汪秀媛，鄒奕巧，劉玲玲，陳 珍，江景勇

(1.臺州市林業(yè)技術(shù)推廣總站，浙江 臺州 318000；2.臺州市國土空間整治與生態(tài)修復(fù)中心，浙江 臺州 318000；3.臺州學(xué)院 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 臺州 318000；4.臺州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院 園藝研究所，浙江 臨海 317000)

掌葉覆盆子(Hu)，即華東覆盆子，薔薇科懸鉤子屬，為我國特色的藥食同源植物。成熟果實富含氨基酸、礦物質(zhì)Mn和Zn、維生素C、類胡蘿卜素和酚類等物質(zhì)，被譽(yù)為新興的“超級水果”。未成熟果實入藥，稱覆盆子，具補(bǔ)腎益精、養(yǎng)肝明目、抗菌消炎、抗氧化和抗腫瘤等多重功效，入選“新浙八味”中藥材培育品種。近十年來，江蘇、浙江、安徽、江西等省開始大規(guī)模種植掌葉覆盆子，面積連年攀升，2019年浙江省種植面積約達(dá)8 580 hm，占全國種植面積的一半，經(jīng)濟(jì)效益顯著。然而掌葉覆盆子種苗來源復(fù)雜，良種短缺，種子萌發(fā)率低，枝條扦插生根難，現(xiàn)主要通過根蘗繁殖。繁殖系數(shù)低，成為其產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要限制因子。植物組織培養(yǎng)體系的建立與優(yōu)化是加快覆盆子良種快繁的有效途徑。前期已有學(xué)者對掌葉覆盆子的組織培養(yǎng)進(jìn)行了初步的研究，發(fā)現(xiàn)利用莖段可誘導(dǎo)不定芽的再生與增殖。劉計權(quán)的研究結(jié)果表明，最適的誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS +吲哚丁酸(IBA)0.3 mg·L+ 6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)0.5 mg·L，最佳的繼代培養(yǎng)基為MS + IBA 0.1 mg·L+ 6-BA 1.0 mg·L+赤霉素(GA)0.05 mg·L，平均增殖系數(shù)在8以上；潘彬榮等和Zhu等則發(fā)現(xiàn)，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS + 6-BA 1.5 mg·L+萘乙酸(NAA)0.2～0.3 mg·L，最適分化培養(yǎng)基為MS + 6-糠氨基腺嘌呤(KT)2.0 mg·L+ NAA 0.4～0.5 mg·L，增殖達(dá)3.6～4.2倍。本課題組前期以浙江省臺州市的掌葉覆盆子當(dāng)年生莖段為外植體，建立了快繁體系，最佳誘導(dǎo)培養(yǎng)基和繼代培養(yǎng)基分別為MS + 6-BA 0.5 mg·L+NAA 0.01 mg·L和MS+6-BA 1.0 mg·L+NAA 0.1 mg·L，增殖系數(shù)可達(dá)15.1。但是掌葉覆盆子幼苗繼代培養(yǎng)容易發(fā)生生長退化和玻璃化現(xiàn)象，嚴(yán)重影響增殖和生根。因此，本文在前期工作的基礎(chǔ)上，優(yōu)化研究植物生長調(diào)節(jié)劑配比對掌葉覆盆子增殖和組培苗生長的影響，并改變營養(yǎng)元素的濃度，以獲得最佳的組培苗生長配方，加快實現(xiàn)生物技術(shù)規(guī)模化繁育掌葉覆盆子良種。

1 材料與方法

1.1 材料

經(jīng)過引種馴化、物候期觀察、營養(yǎng)和藥用成分測定，從上萬株野生掌葉覆盆子(Hu)植株中選育到近20個優(yōu)質(zhì)株系，種植在浙江臨海的試驗基地(28°73′39″N，121°09′11″E)。其中，優(yōu)株L14具中熟、生長勢旺、總萜和山奈酚-3--蕓香糖苷含量較高等特點(diǎn)，已在前期初步建立了組織培養(yǎng)體系。

1.2 方法

1.2.1 掌葉覆盆子不定芽的誘導(dǎo)

取掌葉覆盆子植株的當(dāng)年生幼嫩枝條，流水沖洗1～2 h，70%乙醇浸泡30 s，0.1% HgCl消毒10 min，無菌水沖洗5遍。將外植體切成1～2 cm的帶節(jié)莖段，接種到誘導(dǎo)培養(yǎng)基MS + 6-BA 0.5 mg·L+NAA 0.1 mg·L(蔗糖3%，瓊脂7%～8%，pH值5.8，下同)上。于培養(yǎng)室中培養(yǎng)，光強(qiáng)為4 000～5 000 lx，12 h·d，培養(yǎng)溫度為(23±2)℃。下同。待腋芽長至1～2 cm時切下，接種到MS + 6-BA 1.0 mg·L+ NAA 0.1 mg·L中擴(kuò)大培養(yǎng)1代，獲得叢生芽，分離單株繼續(xù)以下增殖配方優(yōu)化研究。

1.2.2 6-BA和KT配比對掌葉覆盆子組培苗增殖生長的影響

以MS為基本培養(yǎng)基，添加0.1 mg·LNAA，并設(shè)置不同的6-BA和KT配比(各0、0.05、0.1、0.5和1.0 mg·L)，共25個組合，設(shè)4個重復(fù)，共計20個外植體。培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計增殖系數(shù)，并觀察組培苗質(zhì)量。增殖系數(shù)=每個外植體基部新長出的不定芽數(shù)量/外植體數(shù)量。

1.2.3 6-BA或KT對掌葉覆盆子組培苗增殖生長的影響

為闡明6-BA和KT的作用強(qiáng)度，將6-BA設(shè)置0.01、0.05、0.1、0.2、0.5、1.0、2.0和3.0 mg·L8個濃度梯度，將KT設(shè)置0.1、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和30.0 mg·L8個梯度，分別加入MS基本培養(yǎng)基中，并添加0.1 mg·LNAA。設(shè)4個重復(fù)，共計20個外植體。培養(yǎng)30 d后，統(tǒng)計增殖系數(shù)，觀察組培苗質(zhì)量。

1.2.4 礦質(zhì)元素對掌葉覆盆子組培苗生長的影響

研究MS培養(yǎng)基中大量元素Ca和Mg、掌葉覆盆子偏好的微量元素Mn、Zn和Cu元素對掌葉覆盆子組培苗增殖生長的影響。以MS基本培養(yǎng)基+ 6-BA 0.5 mg·L+ KT 1.0 mg·L+ NAA 0.1 mg·L為對照組，其中，CaCl·2HO為440 mg·L，MgSO·7HO為370 mg·L，MnSO·HO為16.9 mg·L，ZnSO·7HO為10.6 mg·L，CuSO·5HO為0.025 mg·L。在此基礎(chǔ)上，改變上述5種營養(yǎng)元素的濃度，分別設(shè)置1/4、1/2、2和4倍強(qiáng)度。每培養(yǎng)瓶中添加30 mL培養(yǎng)基，高壓滅菌。設(shè)4個重復(fù)，共計20個外植體。培養(yǎng)45 d后，統(tǒng)計增殖系數(shù)，觀察組培苗質(zhì)量。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，并用SPSS20.0軟件作單因素方差分析(LSD法)。

2 結(jié)果與分析

2.1 6-BA和KT組合對掌葉覆盆子組培苗增殖的影響

6-BA為0～1.0 mg·L時，隨著6-BA體積質(zhì)量的增加，掌葉覆盆子組培苗增殖系數(shù)增加(表1)。0.05和0.1 mg·L6-BA不能促進(jìn)芽增殖，苗生長細(xì)弱，黃化并趨于玻璃化；此時添加0.5～1.0 mg·LKT可促進(jìn)苗生長。當(dāng)6-BA為0.5 mg·L時，增殖系數(shù)顯著增加至5.33，仍伴有輕微玻璃化，此時添加0.1～1.0 mg·LKT，可消除玻璃化現(xiàn)象，苗生長健壯。0.5 mg·L6-BA和1.0 mg·LKT組合時，增殖系數(shù)達(dá)到最大，每個外植體可新生10.33株幼苗。當(dāng)6-BA繼續(xù)增加至1.0 mg·L時，增殖系數(shù)為7.89，但玻璃化程度加劇；添加0.5～1.0 mg·LKT也可有效減輕玻璃化(表1)。另一方面，單獨(dú)添加0～1.0 mg·LKT不能促進(jìn)掌葉覆盆子組培苗的增殖，但隨著體積質(zhì)量的增加，可有效促進(jìn)苗的生長，幼苗葉片深綠(表1)。MS + 6-BA 0.5 mg·L+ KT 1.0 mg·L+ NAA 0.1 mg·L為優(yōu)化后的掌葉覆盆子增殖培養(yǎng)基配方，平均增殖系數(shù)達(dá)10.33，且苗生長健壯，能有效抑制玻璃化的產(chǎn)生。

表1 6-BA和KT組合對掌葉覆盆子組培苗增殖生長的影響

2.2 掌葉覆盆子組培苗增殖培養(yǎng)時6-BA或KT的濃度效應(yīng)

低濃度的KT不利于掌葉覆盆子組培苗增殖，不斷提高其濃度至30 mg·L，發(fā)現(xiàn)KT對掌葉覆盆子增殖的影響存在濃度效應(yīng)，且與6-BA濃度效應(yīng)相關(guān)聯(lián)。即，當(dāng)KT達(dá)到6-BA體積質(zhì)量的10倍時，其對組培苗增殖的影響與6-BA相當(dāng)(表2，圖1)。6-BA為0.01～0.1 mg·L或KT為0.10～1.0 mg·L，均不能促進(jìn)掌葉覆盆子幼苗的增殖。當(dāng)6-BA增加至0.5～1.0 mg·L或KT增加至5.0～10.0 mg·L幼苗增殖系數(shù)顯著增加且效果相當(dāng)，但是KT處理的幼苗生長優(yōu)于6-BA處理的幼苗，玻璃化現(xiàn)象消除，葉片深綠。當(dāng)兩者濃度繼續(xù)增加時，都會出現(xiàn)嚴(yán)重的玻璃化。因此，掌葉覆盆子組培時，單獨(dú)添加6-BA或KT宜分別控制在0.5～1.0 mg·L或5.0～10.0 mg·L。

圖1 KT與6-BA對掌葉覆盆子增殖培養(yǎng)的影響

表2 6-BA或KT對掌葉覆盆子組培苗增殖生長的影響

2.3 礦質(zhì)元素質(zhì)量對掌葉覆盆子組培苗生長的影響

MS培養(yǎng)基中礦質(zhì)元素對掌葉覆盆子增殖生長的影響結(jié)果見表3。適當(dāng)提高Ca濃度有利于促進(jìn)覆盆子組培苗的生長，但對增殖系數(shù)沒有顯著影響。2倍的MS Ca即(880 mg·LCaCl·2HO)為最適的Ca離子體積質(zhì)量。低濃度的Mg可滿足掌葉覆盆子組培苗的生長需求，并且能提高增殖系數(shù)，高濃度的Mg會抑制組培苗的生長，因此可添加1/4 MS Mg(即92.5 mg·LMgSO·7HO)。對于微量元素，適當(dāng)提高Cu和Mn濃度可以促進(jìn)掌葉覆盆子組培苗的生長，因此，培養(yǎng)基中可添加2倍的MS Cu(即0.050 mg·LCuSO·5HO)和MS Mn(即33.8 mg·LMnSO·HO)。而MS中Zn濃度減半(即5.3 mg·LZnSO·7HO)更利于掌葉覆盆子組培苗生長。因此，后續(xù)的培養(yǎng)中，以改良的MS培養(yǎng)基添加2倍MS Ca、1/4 MS Mg、2倍MS Cu、2倍MS Mn和1/2 MS Zn為優(yōu)化后的掌葉覆盆子增殖培養(yǎng)基，獲得的幼苗增殖良好，生長健壯，生根良好。

表3 礦質(zhì)元素質(zhì)量濃度對掌葉覆盆子組培苗增殖生長的影響

3 結(jié)論與討論

組培苗玻璃化是工廠化育苗的一大障礙。培養(yǎng)基中的細(xì)胞分裂素類物質(zhì)種類和濃度對玻璃化有顯著影響。研究表明，隨著6-BA濃度的增加，玻璃化苗比例呈遞增趨勢。這可能是因為高濃度的6-BA導(dǎo)致組培苗內(nèi)源激素比例失調(diào)造成的。高紅兵等檢測發(fā)現(xiàn)，酸櫻桃()玻璃化苗芽中吲哚乙酸(IAA)和赤霉素(GA)含量基本不變，而玉米素(ZR)含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于正常苗，從而影響組培苗的正常生長，出現(xiàn)維管束發(fā)育不全、柵欄組織和角質(zhì)層蠟質(zhì)缺失等現(xiàn)象。在掌葉覆盆子增殖培養(yǎng)過程中，組培苗的玻璃化現(xiàn)象也隨6-BA濃度的增加而加劇，因此6-BA應(yīng)控制在0.5～1.0 mg·L；此時，添加0.1～1.0 mg·LKT可促進(jìn)幼苗的生長，尤其是1.0 mg·LKT，可有效消除玻璃化現(xiàn)象的產(chǎn)生，促進(jìn)苗的健壯生長?？梢?，KT的加入與6-BA之間產(chǎn)生了一定的互補(bǔ)效應(yīng)，不但促進(jìn)組培苗的生長與增殖，且能有效減輕玻璃化，其內(nèi)在機(jī)制仍需深入研究。

不同種類細(xì)胞分裂素對懸鉤子屬植物組培苗生長和增殖的影響不同，相同濃度的KT和6-BA促進(jìn)增殖的效果不同。KT為1.0～2.0 mg·L時，不能滿足樹莓()Kivigold試管苗的增殖需求，增殖系數(shù)為1.0；而6-BA為1.0～2.0 mg·L時，增殖系數(shù)增加至4.9～4.2，顯著大于KT處理組。本研究結(jié)果也表明，0.5～2.0 mg·LKT不能促進(jìn)掌葉覆盆子組培苗增殖，而0.5～2.0 mg·L6-BA處理下增殖系數(shù)達(dá)5.0～6.0?？梢?，在0.5～2.0 mg·L時，6-BA的作用效果顯著優(yōu)于KT。然而繼續(xù)擴(kuò)大KT和6-BA的濃度范圍，發(fā)現(xiàn)當(dāng)KT增至5.0～10.0 mg·L時，增殖系數(shù)迅速增加，苗生長健壯。并且有意思的是，當(dāng)KT體積質(zhì)量為6-BA的10倍時，增殖效果相當(dāng)，且苗的生長優(yōu)于6-BA處理?？梢?，合適濃度KT也適合懸鉤子屬植物組織培養(yǎng)。

培養(yǎng)基中元素含量的改變也會顯著影響組培效果。Poothong等研究了大量元素質(zhì)量濃度改變對紅樹莓()組織培養(yǎng)的影響，提出2.5～3.0倍濃度的MS CaCl、MgSO和KHPO更適合所試5種紅樹莓的培養(yǎng)。楊瓊芬等在馬鈴薯脫毒快繁研究時發(fā)現(xiàn)，P、Ca、Mg的加量能促進(jìn)組培苗的生長。本試驗研究也表明，低濃度的Ca會引起掌葉覆盆子試管苗的玻璃化，2倍濃度的MS Ca可促進(jìn)試管苗的健壯生長。究其原因，Ca和B起細(xì)胞結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用，缺Ca會引起木質(zhì)素和纖維素含量下降，影響細(xì)胞壁形成并出現(xiàn)玻璃化。此外，Mg、Mn、Zn和Cu參與葉綠素的形成、參與電子傳遞或是呼吸酶的組成部分，影響植物的光合能力和呼吸作用，其含量也會影響組培苗的生長。而不同植物或同一植物不同基因型對元素的響應(yīng)各異，因此需在育苗時針對培養(yǎng)材料進(jìn)行細(xì)致的優(yōu)化，以獲得最佳的培養(yǎng)效果。對掌葉覆盆子優(yōu)株L14而言，2倍濃度的MS Ca、1/4濃度的MS Mg、2倍濃度的MS Cu、2倍濃度的MS Mn和1/2濃度的MS Zn更適合試管苗的增殖和生長。

綜上，本文從植物生長調(diào)節(jié)劑的組合、質(zhì)量濃度與礦質(zhì)元素含量3方面優(yōu)化了掌葉覆盆子的組培快繁配方，結(jié)果表明，單獨(dú)添加0.5～3.0 mg·L6-BA會引起試管苗的玻璃化，且隨濃度增加而加劇，添加0.1～1.0 mg·LKT可有效緩解玻璃化發(fā)生；5.0～30.0 mg·LKT促進(jìn)掌葉覆盆子組培苗增殖的效果與0.5～3.0 mg·L6-BA相當(dāng)，可見6-BA的作用強(qiáng)度約為KT的10倍；調(diào)整礦質(zhì)元素含量可使組培苗生長更為健壯。因此，改良的MS培養(yǎng)基(2倍濃度的Ca、Cu和Mn含量，1/4 Mg和1/2 Zn含量)+ 6-BA 0.5 mg·L+ KT 1.0 mg·L+ NAA 0.1 mg·L為優(yōu)化后的掌葉覆盆子增殖培養(yǎng)基配方，增殖系數(shù)達(dá)10.33，且苗生長健壯，有效抑制了玻璃化的產(chǎn)生。