基于SSR標(biāo)記的藜麥種質(zhì)資源遺傳多樣性分析與指紋圖譜構(gòu)建

陳翠萍， 劉 洋

[1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海西寧 810016； 2.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部植物新品種測試(西寧)分中心，青海西寧 810016]

藜麥(Willd)，莧科藜屬植物，異源四倍體(2n=4x=36)，原產(chǎn)于南美洲安第斯山區(qū)，具有耐寒、耐鹽、耐干旱的生長特性。因含有豐富而全面的營養(yǎng)價值，被印加人稱為“糧食之母”。我國于20世紀(jì)90年代從國外引入藜麥并進(jìn)行適應(yīng)性栽培，先后在我國西藏、甘肅、青海等地進(jìn)行引種、新品種選育及適應(yīng)性評價等工作。對藜麥分子標(biāo)記和遺傳多樣性方面已有部分研究。陸敏佳等利用16對SSR標(biāo)記對41個藜麥種質(zhì)的多態(tài)性及其親緣關(guān)系進(jìn)行分析，16對引物的平均多態(tài)信息含量為0.366。宋嬌利用46對簡單重復(fù)序列(SSR)標(biāo)記對114份藜麥材料共擴(kuò)增出165條多態(tài)性條帶，聚類分析表明不同來源地的種質(zhì)具有一定的遺傳相似性，相同來源地的材料也分到了不同組群。孫夢涵等利用66對SSR標(biāo)記對163份藜麥種質(zhì)和3份中國臺灣紅種質(zhì)進(jìn)行種質(zhì)群體的多態(tài)性和親緣關(guān)系分析，結(jié)果表明玻利維亞和秘魯種質(zhì)與美國和智利種質(zhì)的遺傳信息存在明顯區(qū)分，青海和云南的藜麥種質(zhì)在親緣關(guān)系上接近安第斯高原型，河北、山西的藜麥種質(zhì)更接近智利低海拔型，臺灣紅藜為臺灣本土種質(zhì)。吳文強(qiáng)等利用18對SSR標(biāo)記在96份藜麥上共檢測出192個等位基因條帶，遺傳相似系數(shù)平均值為0.789 5，可為篩選適合貴州地區(qū)有效推廣、種植、應(yīng)用的藜麥材料提供參考。大量研究表明，SSR分子標(biāo)記對評價藜麥種質(zhì)資源遺傳多樣性的可行性具有重要意義，但對所選擇的藜麥SSR分子標(biāo)記的染色體位置是否分布均勻等信息均不明確，不利于所選SSR標(biāo)記的廣泛推廣和利用。Jarvis等公布了高質(zhì)量的藜麥全基因組序列。藜麥全基因組序列的測序完成為分子標(biāo)記的開發(fā)、基因定位和基因功能等提供了極有利的條件。本研究基于前人研究的基礎(chǔ)對藜麥SSR的多態(tài)性信息及分布位置進(jìn)行進(jìn)一步研究。

作物品種鑒定是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)環(huán)節(jié)必不可少的關(guān)鍵步驟，是保證品種優(yōu)良遺傳性狀能夠充分發(fā)揮的重要舉措，也是名優(yōu)品種保護(hù)、防止種子混雜退化的有效手段。DNA指紋圖譜技術(shù)具有豐富的多態(tài)性和顯著的個體特異性，能夠在分子水平上識別品種間的差異，不易受外界環(huán)境影響，可快速、準(zhǔn)確地完成品種鑒定。隨藜麥種植面積的逐年擴(kuò)大，對品種鑒定的需求也在增加，因此開展藜麥品種的鑒定是必需的。隨分子生物學(xué)的發(fā)展，分子鑒定逐漸用于已知品種庫維護(hù)和近似品種篩選工作中。SSR標(biāo)記在單個位點(diǎn)上多態(tài)性高，技術(shù)成熟且利于推廣應(yīng)用，因此作為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的首選標(biāo)記。目前，SSR標(biāo)記已成功應(yīng)用在亞麻、棉花、小麥、玉米、水稻、藕蓮等作物指紋圖譜構(gòu)建上，但目前在藜麥品種鑒定中尚未見研究。

本研究利用SSR分子標(biāo)記的方法對48份藜麥種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析并構(gòu)建DNA指紋圖譜，確定藜麥種質(zhì)資源的遺傳基礎(chǔ)和遺傳多樣性，為藜麥遺傳育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本試驗(yàn)收集國內(nèi)外藜麥種質(zhì)資源共計48份，其中LM-BZ-47為青海西寧野生種。所有48份藜麥種質(zhì)資源均由青海省農(nóng)林科學(xué)院作物育種栽培研究所提供，種質(zhì)資源編號和來源信息見表1。

表1 48份藜麥種質(zhì)資源編號及來源

1.2 DNA提取

藜麥于2020年3月在青海省農(nóng)林科學(xué)院試驗(yàn)基地種植，海拔2 309 m左右，年均氣溫6 ℃左右，年均降水量約為380 mm。在藜麥苗期，選取5株長相一致的植株，等量混合葉片，利用十六烷基三甲基溴化銨(CTAB)法提取植物總DNA，檢測DNA質(zhì)量及濃度，稀釋到50 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物來源及PCR檢測

引物(表2)一部分來源于Jarvis公布的已知引物，一部分根據(jù)Jarvis公布的藜麥基因組測序結(jié)果開發(fā)新的SSR分子標(biāo)記，用于PCR擴(kuò)增。引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。PCR擴(kuò)增體系：DNA 2 μL，10×Buffer 1 μL，2.5 mmol/L each的dNTPs 0.8 μL，5 U/μL的E 0.2 μL，Primer-F 0.5 μL，Primer-R 0.5 μL，ddHO 5 μL，總體積10 μL。反應(yīng)程序：94 ℃ 2 min；94 ℃ 30 s，60 ℃(每個循環(huán)降低0.5 ℃) 45 s，72 ℃ 45 s，10個循環(huán)；94 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，30個循環(huán)；72 ℃ 5 min，10 ℃保存。PCR結(jié)束后在擴(kuò)增產(chǎn)物中加入適量的 Loading Buffer，進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳。電泳結(jié)束后將膠塊銀染顯色、拍照并讀帶。

將特異片段利用San-Prep柱式DNA膠回收試劑盒[購自生工生物工程(上海)股份有限公司]回收，與pMD18-T Vector[購自寶生物工程(大連)有限公司]連接、轉(zhuǎn)入DH5 α大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞[購自天根生化科技(北京)有限公司]并送往生工生物(上海)股份有限公司進(jìn)行測序。隨后與Jarvis公布的基因組進(jìn)行比對。

1.4 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)PCR擴(kuò)增結(jié)果，對將同一引物擴(kuò)增出的大小相同的目的條帶視為1個等位變異，并進(jìn)行記錄。有條帶的記為1，無條帶的或無法辨別的帶型記為0，構(gòu)建[0，1]矩陣。利用Popgene 32軟件計算Nei’s的基因多樣性指數(shù)()、Shannon信息指數(shù)()、擴(kuò)增總條帶數(shù)等遺傳參數(shù)。使用 PIC_calc 0.6 軟件計算各引物位點(diǎn)的多態(tài)信息含量(PIC)。利用DPS軟件UPGMA方法進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物篩選與驗(yàn)證

利用地理來源遠(yuǎn)、形態(tài)差異較大的6份藜麥種質(zhì)資源對收集和開發(fā)的SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測，淘汰不具多態(tài)性或多態(tài)性差的引物，最終篩選出25對條帶清晰、多態(tài)性較高、擴(kuò)增穩(wěn)定的SSR引物(表2)。利用這25對SSR引物在48個藜麥種質(zhì)資源中擴(kuò)增(圖1)。

表2 引物篩選結(jié)果

KAAT007(AAT)30AGGTACAGGCGCAAGGATACCGGTAGCATAGCACAGAACGKAAT018(ATT)11GCACCAACCTGAGTCCTAGCCGTGTCGCTGCTCATATTGTKAAT037(TAA)19TCAACCTCCGAATCCTATCAAGGATGCTGATTGGTGGATA-AAKAAT041(ATT)13AG(TAT)4TAG(TAT)5TG(TTA)5TGGGACTTCCATAAGGCAACATATTGCATGTCGAGCACCAKAAT043(AAT)24GGCTCCCACTAATTTCTTGTGTCATGCGGCTTGAGTAGTTTKCAA015(GTT)7TGGTTGGAGGCAAACATACCTGAGGGTGAAGAGGAGGATGKCAA078(CAA)3AAA(CAA)9AGGCGAGGATAACATGATCGAAGAAGCCATACCTCCCTCACKGA010(TC)11TGTTTCCTGCGTCCCTATTCGCTGAAGGTGAAATAGGTG-GAKGA145(AG)12CCAGGGTGAATCAGGGAATACTGGCAGGTGGGTCTTCTATBGA200(GA)20ACCAGCCACTTTGTCATTAGGGCCATGGTTGATGAATGAGA

2.2 遺傳多樣性分析

對篩選出的具有多態(tài)性的引物進(jìn)行統(tǒng)計，見表3。25對引物共擴(kuò)增多態(tài)性條帶134條，其中每對引物等位基因數(shù)位于3～13之間，平均值為5；其中KAAT007的等位基因較多，為13個，CQ5、CQ6、CQ15、CQ27、CQ4-10、CQ9-3、CQ11-2、KCAA015和KGA010等位基因最少，僅3個。多態(tài)性信息含量()介于0.378 8～0.852 2，均值為0.604 2，僅CQ15、CQ27、CQ9-3、KGA010和BGA200的小于0.5，說明絕大部分引物多態(tài)性信息良好。

通過挖膠測序并與藜麥基因組比對后發(fā)現(xiàn)，25對引物較為均勻地分布在15條藜麥染色體上(表3)，除6號和12號染色體無引物外，其余染色體至少1對引物，這為篩選出的25對分子標(biāo)記的使用提供了更加完善的信息。遺傳多樣性分析表明，Nei’s基因多樣性指數(shù)()為0.107 5～0.368 7，均值為0.242 4。Shannon信息指數(shù)() 為0.204 3～0.551 6，均值為0.383 3。表明48份藜麥種質(zhì)資源遺傳多樣性豐富。

表3 多態(tài)性引物信息

KAAT00180.163 40.284 20.779 52KAAT007130.107 50.204 30.852 214KAAT01870.187 30.314 20.716 817KAAT03790.143 00.245 90.721 713KAAT04170.160 30.282 50.762 85KAAT043100.142 00.252 80.812 27KCAA01530.341 20.517 50.519 311KCAA07860.185 80.298 80.543 45KGA01030.296 40.452 70.423 010KGA14550.304 00.464 10.686 710BGA20050.167 00.262 80.410 33均值50.242 40.383 30.604 2最大值130.368 70.551 60.852 2最小值30.107 50.204 30.378 8

2.3 聚類分析

利用25對引物的134條條帶對48份藜麥種質(zhì)資源進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖2。由圖2可知，在遺傳相似系數(shù)0.706處，48份藜麥種質(zhì)資源可聚為4個組。第Ⅰ組包括19份藜麥種質(zhì)資源，主要是來自于青海和甘肅的藜麥種質(zhì)資源，青海與甘肅地理環(huán)境相鄰，藜麥種質(zhì)資源的遺傳背景也表現(xiàn)得較為相似；第Ⅱ組包括19份種質(zhì)資源，主要是青海和阿根廷藜麥種質(zhì)資源，青海與阿根廷藜麥生態(tài)條件相近，所種植的藜麥種質(zhì)資源的遺傳背景也較為相似；第Ⅲ組包括9個種質(zhì)資源，除LM-BZ-46外，其余均為阿根廷藜麥，表現(xiàn)為遺傳背景相似；第Ⅳ組包括1個種質(zhì)資源，LM-BZ-47，為青海野生種質(zhì)資源，與其他種質(zhì)資源遺傳背景差異較大。

2.4 指紋圖譜構(gòu)建

在25對多態(tài)性引物中，CQ135、CQ143、KAAT001、KAAT007、KAAT018、KAAT037、KAAT041、KAAT043的多態(tài)性指數(shù)較高，且均能鑒定出多個藜麥種質(zhì)資源，可用來構(gòu)建藜麥指紋圖譜。基于快速、經(jīng)濟(jì)的檢測要求，對引物進(jìn)行組合設(shè)計。根據(jù)利用最少引物鑒定最多品種的指紋圖譜構(gòu)建原則，48份藜麥種質(zhì)資源通過3對SSR引物組合即可完全被區(qū)分開，即KAAT001、KAAT007、KAAT043引物組合。對每對引物所擴(kuò)增的條帶進(jìn)行統(tǒng)計，得到每個品種的DNA指紋圖譜數(shù)據(jù)庫(表4)。

表4 48份藜麥種質(zhì)資源SSR數(shù)字指紋圖譜構(gòu)建

LM-BZ-160000010000000000001000010001000LM-BZ-400000001000010000000000000000100LM-BZ-170001000000000001000000000010000LM-BZ-410000100110000000000000001000000LM-BZ-180000100000000001000000000010000LM-BZ-420000100101101000000000001000100LM-BZ-190001100010000000001000000000010LM-BZ-430000001100000100000010100000000LM-BZ-200001000000000000000100110000010LM-BZ-440010000010000000000000101000000LM-BZ-210001000000000000000100110000000LM-BZ-450000100000000000010000010000000LM-BZ-220010010000000000001000110000000LM-BZ-460000000100000000001000000100000LM-BZ-230001000000000000100110110000000LM-BZ-470010100000000000000000011000100LM-BZ-240000100000000010000000010000100LM-BZ-480100010000000000001000011000000

3 討論與結(jié)論

藜麥引入國內(nèi)時間較短，研究基礎(chǔ)薄弱、品種來源與遺傳背景不明，不利于藜麥新品種選育與開發(fā)。藜麥品種間遺傳差異的研究對于藜麥遺傳改良具有重要意義。SSR分子標(biāo)記被廣泛地用于作物遺傳多樣性研究。一般認(rèn)為，當(dāng)<0.25 時，引物的多態(tài)性信息較低；當(dāng)>0.50 時，引物的多態(tài)性信息較高。陸敏佳等從54對SSR引物中篩選出16對能明顯擴(kuò)增出穩(wěn)定的多態(tài)性條帶的引物，變幅為0.208～0.432，平均為0.366。孫夢涵等利用66對SSR標(biāo)記在166份種質(zhì)材料中檢測到327個等位位點(diǎn)，平均多態(tài)性信息含量為0.524，但是多態(tài)性信息含量均較少。本研究利用25對SSR引物對48份藜麥種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，介于0.378 8～0.852 2，均值為0.604 2，說明絕大部分引物多態(tài)性信息良好，且本研究通過測序明確每對引物在藜麥染色體上的位置，為藜麥種質(zhì)資源的鑒定和研究提供更加完善的信息。聚類分析將48份藜麥種質(zhì)資源聚為4個組。第Ⅰ組19份種質(zhì)資源，第Ⅱ組19份種質(zhì)資源，第Ⅲ組9份種質(zhì)資源，第Ⅳ組1份青海野生藜麥種質(zhì)資源。聚類分析結(jié)果與藜麥種質(zhì)資源的來源、地理分布等信息大體相似，少部分聚類結(jié)果與農(nóng)藝性狀表現(xiàn)有差異，這可能與所選分子標(biāo)記的數(shù)量較少等原因有關(guān)，后續(xù)還需增加分子標(biāo)記的數(shù)目。同時，聚類分析結(jié)果對于藜麥育種中材料的選擇有一定的指導(dǎo)和借鑒作用。

SSR標(biāo)記已經(jīng)成功應(yīng)用于多個作物的指紋圖譜構(gòu)建。潘根等利用SSR引物對24份來源于中國的亞麻品種進(jìn)行DNA指紋數(shù)據(jù)庫構(gòu)建；胡文斌等利用引物-帶型組合法，選取9對SSR引物構(gòu)建了58個火龍果品種的指紋圖譜，為品種鑒定提供依據(jù)。在藜麥研究方面，SSR技術(shù)多用于遺傳多樣性分析，而用于藜麥指紋圖譜構(gòu)建的則鮮有研究。本研究利用聚丙烯酰胺凝膠電泳首先篩選SSR引物，然后再進(jìn)行重復(fù)性和穩(wěn)定性檢測，具有易操作、成本低的特點(diǎn)，為藜麥種質(zhì)分類、品種鑒定和品種權(quán)保護(hù)提供重要的理論依據(jù)與技術(shù)支撐。