丁祥青， 胡敏杰， 向 雙， 賴興凱， 樂易迅， 劉仲健， 鄒雙全

(1.福建農(nóng)林大學園林學院，福建福州，350002； 2.福建師范大學地理科學學院，福建福州 350007；3.福建農(nóng)林大學林學院，福建福州 350002； 4.泉州灣河口濕地自然保護區(qū)管理處，福建泉州 362000)

WRKY 轉錄因子是植物中所特有的基因家族，也是植物中最大的轉錄因子家族之一，在植物生長發(fā)育、抵御生物脅迫和非生物脅迫中起著至關重要的作用。在結構方面，WRKY轉錄因子的結構域有一段約60個氨基酸構成的高度保守的區(qū)域。所有已知的WRKY蛋白都含有1個或2個WRKY結構域。根據(jù)WRKY 結構域的數(shù)量和鋅指結構的特征可對WRKY蛋白進行分類：含有2個WRKY結構域的WRKY蛋白屬于Ⅰ組，含有1個WRKY結構域且鋅指結構為CH(CCHH)的蛋白屬于Ⅱ組，而含有1個WRKY結構域且鋅指結構為CHC(CCHC)的蛋白屬于Ⅲ組。在功能方面，WRKY結構域與目標基因的啟動子中的W-box 順式作用元件[共有序列：(T)(T)TGAC(C/T)]結合將會對調控有積極或消極的作用。研究表明，非生物脅迫會誘導某些WRKY轉錄因子的大量表達，從而提高植物對非生物脅迫的耐受性。如的過度表達不僅增強了水稻的抗病性還提高了耐鹽性和耐旱性；或的過表達會增加擬南芥的耐鹽性；大豆可以抑制基因的表達，并通過正向調控介導途徑，實現(xiàn)對鹽脅迫的響應；番茄基因能夠正調控抗逆性相關基因，顯著增強番茄的耐鹽性。

秋茄()隸屬紅樹科(Rhizophoraceae)秋茄屬()，屬于典型的非泌鹽紅樹植物，是我國境內天然分布最廣和紅樹林重建和修復的主要造林樹種。秋茄多生長在淺海和河流入?？跊_積形成的鹽灘上，生長環(huán)境惡劣，生存壓力使其不斷進化以提高其抗逆境能力。秋茄是紅樹植物中最耐寒的樹種，也是紅樹植物中抗逆性最好的樹種之一，蘊含著豐富的抗逆基因資源。秋茄是否有其特殊的耐鹽與抗逆機制，基因家族如何發(fā)揮重要作用尚不清楚。盡管基因家族已經(jīng)在許多植物中被廣泛的研究，然而到目前為止，沒有秋茄基因結構和功能方面的研究報道。本研究應用生物信息學方法挖掘秋茄全基因組WKRY轉錄因子并對其進行分析，以期為秋茄潛在功能研究奠定基礎，為解析基因在秋茄特殊的耐鹽與抗逆機制中的作用提供參考。

1 材料與方法

1.1 KcWRKY轉錄因子的鑒定

秋茄基因組由筆者所在課題組測序所得。在Pfam 數(shù)據(jù)庫(http：//pfam.xfam.org/)中下載WRKY 轉錄因子家族的隱馬爾科夫模型(PF03106)。利用HMMER 3.0軟件(http：//www.hmmer.org)的hmmsearch 命令和結構域模型對秋茄基因組pep文件進行搜索，從搜索結果中篩選基因結構域E-value<0.001的基因共71個，將這初步鑒定的秋茄WRKY 轉錄因子家族成員提交NCBI上的Batch CD-Search (https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)網(wǎng)站進行結構域分析，確認WRKY結構域準確后，所得基因即為后續(xù)要分析的秋茄WRKY轉錄因子家族成員。將它們重新命名為～。

1.2 基本特征分析

利用Expasy(https：//web.expasy.org/compute_pi/)網(wǎng)站預測家族成員的等電點、相對分子質量、氨基酸長度等性質；通過http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2/網(wǎng)絡預測家族成員在細胞中的位置分布；通過SignalP(http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)預測信號肽。

1.3 KcWRKY基因家族成員多序列對比和系統(tǒng)發(fā)育分析

從TAIR(http：//www.arabidopsis.org/)網(wǎng)站下載擬南芥WRKY蛋白序列，利用 MEGA 7 軟件采用clustalW方法對擬南芥和秋茄的基因家族成員進行多序列比對分析，比對過程選擇默認參數(shù)，并通過保守序列構建系統(tǒng)發(fā)育樹，采用遺傳距離算法中的鄰接法(neighbor-joining，NJ)算法，校驗參數(shù)Bootstrap設置為重復1 000次。得到系統(tǒng)進化樹后，再利用 Figtree 軟件對聚類后的進化樹進行修飾和標注。

1.4 KcWRKY蛋白保守基序、基因結構和染色體定位分析

使用MEME(http：//meme-suite.org/tools/meme)對71個秋茄WRKY蛋白進行保守基序預測，允許保守結構域重復出現(xiàn)，保守性基序的數(shù)量限制為10，分別命名為基序1～基序10。利用 Tbtools工具繪制KcWRKY蛋白保守基序、基因結構和基因染色體定位圖。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡和啟動子順式作用元件分析

將秋茄WRKY蛋白作為研究對象，選定模式植物擬南芥作為物種參數(shù)，在 STRING( https：//www.string-db.org/) 網(wǎng)站進行蛋白互作網(wǎng)絡分析。

提取基因蛋白質編碼區(qū)(CDS)序列上游 2 000 bp 區(qū)段，提交到PlantCare網(wǎng)站進行順式作用元件預測(http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)，篩選其中的激素響應元件、抗逆元件進行分析，Tbtools工具繪圖。

1.6 KcWRKY基因的表達模式分析

利用轉錄組測序獲得秋茄不同部位包括花、莖、葉、果實以及果實不同發(fā)育時期的表達量數(shù)據(jù)，利用 Tbtools 工具繪制表達熱圖。

2 結果與分析

2.1 KcWRKY轉錄因子的鑒定

在秋茄基因組數(shù)據(jù)中共鑒定出71個基因，重新命名為～(表1)。KcWRKY蛋白氨基酸長度范圍為61()～726()aa，分子量范圍為7.05()～78.60()ku，等電點范圍為4.46()～10.26()，除了定位于細胞核和細胞質，其余70個KcWRKY轉錄因子均定位于細胞核。所有基因均無信號肽產(chǎn)生。

表1 KcWRKY轉錄因子理化性質分析

表1(續(xù))

表1(續(xù))

2.2 KcWRKY轉錄因子保守結構域分析

利用ClustalW對KcWRKY蛋白進行保守結構域分析，同時根據(jù)WRKY 結構域的數(shù)量和鋅指結構的特征對WRKY蛋白進行分類(圖1)。在Ⅰ組蛋白的保守序列中，除了(Ⅰ組中靠近C端的結構域)含有WRKYGEK和含有WRK七肽缺失序列外其余基因均為保守的WRKYGQK型的七肽；除鋅指結構變異為HXN和缺失鋅指結構外，其余均為CH型。此外，Ⅰ組中的只有1個WRKY結構域，在擬南芥中也出現(xiàn)過類似情況，但是在擬南芥中出現(xiàn)的是N端WRKY結構域缺失而秋茄中缺失出現(xiàn)在C端。在Ⅱ組蛋白的保守序列中，除了和結構域中的七肽部分缺失，的七肽序列是WRKYGKK外，其余基因均為保守的WRKYGQK型的七肽；鋅指結構除了、、缺失和缺失HNH外，其余均為保守的 CH型。Ⅲ組蛋白均含有典型的WRKYGQK七肽和CHC型鋅指結構?？傮w上秋茄WRKY成員的WRKYGQK七肽和鋅指結構都很保守，少量成員結構域變異的原因可能是在進化過程中基因突變所導致的。由于七肽序列和鋅指基序都是WRKYTFs與W-box的高結合親和力所必需的，它們的缺失可能會導致其功能的喪失。

2.3 KcWRKY轉錄因子系統(tǒng)進化分析

通過對擬南芥基因()和秋茄()基因結構域進行多序列比對，構建了它們共同的系統(tǒng)發(fā)育樹(圖2)。根據(jù)擬南芥基因的劃分情況將進化樹分為三大類，Ⅰ組包含19個基因，Ⅱ組包含45個基因(其中Ⅱa 2個、Ⅱb 7個、Ⅱc 18個、Ⅱd 10個、Ⅱe 8個)，Ⅲ組包含7個基因。由進化樹可以看出，秋茄和擬南芥的基因在各個分支中均勻分布，表明他們具有相似的進化方式；N 端和 C 端 WRKY 結構域聚集在不同的進化枝中，這可能反映了2個結構域的平行進化；Ⅱa和Ⅱb蛋白屬于同一分支、Ⅱd和Ⅱe蛋白屬于同一分支，表明它們之間的進化關系較近。

2.4 KcWRKY轉錄因子保守基序和基因結構分析

通過對基因的保守基序進行分析(圖3、圖4)發(fā)現(xiàn)同組的家族基因的基序比較一致，而組間存在一定的差異性，表明秋茄基因家族的分類是可靠的。10個保守基序(motif)的序列長度在21～50 bp之間，所有成員幾乎都具有保守基序1，表明保守基序1是基因家族的核心保守基序。由圖3可知，保守基序1和保守基序3屬于WRKY保守七肽；保守基序2和保守基序4屬于鋅指結構。保守基序1和保守基序2在Ⅰ組 C端、Ⅱ組和Ⅲ組中都有出現(xiàn)，唯獨Ⅰ組 N 端沒有，而保守基序3和保守基序4只出現(xiàn)在Ⅰ組N端，已有研究表明，在基因家族中Ⅰ組成員是Ⅱ組和Ⅲ組成員的原始祖先，這種分布特征表明Ⅱ組和Ⅲ組中的WRKY結構域可能來源于Ⅰ組C端結構域，且它們可能具有相似的功能?；蛲怙@子數(shù)量為2～9 個，內含子數(shù)量為1～8個，少數(shù)成員無 UTR區(qū)域，的基因結構是多樣的，保守基序和外顯子的差異可能會賦予基因功能多樣性。

2.5 KcWRKY轉錄因子染色體定位和復制關系

染色體定位結果表明，71個秋茄基因不均勻分布在秋茄基因組18條染色體上(圖5)，其中，Chr12上基因分布最多，有10個，Chr18上分布的基因最少，只有1個?；蚍植寂c染色體長度沒有明顯的相關性。根據(jù)Holub等的研究，在200 kb內包含2個或多個基因的染色體區(qū)域被定義為串聯(lián)重復事件，在秋茄基因組中共發(fā)現(xiàn)4對串聯(lián)重復基因對(、和、)，分別位于Chr10、Chr12和Chr13上。另外，基因存在大量片段復制基因，這些基因在秋茄基因家族進化中發(fā)揮了重要作用，是基因擴張的主要驅動力。為了更好地理解作用于基因家族的進化約束條件，計算了基因對的/，所有串聯(lián)重復和片段復制的基因對的/<1，表明基因家族在進化過程中可能經(jīng)歷了很強的純化選擇壓力。

2.6 KcWRKY轉錄因子蛋白互作網(wǎng)絡分析

蛋白互作網(wǎng)絡分析結果(圖6)表明，KcWRKY轉錄因子之間關聯(lián)緊密，KcWRKY66、KcWRKY68、KcWRKY70、KcWRKY71是互作網(wǎng)絡中的關鍵節(jié)點，在蛋白互作網(wǎng)絡中可能會發(fā)揮關鍵作用。且主要與鎂離子螯合酶ChlH(magnesium-chelatase subunit ChlH，簡稱GUN)、細胞分裂原激活蛋白質激酶(MAP kinase substrate，簡稱MKS)、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，簡稱MPK)、sigma factor binding protein(SIB)存在網(wǎng)絡相互作用。SIB作為激活劑在植物防御壞死營養(yǎng)病原體中發(fā)揮作用，MPK可能使WRKY轉錄因子的調控因子磷酸化，介導脅迫基因轉錄，MKS與WRKY轉錄調節(jié)因子相互作用調控脅迫響應。這些蛋白間的相互作用可能在秋茄獨特的抗逆機制中發(fā)揮了關鍵作用。

2.7 KcWRKY轉錄因子啟動子順式作用元件分析

基因家族啟動子的順式作用元件分析結果見圖7，主要關注植物生長發(fā)育，激素調控和逆境脅迫有關的作用元件。家族成員啟動子含有大量茉莉酸甲酯響應(MeJA responsiveness)元件和脫落酸響應(abscisic acid responsiveness)元件，含有較多的低溫響應(low-temperature responsiveness)元件、赤霉素響應(gibberellin responsiveness)元件和水楊酸響應(salicylic acid responsiveness)元件，這可能意味著KcWRKY蛋白是通過激素調控介導途徑響應脅迫的。其中和包含8種順式元件，這可能意味著這2個基因在秋茄生長發(fā)育和抗逆脅迫中發(fā)揮著十分重要的作用。

2.8 KcWRKY基因在不同器官中的表達模式

表達模式分析結果如圖8所示，所有的基因都至少在1個器官中表達，其中、、、和在所有器官中均有高水平的表達?；ā⒏颓o中表達量最高的是，在葉和果實發(fā)育前期均具有最高表達，、、、和在果實發(fā)育后期具有較高表達。隨著果實的不斷發(fā)育，4、24、50、68在果實中的表達量提高。

3 討論與結論

本研究在秋茄基因組中鑒定了71個基因，與擬南芥中(72個)的基因數(shù)量差不多，但比水稻(102個)和楊樹(104個)的少。通過對KcWRKY蛋白保守結構域進行序列分析發(fā)現(xiàn)，和這2個WRKY家族成員的核心結構域發(fā)生了變異(WRKYGEK、WRKYGKK)，與水稻中常見的突變形式一致。相關研究表明，在大豆中具有WRKYGKK變型的和失去了對W-box的結合能力，而在煙草中，具有 WRKYGKK變型的特異識別WK box(TTTCCAC)，當WRKYGKK 突變?yōu)閃RKYGEK后，便失去了對 WK box的結合能力。推測和的WRKY七肽結構域發(fā)生變型可能使其無法識別并結合W-box，或識別其他基序，產(chǎn)生新功能。的C端WRKYGQK七肽結構域出現(xiàn)缺失，形成了WRK的缺失變型，而同樣的情況出現(xiàn)在香石竹的N端。啟動子順式元件分析結果顯示，家族成員含有激素調控和逆境脅迫相關的順式作用元件，其中響應脫落酸應答的順式作用元件最多，推測KcWRKY蛋白在植物激素調控植物的生物過程及逆境響應過程中起著重要作用且功能復雜，這可能與秋茄能夠適應復雜的潮間帶環(huán)境有關。

系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)，家族成員符合基因家族的一貫分類，除少數(shù)幾個KcWRKY蛋白結構域部分缺失和變異之外，其他蛋白均具有完整準確的結構域，一定程度上說明家族在進化上相對保守。在基序組成上，秋茄的Ⅰ組C端WRKY結構域與Ⅱ組、Ⅲ組WRKY結構域含有相同的保守基序，和三淺裂野牽牛的結論一致，支持Ⅱ組、Ⅲ組WRKY成員的結構域可能由Ⅰ組C端結構域進化而來的假設；Ⅱ組是基因數(shù)量最多的一組，占基因家族的63.3%，表明Ⅱ組可能在進化過程中發(fā)生了顯著擴張，與大多數(shù)物種研究結果一致；Ⅱa組基因數(shù)量最少(2個)，可能是因為它的進化時間相對其他組較短，是基因家族中所有組中最后演化出來的。家族成員中出現(xiàn)保守基序的缺失，并未全部形成保守基序1-保守基序2的穩(wěn)定結構，解釋了秋茄WRKY 保守結構域部分發(fā)生變異和缺失的原因，表明秋茄可能在變異中不斷獲得進化。

基因在不同器官的表達模式分析結果表明，在花、根、莖、葉和果實前中后期均有表達，是的同源基因，參與調節(jié)編碼線粒體和葉綠體蛋白的脅迫響應基因，說明可能也具有此功能。在葉和果實發(fā)育后期表達量較高，和互為同源基因，的表達會誘導葉片的衰老，表明可能參與秋茄葉和果實衰老的調節(jié)。