌富集在植物根附近, 這些根際真菌與根內(nèi)真菌連接形成真菌網(wǎng)絡(luò)作為營(yíng)養(yǎng)輸送“通道”, 由此擴(kuò)大蘭科植物在土壤中吸收營(yíng)養(yǎng)的范圍[27]。此外, 還有人發(fā)現(xiàn)蘭科植物的菌根真菌主要分布在植物體內(nèi)及其周?chē)寥? 其菌根真菌豐度隨距蘭科植物地理距離增加而下降[28–29], 與本文關(guān)于優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌在不同距離上呈梯度性變化的觀點(diǎn)一致, 不同的是Mccormick等和Waud等均將距離植株50 cm的范圍作為實(shí)驗(yàn)度量, 表明該梯度規(guī)律適用于一定的尺度距離范圍。

在花期和果期之間, 大黃花蝦脊蘭的微生境真菌群落在群落結(jié)構(gòu)和組成上存在明顯差異, 果期的內(nèi)生真菌多樣性大于花期, 與呂立新等關(guān)于內(nèi)生真菌群落季節(jié)動(dòng)態(tài)規(guī)律的觀點(diǎn)一致[30]。受不同季節(jié)的土壤理化性質(zhì)的影響, 土壤真菌多樣性和群落組成產(chǎn)生了明顯的變化[31]。內(nèi)生真菌受溫度、降水等環(huán)境因子的影響, 隨著茅蒼術(shù)發(fā)育進(jìn)程發(fā)生動(dòng)態(tài)變化[32]。推測(cè)造成大黃花蝦脊蘭的微生境真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著變化的原因除了植物物候期對(duì)應(yīng)的土壤、溫度和降水等環(huán)境因子的改變, 還有不同生殖生長(zhǎng)期之間植物內(nèi)在生理生化的變化。菌根真菌在植物內(nèi)成功定殖之前, 有一個(gè)反復(fù)被植物消解而讓蘭科植物獲取營(yíng)養(yǎng)的過(guò)程[33]。在花期的植物根內(nèi)占優(yōu)勢(shì)的Tulasnellaceae在果期的植物根內(nèi)仍存在, 但豐度極小。這可能是該真菌在花期定殖之后被蘭科植物反復(fù)消化吸收而數(shù)量減少, 而后來(lái)者提供的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)更符合果期蘭科植物的需求, 因而大量定殖。至少在對(duì)碳的需求上, 果期的蘭科植物由葉片向生殖器官運(yùn)輸?shù)?4C同化物約為花期的2倍[34]。相對(duì)于花期, 果期的蘭科植物需要吸收更多的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)用于產(chǎn)生種子, 而花期的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌不能完全滿足這種需求逐漸被植物消化而豐度減小, 果期的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌能產(chǎn)生植物激素, 如赤霉素等促進(jìn)植物生長(zhǎng), 或進(jìn)一步擴(kuò)大植物吸收氮源的范圍, 滿足植物繁育后代的物質(zhì)需求而大量定殖, 真菌豐度增大[6]。

4 結(jié)論

采用生物分子技術(shù)對(duì)瀕危植物大黃花蝦脊蘭的內(nèi)生真菌和土壤真菌進(jìn)行檢測(cè), 較為全面地反映了其微生境真菌的群落組成、結(jié)構(gòu)及分布規(guī)律, 為蘭科植物就地保護(hù)和遷地保護(hù)中涉及的生境評(píng)估提供參考。通過(guò)分析大黃花蝦脊蘭開(kāi)花期和果期的根、根際土、根圍土的真菌群落發(fā)現(xiàn)受不同生殖生長(zhǎng)期的植物生理影響, 大黃花蝦脊蘭的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌隨發(fā)育進(jìn)程發(fā)生相應(yīng)轉(zhuǎn)變, 再加上外在環(huán)境因子的綜合作用, 使得微生境的真菌群落結(jié)構(gòu)和組成發(fā)生顯著變化。Tulasnellaceae和分別作為花期和果期的大黃花蝦脊蘭的優(yōu)勢(shì)內(nèi)生真菌, 在水平距離上, 真菌豐度呈梯度性遞減的特點(diǎn)。與以往的研究相比, 本研究更關(guān)注不同生殖生長(zhǎng)期對(duì)微生境真菌群落動(dòng)態(tài)變化的影響, 以找出對(duì)大黃花蝦脊蘭生長(zhǎng)發(fā)育起關(guān)鍵作用的菌類(lèi), 為大黃花蝦脊蘭的保護(hù)提供更合理的依據(jù)。但仍存在一定不足, 如本研究的大黃花蝦脊蘭種群僅采自安徽涇縣同一個(gè)地點(diǎn), 范圍未涉及不同生境下的植物, 不同生境下大黃花蝦脊蘭的真菌群落結(jié)構(gòu)與分布是否有相似特點(diǎn)和規(guī)律有待進(jìn)一步探討。

致謝:感謝北京林業(yè)大學(xué)公共分析測(cè)試中心的張峻琦老師在實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的指導(dǎo)。

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Community characteristics of endophytic fungi and soil fungi in the

HUANG Min, JIANG Biao, GAO Dazhong, XIE Bing, WEI Shuyu, XING Shaohua*

School of Ecology and Nature Conservation, Beijing Forestry University, Beijing 100083, China

is one of the rare and endangered plant species which has been identified as an extremely small population in the national-level. Endophytic fungi and soil microorganisms are important factors affecting the growth and breeding of Orchidaceae. In order to find out the community characteristics of endophytic fungi and soil microorganisms associated with, and to promote its breeding and propagation, the high-throughput sequencing was performed on the roots, rhizoplane soil and rhizosphere soil ofcollected from Jingxian County, Anhui Province in flowering and fruiting. We performed Cluster analysis, Alpha diversity analysis, Beta diversity analysis and LEfSe analysis on the obtained sequences to explore the composition and diversity of endophytic fungi and soil fungi in different periods. The results showed that a total of 1127529 valid sequences of fungi were obtained by high-throughput sequencing, which divided into 761 OTUs by cluster analysis, belonging to 8 Phyla, 93 families and 121 genera. Venn diagram analysis showed that 24 genera of fungi in the root and soil were common fungi, whileonly in the root of plants. The fungi ofhad different dominant groups in different periods, with Tulasnellaceae (15.68%) and(56.75%) being dominant in the flowering and fruiting period; the dominant soil fungi were(12.19%) and(15.93%) respectively. The abundance of the dominant endophytic fungi showed a ladder-type decreasing tendency at three different horizontal distance from the root to rhizoplane soil and to rhizosphere soil. The community structure and composition of the microflora fungi community ofhad noticeable seasonal variation in characteristics.

; endophytic fungi; soil fungi; community structure; high throughput sequencing

10.14108/j.cnki.1008-8873.2022.04.014

Q939.5

A

1008-8873(2022)04-111-09

2020-08-03;

2020-09-02

國(guó)家林業(yè)和草原局野生動(dòng)植物保護(hù)與自然保護(hù)區(qū)管理司委托項(xiàng)目; 北京市大學(xué)生科學(xué)研究與創(chuàng)業(yè)行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目(S201910022098)

黃敏(1998—), 女, 廣西梧州人, 碩士研究生, 主要研究生物多樣性保護(hù)與利用, E-mail: 623629892@qq.com

通信作者:邢韶華, 男, 博士, 副教授, 主要從事生物多樣性保護(hù)與利用和自然保護(hù)區(qū)規(guī)劃研究, E-mail: steelboy78@163.com

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