加工辣椒無損品質(zhì)檢測(cè)方法及典型相關(guān)性分析

鞏雪峰， 陳 鑫， 李 紅， 許 藝， 宋占鋒

(四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院園藝研究所/蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部西南地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川成都 610066)

加工專用型辣椒選育是近年來我國各大辣椒產(chǎn)區(qū)育種者的重要育種目標(biāo)。在加工辣椒品種的選育過程中，研究者除了考慮植株產(chǎn)量、穩(wěn)產(chǎn)性、抗性等性狀外，辣椒果實(shí)的加工品質(zhì)性狀也是衡量品種優(yōu)劣的重要指標(biāo)內(nèi)容。通常對(duì)加工辣椒品質(zhì)性狀指標(biāo)的研究主要集中在色澤、營養(yǎng)、風(fēng)味、質(zhì)地這4個(gè)影響指標(biāo)上。其中，辣椒紅素色價(jià)用于對(duì)色澤品質(zhì)的評(píng)價(jià)，辣椒素含量用于對(duì)風(fēng)味品質(zhì)的評(píng)價(jià)，粗脂肪含量(或油分)等用于對(duì)營養(yǎng)品質(zhì)的評(píng)價(jià)，粗纖維含量等用于對(duì)質(zhì)地品質(zhì)的評(píng)價(jià)。目前，對(duì)色價(jià)、辣椒素、粗脂肪及粗纖維含量等性狀的檢測(cè)通常是運(yùn)用植物生理、生化學(xué)方法，通過研磨、勻漿、離心、旋蒸、生化反應(yīng)或抽提等精細(xì)的樣品前處理，并借助液相色譜、紫外分光光度計(jì)等大型儀器分析而獲得。通過傳統(tǒng)的理化品質(zhì)性狀分析方法所得檢測(cè)值具有精度高、數(shù)據(jù)穩(wěn)定的優(yōu)點(diǎn)，但是操作流程繁瑣，測(cè)量時(shí)間長(zhǎng)，獲得數(shù)據(jù)結(jié)果周期性大，試劑耗材價(jià)格昂貴，而且當(dāng)同期辣椒雜交組合增多、果實(shí)樣品存放不得當(dāng)或前處理不及時(shí)時(shí)，測(cè)量過程中會(huì)導(dǎo)致果實(shí)樣本理化活性降低，樣本之間誤差系數(shù)增大的情況出現(xiàn)，極大影響了對(duì)品質(zhì)性狀篩選的準(zhǔn)確性，非常不利于加工辣椒品種選育工作。因此，建立一套快速、高效的無損品質(zhì)檢測(cè)體系，且能夠替代經(jīng)典傳統(tǒng)理化品質(zhì)性狀的檢測(cè)方法，將有助于加速加工辣椒的品種選育進(jìn)程。

無損檢測(cè)技術(shù)是利用聲、光、電、力等相關(guān)物理學(xué)特性，在果蔬等樣品的理化性質(zhì)為非破損狀態(tài)下，通過對(duì)其內(nèi)外部信息掃描獲取與分析評(píng)價(jià)的技術(shù)。本研究將無損檢測(cè)技術(shù)的近紅外光譜與色差技術(shù)引入了加工辣椒的果實(shí)品質(zhì)性狀分析中。有關(guān)近紅外光譜(near infrared reflectance spectrum，簡(jiǎn)稱NIRS)技術(shù)應(yīng)用，目前在糧油、飼料等農(nóng)業(yè)領(lǐng)域已有一系列現(xiàn)行國家與國際NIRS定量檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)體系，包括了對(duì)水分、蛋白質(zhì)、脂肪含量等品質(zhì)指標(biāo)的標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)。近年來，雖然近紅外光譜技術(shù)用于檢測(cè)蔬菜品質(zhì)的研究報(bào)道也越來越多，但并未形成相對(duì)成熟的體系。辣椒已發(fā)展為全國第一大蔬菜作物，有關(guān)辣椒近紅外光譜檢測(cè)的前沿報(bào)道也相對(duì)較多，包括辣椒素、可溶固形物、維生素C含量等果實(shí)品質(zhì)性狀，但是對(duì)粗脂肪和纖維素含量的分析鮮有報(bào)道；色差技術(shù)是基于色差原理，運(yùn)用光學(xué)設(shè)計(jì)和信號(hào)處理技術(shù)，通過應(yīng)用色差儀(即分光測(cè)色儀)來模擬人眼的視覺系統(tǒng)進(jìn)行色彩測(cè)量，使顏色數(shù)量化的一種分析方法。有關(guān)色差技術(shù)的應(yīng)用，包括研究者運(yùn)用色差儀對(duì)桑白皮、黃芩等中藥材顏色與有效成分進(jìn)行相關(guān)性分析。研究者還通過色差儀對(duì)黃瓜、甜瓜、辣椒等果皮顏色進(jìn)行了遺傳學(xué)及其他關(guān)聯(lián)分析。但是，將色差儀應(yīng)用于辣椒品質(zhì)檢測(cè)的研究鮮有報(bào)道。

本研究通過建立辣椒果實(shí)的辣椒素、粗纖維和粗脂肪的近紅外定標(biāo)模型，通過分析色差與色價(jià)的相關(guān)性，并運(yùn)用典型相關(guān)性統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，研究辣椒無損品質(zhì)變量組與理化性狀變量組之間的相關(guān)關(guān)系，討論辣椒果實(shí)品質(zhì)性狀無損檢測(cè)方法的快速、高效檢測(cè)的可行性。本研究旨在建立準(zhǔn)確、高效、體系化的辣椒無損品質(zhì)性狀檢測(cè)方法，以期為加工辣椒品質(zhì)篩選提供科學(xué)有效的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)于2020年1月至8月在四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院新都試驗(yàn)基地進(jìn)行。供試?yán)苯凡牧蠟?23份加工型雜交組合材料，于1月在連棟大棚內(nèi)進(jìn)行穴盤播種，4月露地定植，8月進(jìn)行采收。采收時(shí)每份供試樣品選取20株生長(zhǎng)一致的辣椒，采摘每株結(jié)果主枝的第4～6節(jié)位的果實(shí)，每份供試樣品采收500 g果實(shí)鮮樣，鮮樣采收后迅速置于泡沫冰盒內(nèi)冷藏保鮮。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 備樣 從基地采收至實(shí)驗(yàn)室的123份辣椒果實(shí)鮮樣按順序裝入牛皮紙袋，于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量，用粉碎機(jī)粉碎后過40目篩，最終獲得粉末狀干樣保存在塑封袋內(nèi)，冷藏于4 ℃冰箱待測(cè)。123份待測(cè)干樣品將用于色價(jià)、辣椒素、粗纖維、粗脂肪含量的理化性狀測(cè)定及無損品質(zhì)性狀分析。

1.2.2 理化性狀測(cè)定項(xiàng)目與方法 辣椒素含量采用NY/T 1381—2007《辣椒素的測(cè)定 高效液相色譜法》的方法測(cè)定。稱取0.2 g待測(cè)干樣并精確到0.000 1 g，向稱取的樣品中加入25 mL甲醇-四氫呋喃溶液，在60 ℃水浴條件下，用超聲波提取器提取30 min，過濾，收集濾液，將濾渣連同濾紙重新用25 mL甲醇-四氫呋喃溶液經(jīng)超聲提取器提取 10 min 后，再重復(fù)1次。將3次過濾收集的濾液合并，在70～75 ℃恒溫水浴下濃縮至30 mL左右，轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，用甲醇-四氫呋喃溶液定容，經(jīng)0.45 μm有機(jī)相濾膜過濾后進(jìn)行色譜分析。色譜條件：色譜柱，C150 mm×4.6 mm，粒徑5 μm；流動(dòng)相為甲醇 ∶水=4 ∶1(體積比)，用前過0.45 μm濾膜，脫氣；流速為0.6 mL/min；熒光檢測(cè)器的激發(fā)波長(zhǎng)為229 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為320 nm；進(jìn)樣量為10 μL。

式中：為試樣中辣椒素的峰面積積分值；為標(biāo)準(zhǔn)工作液中辣椒素的峰面積積分值；為標(biāo)準(zhǔn)工作液中辣椒素的質(zhì)量濃度，mg/L；為試樣最終定容體積，mL；為試樣質(zhì)量，g。

粗脂肪含量采用索氏抽提法測(cè)定。稱取2.0 g待測(cè)干樣并精確到0.000 1 g，用濾紙包好，在 105 ℃ 烘箱中干燥3 h取出，在干燥器中冷卻，稱質(zhì)量()。將樣包裝入索氏脂肪抽提器抽提筒中，再倒入無水乙醚，完全浸泡樣包，連接好索氏抽提器各部分，浸泡至少16 h。將浸泡后的樣包放入抽提瓶中，在抽提瓶中放入幾粒沸石，然后，往抽提瓶中倒入無水乙醚使之完全浸泡樣包，連接好儀器各部分，接通冷凝水，在70～80 ℃水浴上加熱，使乙醚回流，控制乙醚回流次數(shù)為8 次/h，即乙醚回滴速度為120～150 滴/min，抽提6 h。抽提完畢，取出樣包，置樣包于通風(fēng)處使乙醚揮發(fā)。將樣包放入105 ℃烘箱中干燥2 h，取出，在干燥器中冷卻，稱質(zhì)量()。

式中：為第1次烘干的質(zhì)量，g；為第2次烘干的質(zhì)量，g；為稱取試樣的質(zhì)量，g。

粗纖維含量采用GB/T 5009.10—2003《植物類食品中粗纖維的測(cè)定》方法測(cè)定。稱取5.0 g待測(cè)干樣，移入500 mL錐形瓶中，加入200 mL煮沸的1.25%硫酸，加熱使其微沸，保持體積恒定，持續(xù) 30 min，定時(shí)晃動(dòng)錐形瓶，使瓶?jī)?nèi)物質(zhì)混合充分；取下錐形瓶，迅速用亞麻布過濾，用沸水洗滌至洗液呈酸性；再用200 mL，煮沸的1.25%氫氧化鉀溶液，將亞麻布上的存留物洗入原錐形瓶?jī)?nèi)加熱至沸騰后持續(xù)30 min，取下錐形瓶，立即以亞麻布過濾，以沸水洗滌2 ～3次后，移入已干燥稱質(zhì)量的G2垂融坩堝或同型號(hào)的垂融漏斗中，抽濾，用熱水充分洗滌后抽干。再依次用乙醇和乙醚洗滌1次。將坩堝和內(nèi)容物在105 ℃烘箱中烘干后稱量，重復(fù)操作，至恒質(zhì)量。

式中：為殘余物的質(zhì)量，g；為樣品質(zhì)量，g。

辣椒紅素色價(jià)采用國標(biāo)GB 1886.34—2015《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品添加劑 辣椒紅》的方法測(cè)定。稱取0.1 g 待測(cè)干樣并精確到0.000 1 g，用無水乙醇取代丙酮浸提樣品中的辣椒紅素。將浸提液按序點(diǎn)樣在96孔酶標(biāo)板上，用多功能酶標(biāo)儀(賽默飛世爾Multiskan GO)在460 nm處讀取吸光度值，96孔板的通徑長(zhǎng)度為0.58 cm。

式中：為460 nm處樣本的吸光度；為稀釋倍數(shù)；為樣本稱量質(zhì)量；為96孔酶標(biāo)板的通徑長(zhǎng)度。

以上所有理化性狀測(cè)定項(xiàng)目的各樣品均做重復(fù)3次，結(jié)果為3次試驗(yàn)的均值。

1.2.3 無損品質(zhì)性狀檢測(cè)的方法 近紅外光譜檢測(cè)采用福斯(FOSS)NIRS DS2500 型近紅外光譜儀，光譜區(qū)范圍為400～2 500 nm，光譜分辨率為 0.5 nm，測(cè)量方式為漫反射。

光譜采集：將123份供試樣品的待測(cè)干樣20 g按序逐一裝入樣品杯中，用壓塊壓實(shí)進(jìn)行掃描。每個(gè)樣品測(cè)定2次，第1次測(cè)定后的干樣與原待測(cè)樣品混勻后，再取樣20 g進(jìn)行第2次測(cè)定，獲取光譜。掃描獲得所有樣品的近紅外光譜。

建立定標(biāo)模型：123份樣品的理化性狀測(cè)定值結(jié)合所對(duì)應(yīng)近紅外光譜，通過WinISI定標(biāo)軟件系統(tǒng)進(jìn)行建模。用WinISI將全部樣品材料隨機(jī)分為建模集和驗(yàn)證集2個(gè)部分，建模集用于建立定標(biāo)方程和模型的內(nèi)部交叉檢驗(yàn)，驗(yàn)證集用于模型的外部驗(yàn)證。對(duì)建模集進(jìn)行計(jì)算得分，剔除馬氏距離(GlobalH，簡(jiǎn)稱GH)大于3的特異樣本，獲得定標(biāo)集。用定標(biāo)集建立定標(biāo)方程，用標(biāo)準(zhǔn)正常化處理+去偏異技術(shù)(SNV+Detrend)進(jìn)行散射校正，用改進(jìn)式偏最小二乘(modifiedpartial least square，簡(jiǎn)稱MPLS)回歸方法分析定標(biāo)樣本，通過定標(biāo)建立預(yù)測(cè)模型。

1.2.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析 每個(gè)檢測(cè)指標(biāo)重復(fù)測(cè)定3次取平均值。利用Microsoft Excel 2016進(jìn)行數(shù)據(jù)圖表處理；用SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)的Kolmogorov-Smirnov檢驗(yàn)(KS-檢驗(yàn))、正態(tài)分布、回歸分析、相關(guān)性關(guān)系及典型相關(guān)性分析等數(shù)理統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 辣椒果實(shí)理化性狀結(jié)果分析

測(cè)得123份供試樣品理生化性狀數(shù)據(jù)結(jié)果見表1，可以看出辣椒素、粗脂肪、粗纖維含量和色價(jià)的變幅和極差都較大，基本包含了加工型辣椒育種研究的各品質(zhì)性狀的變幅范圍。供試樣品4個(gè)理化性狀的KS-檢驗(yàn)分析表明辣椒素、粗脂肪、粗纖維含量和色價(jià)的漸進(jìn)顯著性(雙側(cè))分別為0.398、0.681、0.113、0.998，均大于0，說明4個(gè)理化性狀指標(biāo)服從正態(tài)分布。由圖1可知，供試樣品辣椒素含量、粗脂肪含量、粗纖維含量和色價(jià)值符合正態(tài)分布情況，進(jìn)一步說明選擇供試樣品的理化性狀辣椒素、粗脂肪和粗纖維含量符合近紅外光譜建模要求。

表1 辣椒果實(shí)樣品生理生化性狀統(tǒng)計(jì)

2.2 辣椒素、粗脂肪和粗纖維含量的無損 NIRS模型建立與預(yù)測(cè)效果分析

2.2.1 辣椒果實(shí)樣本近紅外光譜特征 對(duì)123份辣椒供試樣品分別進(jìn)行光譜掃描，獲得近紅外光譜見圖2。辣椒樣品在全波長(zhǎng)850～2 500 nm范圍內(nèi)，包含了多個(gè)光譜吸收峰；不同辣椒樣品由于對(duì)近紅外光吸收特征的不同，所表現(xiàn)出的光譜圖是有所差異的，說明辣椒供試樣品間成分及含量的差異。

2.2.2 NIRS數(shù)學(xué)模型的內(nèi)部交叉檢驗(yàn) 根據(jù)已經(jīng)測(cè)定的辣椒素、粗脂肪、粗纖維含量結(jié)合各辣椒供試樣品相對(duì)應(yīng)的近紅外光譜分別擬合數(shù)學(xué)模型。通過操作WinISI軟件，按照建模集與驗(yàn)證集3 ∶1的比例，將外部驗(yàn)證的驗(yàn)證集光譜個(gè)數(shù)設(shè)為30，其他樣本作為建模集并通過計(jì)算得分剔除特異樣本，最終用于定標(biāo)集定標(biāo)的光譜樣本數(shù)量見表2。辣椒素、粗脂肪和粗纖維含量均具有較高的定標(biāo)決定系數(shù)(RSQ)和交叉驗(yàn)證決定系數(shù)(1-VR)，同時(shí)，交叉驗(yàn)證誤差(SECV)和校正標(biāo)準(zhǔn)偏差(SEC)均較低，其中粗脂肪的RSQ和1-VR最高，分別是0.983 5和0.980 0；SECV和SEC分別為0.128 3和0.111 8。盡管辣椒素含量的各決定系數(shù)較之最低，但是其RSQ和1-VR(分別是0.839 3和0.752 2)及SECV和SEC(分別為0.078 1和0.064 5)接近化學(xué)分析的精確度。說明所建模型各項(xiàng)決定系數(shù)和標(biāo)準(zhǔn)誤差可以滿足辣椒樣品辣椒素、粗脂肪和粗纖維含量分析，均達(dá)到了預(yù)期效果。

表2 辣椒粗脂肪、粗纖維和辣椒素含量的定標(biāo)、交叉驗(yàn)證結(jié)果

2.2.3 定標(biāo)模型對(duì)品質(zhì)性狀預(yù)測(cè)效果分析 對(duì)建立的定標(biāo)模型的實(shí)際預(yù)測(cè)效果進(jìn)行外部驗(yàn)證，如圖3所示，辣椒素、粗脂肪和粗纖維含量預(yù)測(cè)值與理化性狀值的回歸分析中，決定系數(shù)均大于0.8，結(jié)果表明，預(yù)測(cè)值與3個(gè)理化性狀值都比較接近，變量與自變量之間具有較好的線性關(guān)系。

2.3 色差分析及色差與色價(jià)的相關(guān)性分析

表3 辣椒果實(shí)樣品色差度測(cè)定結(jié)果

表4 辣椒果實(shí)色價(jià)與色度相關(guān)性關(guān)系分析結(jié)果

2.4 辣椒無損品質(zhì)與理化性狀的典型相關(guān)性分析

表5 生理生化指標(biāo)與品質(zhì)性狀的典型相關(guān)性分析

理化性狀為第1組變量，無損品質(zhì)性狀為第2組變量，二者之間計(jì)算共得4組相關(guān)系數(shù)，4組相關(guān)系數(shù)均達(dá)到極顯著水平(<0.01)。第1典型相關(guān)系數(shù)為0.973，第2、3、4典型相關(guān)系數(shù)分別為0.954、0.750、0.719。其中，第1典型相關(guān)系數(shù)均大于各自的簡(jiǎn)單相關(guān)分析的相關(guān)系數(shù)。中脂肪含量()和粗纖維含量()的系數(shù)絕對(duì)值明顯大于其他2個(gè)理化性狀系數(shù)，對(duì)應(yīng)中，粗脂肪近紅外NIRS值()和粗纖維近紅外NIRS值()的系數(shù)絕對(duì)值也明顯大于其他2個(gè)品質(zhì)性狀，說明第1對(duì)典型相關(guān)主要由、和、這2組變量相關(guān)引起的。

3 討論與結(jié)論

本研究運(yùn)用近紅外光譜分析技術(shù)建立了辣椒果實(shí)樣品的辣椒素、粗脂肪和粗纖維含量的近紅外定標(biāo)預(yù)測(cè)模型。粗脂肪、粗纖維含量模型的定標(biāo)決定系數(shù)和交互驗(yàn)證決定系數(shù)均大于0.98，外部驗(yàn)證決定系數(shù)(分別為0.937、0.967)也均大于0.9，是具有較高的穩(wěn)定性和準(zhǔn)確度的。李沿飛等分別建立了干椒辣度和鮮椒辣椒素的近紅外最優(yōu)定標(biāo)模型，近紅外模型的定標(biāo)集和外部預(yù)測(cè)決定系數(shù)在0.8以上，本研究辣椒素預(yù)測(cè)模型的定標(biāo)決定系數(shù)、交互驗(yàn)證決定系數(shù)及外部預(yù)測(cè)決定系數(shù)均在0.8以上，與前人研究結(jié)果基本一致，說明該辣椒素定標(biāo)預(yù)測(cè)模型的可用于實(shí)際預(yù)測(cè)。另外，在飼草、油料學(xué)科中Williams等在評(píng)價(jià)近紅外光譜定標(biāo)預(yù)測(cè)模型時(shí)，用相對(duì)分析誤差值對(duì)模型進(jìn)行評(píng)價(jià)，其中，交互驗(yàn)證集相對(duì)分析誤差=樣品集標(biāo)準(zhǔn)差/定標(biāo)集標(biāo)準(zhǔn)偏差；驗(yàn)證集相對(duì)分析誤差=樣品標(biāo)準(zhǔn)差/驗(yàn)證集標(biāo)準(zhǔn)誤差，當(dāng)2個(gè)相對(duì)分析誤差≥3.0 時(shí)，則能夠精確預(yù)測(cè)相關(guān)成分含量。本研究獲得的辣椒素、粗脂肪和粗纖維含量定標(biāo)預(yù)測(cè)模型的交互驗(yàn)證集相對(duì)分析誤差和驗(yàn)證集相對(duì)分析誤差均在3.0以上。結(jié)果表明，運(yùn)用無損近紅外光譜技術(shù)對(duì)辣椒果實(shí)樣品的辣椒素、粗脂肪和粗纖維含量檢測(cè)具有穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性、可行性，可以實(shí)現(xiàn)辣椒素、粗脂肪、粗纖維含量的高效檢測(cè)。

本研究為建立加工辣椒無損品質(zhì)性狀檢測(cè)方法的體系化提供了數(shù)據(jù)支撐。研究初步建立了可以實(shí)現(xiàn)用簡(jiǎn)單、快速、易測(cè)且樣品使用量不大的體系化方法，對(duì)加工辣椒品質(zhì)育種的快速可靠篩選，這對(duì)加工辣椒選育實(shí)踐具有重大的意義。