賈 璇，李雪琪，劉曉佩，竇潤(rùn)琦，賈晨浩，高 霞，李鳴曉*

1. 北京工商大學(xué)，國(guó)家環(huán)境保護(hù)食品鏈污染防治重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048

2. 北京工商大學(xué)，中國(guó)輕工業(yè)清潔生產(chǎn)和資源綜合利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100048

3. 中國(guó)環(huán)境科學(xué)研究院，環(huán)境基準(zhǔn)與風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100012

隨著我國(guó)“無(wú)廢城市”管理理念和“垃圾分類(lèi)”政策的實(shí)施，推動(dòng)生活垃圾源頭減量化、資源化迫在眉睫[1]. 餐廚垃圾是城市生活垃圾的重要組成部分，富含糖類(lèi)、蛋白質(zhì)、脂肪等有機(jī)物及豐富的微量元素[2]，易腐敗酸化，產(chǎn)生滲濾液、惡臭氣體等二次污染[3]，因此餐廚垃圾就地快速資源化需求迫切.

目前餐廚垃圾資源化方式主要有減量脫水、好氧堆肥和液態(tài)肥制備等. 其中，通過(guò)接種功能微生物制備餐廚垃圾液態(tài)有機(jī)肥[4-5]，可實(shí)現(xiàn)餐廚垃圾高值化利用、土壤改良及碳匯，在改善土壤養(yǎng)分狀況的同時(shí)提高作物產(chǎn)量[6-8]. 任連海等[9]采用餐廚垃圾濕熱處理脫出液，通過(guò)接種巨大芽孢桿菌，制備解磷液態(tài)菌肥，活菌數(shù)遠(yuǎn)高于農(nóng)用微生物菌劑的標(biāo)準(zhǔn). 郭新愿等[10]用餐廚垃圾廢水作為發(fā)酵基質(zhì)生產(chǎn)液態(tài)褐球固氮菌肥，可提高土壤的總氮水平.

餐廚垃圾制備液態(tài)有機(jī)肥過(guò)程中，易降解有機(jī)物水解酸化與大分子物質(zhì)(蛋白質(zhì)、淀粉、脂肪等)降解轉(zhuǎn)化不同步[11]，是限制其高值化的關(guān)鍵限速步驟.筆者所在團(tuán)隊(duì)前期自主篩選了具有抗酸化功能的復(fù)合菌劑，發(fā)現(xiàn)該抗酸化復(fù)合菌劑可以有效抑制堆肥前期易降解有機(jī)物的快速礦化和小分子酸形成，在限制礦化的同時(shí)可實(shí)現(xiàn)好氧發(fā)酵體系的酸度調(diào)節(jié)[12-13].

米曲霉(Aspergillus oryzae)是目前真菌發(fā)酵產(chǎn)酶最重要的菌株之一，能通過(guò)固態(tài)發(fā)酵產(chǎn)生大量蛋白酶和淀粉酶，米曲霉的高蛋白質(zhì)、淀粉分解能力可有效降解轉(zhuǎn)化餐廚垃圾中的大分子物質(zhì)[14-15]. Pleissner等[16]通過(guò)添加泡盛曲霉和米曲霉，研究餐廚垃圾中大分子物質(zhì)的轉(zhuǎn)化，結(jié)果表明，處理48 h后餐廚垃圾中大分子物質(zhì)被降解為葡萄糖、游離氨基氮和磷酸鹽，淀粉轉(zhuǎn)化率為80%～90%. 張帥等[17]接種米曲霉孢子懸浮液至餐廚垃圾培養(yǎng)基中，產(chǎn)物的淀粉酶活性最高可達(dá)438.4 U/g. 汪剛慧等[18]發(fā)現(xiàn)，未接種米曲霉的餐廚垃圾只有極低的蛋白酶和淀粉酶活性，而經(jīng)過(guò)米曲霉發(fā)酵后餐廚垃圾中的蛋白酶和淀粉酶活性顯著上升，分別提升了73.37和24.52倍.

該研究將自主篩選的抗酸化復(fù)合菌劑和米曲霉聯(lián)用，旨在實(shí)現(xiàn)餐廚垃圾全量化過(guò)程中易降解有機(jī)質(zhì)與大分子物質(zhì)的同步轉(zhuǎn)化，制備富含氨基酸的液態(tài)有機(jī)肥. 通過(guò)不同溫度、初始pH、菌劑接種量的研究，結(jié)合高通量測(cè)序，闡明蛋白質(zhì)、淀粉等物質(zhì)的轉(zhuǎn)化規(guī)律，探究抗酸化復(fù)合菌劑和米曲霉協(xié)同降解餐廚垃圾的工藝條件，以期為實(shí)現(xiàn)餐廚垃圾高值化利用提供技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1餐廚垃圾

餐廚垃圾取自北京某大學(xué)食堂，分揀出餐廚垃圾中骨頭、塑料袋等雜質(zhì)，將剩余部分混合打漿，過(guò)20目(0.850 mm)篩，置于4 ℃冰箱備用[19]. 餐廚垃圾基本理化指標(biāo)：含水率為85.8%±2.0%，揮發(fā)性固體(VS)含量為16.54%±0.5%，pH為4.3±0.1，蛋白質(zhì)含量為(2.23±0.13) g/L(濕基)，淀粉含量為(28.32±1.0)g/(100 g)(濕基).

1.1.2微生物菌劑

抗酸化復(fù)合菌劑是筆者所在課題組從餐廚垃圾好氧發(fā)酵酸化階段分離篩選制備的復(fù)合菌劑[20]. 試驗(yàn)所用米曲霉CGMCC 3.442 7購(gòu)于中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心.

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1酶源制備

將平板培養(yǎng)的米曲霉收集至無(wú)菌瓶中，稀釋后置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆?，利用稀釋平板?jì)數(shù)法測(cè)得米曲霉CGMCC 3.443 7(簡(jiǎn)稱(chēng)“米曲霉C”)的孢子懸浮液濃度為85個(gè)/mL. 將1 mL孢子懸浮液接種到50 g餐廚垃圾中，38 ℃下培養(yǎng)48 h，獲得富酶產(chǎn)物.

1.2.2正交試驗(yàn)

餐廚垃圾采用正交試驗(yàn)研究不同處理?xiàng)l件對(duì)功能菌劑快速降解餐廚垃圾的影響. 選取不同溫度、初始pH、功能菌劑接種量設(shè)計(jì)三因素三水平正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1). 功能菌劑包括抗酸化復(fù)合菌劑和富酶產(chǎn)物兩部分，抗酸化復(fù)合菌劑接入量1%、10%、20%(V/V)分別對(duì)應(yīng)富酶產(chǎn)物添加量1%、10%、20%(m/V). 所有試驗(yàn)組和對(duì)照組均在相同條件下設(shè)計(jì)2組平行試驗(yàn).

表1 菌劑液態(tài)發(fā)酵條件試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental design of bacteria liquid fermentation conditions

取餐廚垃圾25 g，與去離子水按照質(zhì)量比1∶1混合均勻后，將初始pH分別調(diào)節(jié)至6.0、6.5、7.0，滅菌后分別接種等量的富酶產(chǎn)物和抗酸化復(fù)合菌劑，置于不同溫度、120 r/min下培養(yǎng)168 h，每隔24 h取樣測(cè)定指標(biāo).

1.3 分析指標(biāo)與方法

粗蛋白濃度根據(jù)GB/T 6432-2018《飼料中粗蛋白的測(cè)定 凱氏定氮法》測(cè)定；游離氨基酸濃度采用茚三酮比色法[21]測(cè)定；淀粉濃度采用酸水解法和蒽酮法[22]測(cè)定；溶解性碳水化合物濃度采用蒽酮法[23]測(cè)定. 采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行相關(guān)性分析.

微生物多樣性分析：取0.5 g抗酸化復(fù)合菌劑樣品，按照the E.Z.N.A.? soil DNA Kit(Omega Bio-tek，Norcross, GA, 美國(guó))步驟提取總RNA，在-20 ℃下進(jìn)行保存. 純化后的基因組作為聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)的模板，選用16S rRNA基因V3～V4區(qū)通過(guò)引物〔338F(5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3')和806R(5'-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3')〕進(jìn)行PCR反應(yīng). PCR反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 4 μL，dNTP (2.5 mmol/L) 2 μL，正向引物(5 μmol/L) 0.8 μL，反向引物(5 μmol/L) 0.8 μL，模板(總DNA) 10 ng. PCR產(chǎn)物用AxyPrepTMMag PCR Normalizer做歸一化處理.

選取A1B1C1(反應(yīng)溫度為38 ℃、初始pH=6.5、功能菌劑接種量1%的試驗(yàn)組記為E組)和A2B2C3(反應(yīng)溫度為55 ℃、初始pH=6.0、功能菌劑接種量20%的試驗(yàn)組記為F組)試驗(yàn)組在0、48、72、144 h的樣品進(jìn)行高通量測(cè)序，分別記為E0、E48、E72、E144和F0、F48、F72、F144.

2 結(jié)果與討論

2.1 pH的變化

餐廚垃圾中易降解有機(jī)質(zhì)被快速降解時(shí)，易造成小分子酸積累，導(dǎo)致pH下降，而餐廚垃圾發(fā)酵過(guò)程中pH的變化對(duì)于功能菌劑生長(zhǎng)繁殖有重要影響. 如圖1所示，各處理組的pH均高于4.5. 餐廚垃圾處理過(guò)程中，除處理組1外，其他組pH整體均呈先下降后趨于穩(wěn)定的趨勢(shì). 初始pH為7的處理組7、8、9的pH于24 h時(shí)分別降至5.16、5.42、5.17，pH降幅相對(duì)較大. 溫度為55 ℃的處理組2、6、7，pH于48 h后均低于5.0，且波動(dòng)不大，可能是因?yàn)楦邷夭贿m宜抗酸化復(fù)合菌劑生長(zhǎng)，小分子有機(jī)酸的降解受到抑制.處理組1在發(fā)酵至168 h時(shí)pH突升至7.98，可能是因?yàn)榫w自溶，核酸類(lèi)物質(zhì)外泄導(dǎo)致pH發(fā)生變化.處理組3、4、5、8、9在反應(yīng)120 h后pH為5.4～5.9，趨于一致. 這表明在中溫(38 ℃)條件下，抗酸化復(fù)合菌劑可以有效調(diào)控體系的pH波動(dòng)，初始pH對(duì)發(fā)酵過(guò)程中pH的影響不顯著.

圖1 正交試驗(yàn)中各試驗(yàn)組pH隨時(shí)間的變化情況Fig.1 Changes in pH over time for each experimental group in the orthogonal test

2.2 淀粉和溶解性碳水化合物的變化

功能菌劑協(xié)同降解餐廚垃圾過(guò)程中，餐廚垃圾中的淀粉會(huì)在微生物作用下轉(zhuǎn)化為易于土壤利用的溶解性碳水化合物，從而達(dá)到提高肥力的效果. 如圖2所示，各處理組中淀粉轉(zhuǎn)化率均高于30%. 其中，處理組3中淀粉濃度的降幅較大，為99.12%，溶解性碳水化合物濃度也達(dá)到了7.15 g/L. 因?yàn)槊浊狗置诘矸勖富畹妮^佳溫度為20～30 ℃，所以相同接種量的處理組6、9，淀粉轉(zhuǎn)化率分別為30.54%、52.55%，這可能是受溫度的影響. 在相同接種量條件下，20 ℃發(fā)酵的處理組3的淀粉轉(zhuǎn)化率高于38、55 ℃下的處理組6、9. 同樣地，20 ℃發(fā)酵下處理組4、8的淀粉轉(zhuǎn)化率分別略高于等接種量的處理組7、2、5. 處理組1淀粉轉(zhuǎn)化率為95.58%，可能是抗酸化復(fù)合菌劑中的芽孢桿菌在適宜條件下發(fā)揮了顯著的降解淀粉大分子的作用. 但處理組1溶解性碳水化合物濃度相較于反應(yīng)初始時(shí)刻僅提高了31%，這與微生物利用還原糖、多糖等物質(zhì)進(jìn)行自身生命活動(dòng)有關(guān). 此外，溶解性碳水化合物會(huì)參與腐殖質(zhì)形成的美拉德反應(yīng)[24]等過(guò)程，這也會(huì)導(dǎo)致其濃度降低[16].

圖2 不同處理對(duì)淀粉轉(zhuǎn)化率及溶解性碳水化合物濃度的影響Fig.2 Effect of different treatments on starch conversion rate and dissolved carbohydrate concentration

2.3 蛋白質(zhì)和游離氨基酸的變化

餐廚垃圾富含蛋白質(zhì)，可利用功能微生物將其降解為游離氨基酸，增加小分子可溶物質(zhì)的濃度. 功能菌劑協(xié)同降解餐廚垃圾過(guò)程中蛋白質(zhì)和游離氨基酸的變化情況見(jiàn)圖3. 結(jié)果表明，9個(gè)處理組中蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率均高于18%. 其中處理組2在55 ℃下蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率最高，為58.97%，有研究表明，55 ℃時(shí)米曲霉酶源產(chǎn)物中蛋白酶活性較高[18]，具有較高的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化能力. 相同溫度下處理組6、7的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率分別為48.29%和33.10%，這與處理組7的酶源產(chǎn)物接種量低于處理組6有關(guān). 接種量最少的處理組1、4、7的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率較低，其中處理組4最低，僅為18.01%.

圖3 不同處理對(duì)蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率及游離氨基酸濃度的影響Fig.3 Effect of different treatments on protein conversion rate and free amino acid concentration

游離氨基酸含量變化分析顯示，處理組1最高，且在反應(yīng)至144 h時(shí)達(dá)到最高值(4.09 g/L)，是處理組2的1.6倍，推測(cè)38 ℃、菌劑接種量為1%的條件有利于米曲霉生長(zhǎng)且蛋白酶穩(wěn)定性高，相比于其他條件更有利于蛋白質(zhì)降解和游離氨基酸的賦存. 處理組2、6、8的中游離氨基酸濃度較低，可能是因?yàn)榫鷦┙臃N量達(dá)到了10%、20%，液態(tài)發(fā)酵過(guò)程中微生物大量繁殖，各種生化反應(yīng)逐漸強(qiáng)烈，氨基酸作為營(yíng)養(yǎng)成分，在發(fā)酵后期逐漸被消耗，因而游離氨基酸濃度下降.

2.4 方差分析

由表2可見(jiàn)，菌劑接種量對(duì)溶解性碳水化合物及游離氨基酸濃度均有顯著影響(P＜0.05)，溫度僅對(duì)游離氨基酸濃度有顯著影響(P＜0.05)，初始pH對(duì)二者的影響均不顯著(P＞0.05).

表2 液相指標(biāo)方差分析Table 2 Analysis of variance

功能菌劑在餐廚垃圾的降解過(guò)程中起到主要作用，可有效促進(jìn)物質(zhì)轉(zhuǎn)化；溫度是微生物生長(zhǎng)與產(chǎn)酶的重要影響因子，直接影響酶活性和物質(zhì)降解效率.因此，影響餐廚垃圾降解的因素依次是菌劑接種量、溫度、初始pH.

2.5 功能菌劑協(xié)同降解餐廚垃圾過(guò)程中微生物群落組成與演替

餐廚垃圾降解反應(yīng)系統(tǒng)是一個(gè)相對(duì)復(fù)雜的體系，微生物作為主要功能因素，種類(lèi)繁多、數(shù)量巨大，環(huán)境因子的改變、復(fù)合菌劑的性質(zhì)等都會(huì)對(duì)微生物的生命活動(dòng)產(chǎn)生影響. 因此，要真正實(shí)現(xiàn)對(duì)餐廚垃圾降解工藝的優(yōu)化，提高處理能效，還需要對(duì)餐廚垃圾降解不同階段的微生物多樣性、群落結(jié)構(gòu)等方面進(jìn)行更加深入的研究，從而在微生物學(xué)的角度上揭示其降解機(jī)理.

2.5.1不同處理下微生物多樣性

所有樣品的覆蓋率均高于99.9%，表明測(cè)序深度足以真實(shí)反映樣品的微生物多樣性. 如表3所示，從Shannon-Wiener和Simpson指數(shù)來(lái)看，E組和F組在反應(yīng)過(guò)程中細(xì)菌群落多樣性均呈先降低后升高的趨勢(shì)，其中E組在反應(yīng)144 h時(shí)(E144)多樣性最高. 從ACE和Chao1指數(shù)來(lái)看，E組在反應(yīng)過(guò)程中細(xì)菌群落豐度逐漸降低，F(xiàn)組細(xì)菌群落豐度呈波動(dòng)趨勢(shì). 從Simpson指數(shù)來(lái)看，E組在反應(yīng)至72 h時(shí)(E72)真菌物種多樣性最高；從Chao指數(shù)來(lái)看，E組反應(yīng)至48 h時(shí)(E48)樣品中的真菌群落豐度最高，隨后逐漸降低(見(jiàn)表3).

表3 細(xì)菌及真菌豐富度和多樣性Table 3 Bacterial and fungal abundance and diversity

2.5.2不同處理下微生物群落組成

如圖4(a)所示，樣品在細(xì)菌門(mén)水平上的微生物主要有 Firmicutes和Proteobacteria，且所有樣品的Firmicutes相對(duì)豐度均在97.94%以上. Firmicutes和Proteobacteria可以降解底物中的物質(zhì)，如纖維素、蛋白質(zhì)、果膠等. 其中，F(xiàn)irmicutes由于其厚壁結(jié)構(gòu)、潛在的水解能力而在群落中占據(jù)主導(dǎo)地位[25].

如圖4(b)所示，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，E組Bacilli的相對(duì)豐度不斷升高，達(dá)到99.98%，表明Bacilli具有良好的適應(yīng)能力.Bacilli可以將大分子(如纖維素淀粉和蛋白質(zhì))降解為小分子[26]，有利于餐廚垃圾的發(fā)酵. F0樣品在屬水平上的微生物主要由Bacilli和Terribacillus組成，相對(duì)豐度分別為30.99%、68.50%，在其他處理時(shí)間上，F(xiàn)組在屬水平上的微生物主要由Bacilli組成，相對(duì)豐度趨于99%.

如圖4(c)所示，E組和F組在真菌門(mén)水平上的微生物主要有Ascomycota和Basidiomycota. Ascomycota和Basidiomycota的作用包括降解有機(jī)質(zhì)、產(chǎn)生有益代謝產(chǎn)物等，是生態(tài)系統(tǒng)中的重要分解者[27-29]. E48樣品中Ascomycota和Basidiomycota的相對(duì)豐度分別為41.07%、56.84%. 隨著試驗(yàn)進(jìn)行，E組中Ascomycota的相對(duì)豐度越來(lái)越高，在E144樣品中達(dá)到了97.35%.在F組中，F(xiàn)0樣品中Ascomycota的相對(duì)豐度為99.37%，隨著試驗(yàn)進(jìn)行，Ascomycota和Basidiomycota的相對(duì)豐度不斷波動(dòng)，F(xiàn)72樣品中二者分別為31.29%、65.83%.

如圖4(d)所示，從屬水平對(duì)真菌進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)各處理組的真菌相對(duì)豐度差異性較大，E48組中未鑒定出的傘菌為優(yōu)勢(shì)菌屬，E72、E144、F0樣品中優(yōu)勢(shì)真菌均為曲霉屬，相對(duì)豐度分別為82.73%、95.28%、97.34%. F組中，只有F0樣品中優(yōu)勢(shì)菌屬為曲霉屬，相對(duì)豐度達(dá)到97.34%；F48、F72、F144樣品中菌屬?gòu)?fù)雜，推測(cè)55 ℃不適合曲霉屬生長(zhǎng)，隨著試驗(yàn)進(jìn)行，曲霉屬不再是優(yōu)勢(shì)菌屬，其他各類(lèi)菌屬大量繁殖.

圖4 不同處理下微生物群落的變化Fig.4 Changes in microbial communities under different treatments

2.5.3相關(guān)性分析

選擇溫度、初始pH、菌劑接種量、氨基酸、溶解性碳水化合物等與微生物相對(duì)豐度做Pearson相關(guān)性分析. 由圖5可見(jiàn)，在環(huán)境因子與微生物群落之間的關(guān)系中，溫度、初始pH、菌劑接種量與優(yōu)勢(shì)微生物相對(duì)豐度存在顯著的正或負(fù)相關(guān)關(guān)系，且溫度、菌劑接種量與微生物相對(duì)豐度之間呈現(xiàn)一致的相關(guān)性.

圖5 環(huán)境因子與微生物群落的響應(yīng)關(guān)系Fig.5 Responses between environmental factors and microbial communities

由圖5可見(jiàn)，Bacillus、Aspergillus的相對(duì)豐度與游離氨基酸濃度之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性.Bacillus可通過(guò)分泌的蛋白酶、肽酶等將蛋白質(zhì)分解為游離氨基酸，Bacillus相對(duì)豐度與游離氨基酸濃度之間的相關(guān)系數(shù)為0.452 4，降解過(guò)程中Bacillus對(duì)游離氨基酸濃度的升高有著重要作用. 有學(xué)者[30]發(fā)現(xiàn)，Aspergillus在黃酒發(fā)酵中具有較強(qiáng)的產(chǎn)酶能力，生成的蛋白酶會(huì)將蛋白質(zhì)分解形成氨基酸.Bradyrhizobium是氮代謝的“樞紐”，是一種反硝化細(xì)菌，在生長(zhǎng)過(guò)程中會(huì)利用消耗游離氨基酸[31]，所以二者相關(guān)系數(shù)小于-0.5.

除Bacillus與Aspergillus外，溶解性碳水化合物含量與其他菌屬相對(duì)豐度均呈正相關(guān)，其中與Agaricales、Cladosporium、Vibrio三種菌屬相對(duì)豐度的相關(guān)性較為顯著.Agaricales隸屬于Basidiomycota，能產(chǎn)生降解木質(zhì)纖維素相關(guān)的碳水化合物活性酶和氧化還原酶，有研究[32]證明，Agaricales相關(guān)真菌都具有一定降解纖維素的潛力.Cladosporium可分泌內(nèi)切葡聚糖酶[33]，對(duì)餐廚垃圾中蔬菜莖葉、果皮等具有較強(qiáng)的降解能力.Vibrio能產(chǎn)生葡萄糖苷酶、糖化酶，促進(jìn)淀粉降解為葡萄糖等小分子碳水化合物[34].

3 結(jié)論

a) 溫度為38 ℃、初始pH為6.5條件下，抗酸化菌劑與米曲霉酶源產(chǎn)物等比例接種1%時(shí)，好氧發(fā)酵制備的液態(tài)有機(jī)肥游離氨基酸賦存最佳，淀粉和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化率分別達(dá)到94.49%和32.52%.

b) 微生物群落演替與代謝轉(zhuǎn)化的相關(guān)分析表明，Bacillus和Aspergillus作為發(fā)酵過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌屬，其相對(duì)豐度與游離氨基酸濃度之間具有較強(qiáng)的相關(guān)性，有效促進(jìn)了蛋白質(zhì)向游離氨基酸的轉(zhuǎn)化.Agaricales、Cladosporium、Vibrio在淀粉的降解和溶解性碳水化合物的賦存中起到重要作用.

c) 抗酸化菌劑和米曲霉酶源產(chǎn)物協(xié)同降解餐廚垃圾，制備富含氨基酸的液態(tài)有機(jī)肥，可用于土壤和作物改良，具有重要的應(yīng)用價(jià)值.