回收甲狀腺細(xì)針穿刺液基細(xì)胞進(jìn)行BRAFV600E檢測的應(yīng)用價值

曹 丹，呂京澴，陳汝蕾

（南京醫(yī)科大學(xué)附屬蘇州醫(yī)院，蘇州市立醫(yī)院病理科，江蘇 蘇州 215002）

隨著甲狀腺結(jié)節(jié)發(fā)病率的提高，除了超聲檢查外，多項研究表明，細(xì)針穿刺細(xì)胞學(xué)（fineneedle aspiration cytology, FNAC）聯(lián)合BRAFV600E檢測可以提高術(shù)前甲狀腺良惡性結(jié)節(jié)的診斷率[1-2]，并且BRAFV600E突變狀態(tài)對甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma, PTC）的治療及預(yù)后的評估具有重要的指導(dǎo)意義[3]，它的特異性高達(dá)95.5%～100.0%[4-5]，但是敏感性較低，僅有40%～56%[6-7]，且存在一定比例的假陰性率，主要是由于細(xì)針穿刺的局限性，用于檢測的腫瘤細(xì)胞含量不足引起。根據(jù)FNA指南，由于不同的檢查需要，通常每個結(jié)節(jié)會穿刺2～3 次，細(xì)胞學(xué)樣本置于細(xì)胞保存液中，基因檢測樣本保存于細(xì)胞裂解液中。而實際操作中，每一次穿刺得到的細(xì)胞量并不是平均的，分別用于細(xì)胞學(xué)和基因檢測的樣本量也會不同，有時會出現(xiàn)液基涂片腫瘤細(xì)胞豐富，但用于基因檢測的細(xì)胞量不足，或者細(xì)胞總量雖然夠，但腫瘤細(xì)胞比例少，含大量的非腫瘤細(xì)胞，如正常濾泡上皮細(xì)胞和淋巴細(xì)胞等，因此出現(xiàn)細(xì)胞學(xué)診斷明確為PTC，而BRAFV600E結(jié)果模棱兩可的現(xiàn)象。本文對工作中遇到的這類液基涂片細(xì)胞進(jìn)行回收，再次擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)PCR（amplification refractory mutation system PCR, ARMS-PCR），分析BRAFV600E突變情況，并將術(shù)后病例的組織學(xué)類型歸納總結(jié)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 收集我科2021年1月—8月的樣本庫中經(jīng)兩名醫(yī)生按照甲狀腺Bethesda標(biāo)準(zhǔn)診斷為PTC的液基涂片18 例，每張片子上至少有6簇及以上的細(xì)胞團(tuán)，同時18 例標(biāo)本的BRAFV600E的擴(kuò)增曲線高于基線，但沒有呈完整的S型，按照診斷標(biāo)準(zhǔn)陽性診斷依據(jù)不足。

1.2 主要試劑儀器 二甲苯、無水乙醇購于國藥集團(tuán)， DNA提取試劑盒、人類BRAFV600E突變檢測試劑盒購于廈門艾德醫(yī)藥科技有限公司，水浴鍋購于上海精宏實驗設(shè)備有限公司，離心機(jī)和紫外分光光度計購于賽默飛世爾科技有限公司，PCR儀購自羅氏公司。

1.3 液基涂片細(xì)胞再回收 將所選液基片子通過數(shù)字掃描技術(shù)形成數(shù)字切片并儲存，把其置于烤片機(jī)上5 min，直至樹膠變軟融化，揭掉蓋玻片迅速置于二甲苯中10 min，再將其轉(zhuǎn)移至無水乙醇中10 min后取出，將組織吹干，在1.5 mL離心管中加入180 μL細(xì)胞裂解液，用移液器吸取30 μL滴加到涂片的細(xì)胞區(qū)域，在濕潤狀態(tài)下用一次性手術(shù)刀片將組織刮下，并用少量裂解液將剩下的細(xì)胞沖洗于離心管中，隨后按照核酸提取試劑說明書進(jìn)行DNA提取。

1.4 檢測DNA的濃度與純度 紫外分光光度計測量260 nm（A260）和280 nm（A280）的吸光度值，得到DNA濃度和純度，當(dāng)A260/A280為(1.8±0.1)時，說明提取的總DNA純度合格，隨后對樣本進(jìn)行定量，濃度大于5 ng/μL者，稀釋至1 ng/μL，濃度低于5 ng/μL者，原液上機(jī)。

1.5 ARMS法檢測BRAFV600E的突變情況 按照說明書配制反應(yīng)混合液，設(shè)立陰性對照（negative control,NC）和陽性對照（positive control, PC），使用ARMS法對所提取DNA的BRAFV600E突變狀態(tài)進(jìn)行檢測，反應(yīng)結(jié)束后將閾值線調(diào)節(jié)至擴(kuò)增曲線升起的拐點處，得到突變FAM信號和內(nèi)控VIC信號的循環(huán)閾值（cycle threshold, Ct）。首先分析NC和PC結(jié)果是否符合實驗要求，再對待測樣品內(nèi)控進(jìn)行評估，確定實驗結(jié)果成功可信，最后研究樣本的FAM信號，若突變檢測管的擴(kuò)增曲線呈S型且Ct值＜30，則為突變陽性，BRAFV600E為突變型。若樣品的FAM曲線不呈S型或Ct值≥30，則為陰性，稱為BRAFV600E野生型。

1.6 HE染色 對術(shù)后標(biāo)本進(jìn)行常規(guī)HE染色，顯微鏡下觀察組織學(xué)類型。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 D N A的濃度和純度 對照組的濃度為(10.737±8.158)ng/μL，實驗組的DNA濃度為(7.471±4.058)ng/μL，兩者差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。此外，兩者純度分別為(1.815±0.076)和(1.848±0.064)，均為合格，差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 BRAFV600E突變狀態(tài) 圖1為對照組，選取了1 例典型樣本的擴(kuò)增曲線圖，圖2為實驗組，包含全部18 例樣本的擴(kuò)增曲線。兩組NC均為陰性曲線，說明實驗過程沒有受到污染，PC的曲線正常升起，表明試劑有效。再對兩組的待測樣本的內(nèi)控信號（VIC信號）進(jìn)行分析，結(jié)果見表1，對照組Ct值為(14.267±1.040)，實驗組Ct值為(13.807±0.819)，兩者差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），均在實驗要求的13～21之間，說明兩組加入的總DNA量符合實驗要求，實驗成功。最后對兩組的突變反應(yīng)管進(jìn)行分析，對照組樣本擴(kuò)增曲線高于基線，但升起時間較晚，不呈完整的S型，不符合陽性診斷標(biāo)準(zhǔn)，但也不能輕易判讀為陰性。實驗組結(jié)果顯示：18 例樣本均有平滑的上升S型曲線，與基線的交叉點在30 個循環(huán)以下，Ct值為(18.194±1.980)，具體見表1（FAM信號），我們將其判讀為陽性，即為BRAFV600E突變型。

表1 各組反應(yīng)管在FAM和VIC信號下的Ct值

圖1 對照組FAM信號下的BRAFV600E擴(kuò)增曲線

圖2 實驗組FAM信號下的BRAFV600E擴(kuò)增曲線

2.3 組織學(xué)結(jié)果 以術(shù)后組織病理診斷結(jié)果作為金標(biāo)準(zhǔn)，18 例均確診為PTC，見圖3、圖4。

圖3 腫瘤呈乳頭狀結(jié)構(gòu)，可見纖維血管軸心及砂粒體（HE×100）

圖4 細(xì)胞核呈毛玻璃樣，部分細(xì)胞可見核溝（HE×100）

3 討論

甲狀腺腫瘤近年來的發(fā)病率顯著提高，其中PTC是甲狀腺癌最常見的病理類型，占85%～95%[8]，但其預(yù)后較好，所以早診斷早治療也顯得尤為重要。FNAC是術(shù)前鑒別甲狀腺結(jié)節(jié)良惡性的重要方法，具有創(chuàng)傷小、準(zhǔn)確性高等優(yōu)點，但其中仍有10%～40%的結(jié)節(jié)無法明確性質(zhì)[9]，2015年美國甲狀腺協(xié)會（ATA）指南推薦使用分子標(biāo)志物來進(jìn)一步診斷[10]，其中BRAFV600E是PTC的特異性分子標(biāo)記物。BRAFV600E突變激活RAS-RAF-MEKERK信號通路引起細(xì)胞的惡性增殖，最終導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生[11]。已有多項研究[12-13]表明BRAFV600E基因突變與腫瘤大小、被膜外侵犯及頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，提示其突變是PTC復(fù)發(fā)的獨(dú)立危險因素。本文用ARMS法檢測BRAFV600E的突變狀態(tài)，DNA分別提取自細(xì)胞裂解液（對照組）和已經(jīng)制片的液基涂片（實驗組），結(jié)果顯示實驗組濃度低于對照組，可能由于實驗組的細(xì)胞來自于再提取，從液基細(xì)胞制片過程到再提取操作，都會損失部分細(xì)胞，而對照組是直接從細(xì)胞裂解液中提取，幾乎沒有損失，但兩組差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），并且兩組內(nèi)控均合格，說明實驗組雖然濃度低，但加入PCR反應(yīng)體系的DNA總量是夠的。PCR結(jié)果顯示實驗組中18 例均為BRAFV600E陽性，我們認(rèn)為與對照組相比，實驗組的陽性率顯著提高的原因是由于提取的是總DNA，雖然對照組濃度更高，但可能其中正常細(xì)胞較多，腫瘤細(xì)胞比例少，低于ARMS法能檢測出的最低1%突變的標(biāo)準(zhǔn)，造成BRAFV600E結(jié)果的不明確，而實驗組再提取直觀地選取了有豐富腫瘤細(xì)胞數(shù)量的標(biāo)本，相當(dāng)于事先對腫瘤細(xì)胞量進(jìn)行了評估，所以陽性率大大提高，最后組織學(xué)結(jié)果也證實了我們的術(shù)前診斷。

雖然從液基涂片中再提取DNA進(jìn)行BRAFV600E檢測的應(yīng)用價值得到了證實，但是此項操作還有一些方面需要我們進(jìn)一步討論。

液基涂片上的腫瘤細(xì)胞數(shù)量是決定實驗成敗的關(guān)鍵，因為操作過程不可避免地會損失部分細(xì)胞，所以需要選取有豐富濾泡細(xì)胞團(tuán)的涂片，如果原本涂片上腫瘤細(xì)胞也很少，本文所述方法的應(yīng)用就會受到限制。

涂片回收過程中多次使用到乙醇，乙醇作為固定劑能夠快速穿透細(xì)胞，凝固核蛋白，并且不改變DNA的一級結(jié)構(gòu)，可用于分子生物學(xué)技術(shù)[14]，為我們回收DNA提供了理論基礎(chǔ)。在脫蠟過程中，用乙醇置換二甲苯，這時候乙醇要揮發(fā)干凈，因為它的殘留不僅會影響蛋白酶K的活性，降低DNA提取效率，還會使維持DNA雙螺旋穩(wěn)定性的氫鍵斷裂，破壞堿基間的堆積力，引起DNA變性，產(chǎn)生一定量的單鏈DNA，使得A260處的吸光度增加，這也許是實驗組的A260/A280比對照組稍大的原因。但是乙醇揮發(fā)時間長，又容易使得DNA暴露在空氣中過久，引起為數(shù)不多的DNA降解，所以這個組織吹干時間的長短是我們需要把握好的。

據(jù)報道[15]，染色劑與DNA結(jié)合，會抑制Taq酶的活性，表現(xiàn)為樣本內(nèi)控Ct值升高，也有報道[16]認(rèn)為DNA提取用的硅膠模吸附柱有濾過純化作用，可以最大限度地除去染色劑分子，本文結(jié)果顯示巴氏染色后的實驗組內(nèi)控均在要求的范圍內(nèi)，但我們未與未染色組進(jìn)行比較，后續(xù)會進(jìn)步一研究證實。

我們一般從濃度、純度和完整性三個方面對DNA質(zhì)量進(jìn)行評估，細(xì)胞經(jīng)過液基制片以及再提取過程，是否會引起DNA的片段化，本文基于研究側(cè)重點，主要關(guān)注BRAFV600E突變狀態(tài)的變化，后續(xù)也會對DNA的完整性進(jìn)一步探討。

本實驗需要先得到細(xì)胞學(xué)結(jié)果，再進(jìn)行BRAFV600E的檢測，延長了發(fā)報告的時間，同時這也限制了此方法的常規(guī)應(yīng)用。

從液基涂片中重新提取D N A再次進(jìn)行BRAFV600E檢測在實際應(yīng)用有一定的局限性，那是否還有其他來源的標(biāo)本可以替代呢？根據(jù)文獻(xiàn)報道[17]，BRAFV600E檢測標(biāo)本還可以來自于液基保存液中的剩余標(biāo)本，它有一定的優(yōu)勢，比如細(xì)胞學(xué)與分子病理報告使用同一份標(biāo)本，結(jié)果更加客觀，對病人來說可以少穿刺一針，降低穿刺過程的痛苦和風(fēng)險。但是在細(xì)胞量少時，由于大部分樣本已用于液基制片，剩余樣本中的組織量會很少，并且當(dāng)涂片制作不滿意，需要再次制片時，會面臨無標(biāo)本可用的情況，因此我們不將其作為常規(guī)基因檢測標(biāo)本使用。在遇到本文所述的情況需要重新檢測時，仍然不考慮用其作為標(biāo)本來源，其一是因為相比較于直接從涂片上獲取細(xì)胞，我們無法對保存液中的腫瘤細(xì)胞數(shù)量進(jìn)行直觀的評估，其二樣本中細(xì)胞由于未經(jīng)過巴氏染色，均為透明狀，在進(jìn)行離心的操作中，肉眼看不到細(xì)胞沉淀，會誤吸導(dǎo)致?lián)p失大量細(xì)胞。標(biāo)本還可以來源于細(xì)胞蠟塊[18]，一般留存液基所需的標(biāo)本量后，其余收集做成細(xì)胞蠟塊，這樣除了基因檢測以外，還可以連續(xù)切片進(jìn)行免疫組化，大大拓展了術(shù)前診斷的內(nèi)容。這項技術(shù)在胸腹水、痰等標(biāo)本中已經(jīng)廣泛應(yīng)用，但是前提仍然是需要大量的細(xì)胞，而目前我們甲狀腺的細(xì)針穿刺標(biāo)本經(jīng)過離心后，幾乎得不到細(xì)胞沉淀物，還不能滿足此項目的常規(guī)使用，需要穿刺醫(yī)生積累經(jīng)驗，精準(zhǔn)穿刺。還有報道[19]使用穿刺洗脫液進(jìn)行基因檢測，穿刺洗脫液用于甲狀腺球蛋白含量的測定已經(jīng)得到了廣泛應(yīng)用，但是在基因檢測方面，由于其得到的腫瘤細(xì)胞量非常少，所以其實際應(yīng)用價值仍待研究。

綜上所述，當(dāng)我們常規(guī)進(jìn)行BRAFV600E檢測時，遇到腫瘤細(xì)胞含量特別少，導(dǎo)致檢測結(jié)果出現(xiàn)模棱兩可的情況，而這份病例對應(yīng)的液基涂片又細(xì)胞含量豐富，那么從中再提取DNA重新進(jìn)行一次基因檢測不失為提高術(shù)前診斷結(jié)果準(zhǔn)確率的好方法。由于本文所述的情況較為特殊，我們還沒有收集到更多的病例，后續(xù)會擴(kuò)大樣本量，優(yōu)化實驗條件，繼續(xù)探討。