88份糯玉米自交系紋枯病抗性鑒定與評價

章慧敏， 宋旭東， 周廣飛， 張振良， 冒宇翔， 陳國清，2， 陸虎華， 石明亮， 黃小蘭， 薛 林，2， 郝德榮

(1.江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所，江蘇南通 226012； 2.江蘇省現(xiàn)代作物生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇南京 210095)

紋枯病是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重、最廣泛的作物病害之一。近年來，玉米種植密度和氮肥用量的增加，導(dǎo)致田間氣候環(huán)境條件更加有利于紋枯病的頻繁發(fā)生，紋枯病呈逐年加重趨勢，已成為制約玉米產(chǎn)量持續(xù)增長的主要病害之一。該病害每年發(fā)病率約為40%，嚴(yán)重時可達(dá)70%(某些地區(qū)或品種可達(dá)100%)。由玉米紋枯病引起的產(chǎn)量損失為10%～20%，嚴(yán)重時可達(dá)35%。隨著全球氣候變暖，玉米紋枯病造成的損失趨于惡化，選育和推廣抗紋枯病品種迫在眉睫。

國內(nèi)外研究表明，迄今為止尚未發(fā)現(xiàn)對玉米紋枯病免疫的自交系，中高抗種質(zhì)材料較少，主要為R15、R09、CML163、CML270、CML429、PA31等自交系和糯玉米農(nóng)家種。其中，大部分被鑒定的糯玉米農(nóng)家種對紋枯病表現(xiàn)出較好的抗性。本研究收集88份糯玉米自交系，為探明這些材料對紋枯病的抗性，采用人工接種的方法，對該群體進(jìn)行抗性鑒定與評價，篩選出抗性較好的自交系。同時利用芯片技術(shù)對抗性材料進(jìn)行基因分型和遺傳結(jié)構(gòu)分析，劃分其雜種優(yōu)勢群，以期為抗紋枯病玉米育種提供重要信息。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與田間試驗(yàn)

試驗(yàn)材料是江蘇沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所(江蘇省玉米種質(zhì)資源基因庫)保存、收集和創(chuàng)制的 88份糯玉米自交系。試驗(yàn)所用菌種是從江蘇省玉米紋枯病典型病株上采集得到的菌核分離純化后獲得。

所有供試材料采用隨機(jī)區(qū)組排列，單行區(qū)種植，2次重復(fù)，單行區(qū)面積為3.0 m×0.7 m，每份材料種植1行(定植 12 株)，設(shè)感病對照掖478和中抗對照昌7-2。于2020年、2021年6月進(jìn)行重復(fù)鑒定。試驗(yàn)地設(shè)在江蘇省沿江地區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所玉米病蟲害鑒定圃內(nèi)。

1.2 抗性鑒定與數(shù)據(jù)分析

利用江蘇省典型玉米紋枯病的菌核，在室內(nèi)無菌條件下進(jìn)行分離純化得到病原菌，滅菌后于培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，隨后將活化的菌株接種到滅菌木皮上，加入適量培養(yǎng)液，在28 ℃條件下培養(yǎng)3 d獲得田間接種用病原菌物。于玉米拔節(jié)期將帶菌火柴接入玉米植株地上第3個葉鞘內(nèi)，每個材料接種8株。接種后5、10 d分別調(diào)查病斑長度，并在接種 25 d 后進(jìn)行田間病級調(diào)查，計(jì)算病情指數(shù)，根據(jù)病情指數(shù)評價其抗性類型(表1)。數(shù)據(jù)分析采用R 4.0.5(https：//www.r-project.org/)完成。

表1 玉米紋枯病病情指數(shù)及抗性評價標(biāo)準(zhǔn)

病情指數(shù)=∑(病級×該病級株數(shù))/(調(diào)查總株數(shù)×最高病級)×100。

1.3 基因分型與數(shù)據(jù)處理

委托中玉金標(biāo)記(北京)生物技術(shù)股份有限公司采用Axiom? Maize56K SNP芯片對供試自交系進(jìn)行基因型分析。根據(jù)Affymetrix(Thermo Fisher)的篩選標(biāo)準(zhǔn)，獲得32 854 個高質(zhì)量單核苷酸多態(tài)性(SNP)標(biāo)記用于群體結(jié)構(gòu)分析。利用PowerMarker 3.25 軟件估算Nei’s遺傳距離，選擇鄰接(Neighbour-Joining，簡稱NJ)法進(jìn)行聚類分析，結(jié)合MEGA 7繪制親緣關(guān)系樹狀圖，劃分雜種優(yōu)勢群。

2 結(jié)果與分析

對88份糯玉米自交系2年的病情指數(shù)(DI)、接種后5 d病斑長度(5DAI)和接種后10 d病斑長度(10DAI)進(jìn)行調(diào)查分析，發(fā)現(xiàn)供試自交系抗感表型變異豐富。2020年與2021年的病情指數(shù)平均值分別為88.83、84.82，變異范圍分別為40.74～100、37.04～100；接種后5 d的病斑長度平均值為15.57、13.77cm，變異范圍為7.67～28.00 cm和4.60～24.83 cm；接種后10 d的病斑長度平均值為33.41、41.23 cm，變異范圍為21.33～53.00 cm和22.50～54.33 cm。接種后5 d的病斑長度變異系數(shù)相比于其他2個表型的變異較高，其2年的變異系數(shù)分別為25.89%、26.01%(表2)。

表2 88份自交系抗性表型鑒定描述性分析

2.1 88份糯玉米自交系對紋枯病的抗性

經(jīng)過2年紋枯病病菌人工接種鑒定發(fā)現(xiàn)，供試自交系中沒有對紋枯病免疫或高抗的種質(zhì)，僅發(fā)現(xiàn)9份抗(R)和中抗(MR)紋枯病的糯玉米種質(zhì)材料，占全部種質(zhì)資源的10.23%，其中以W.58抗性最好，該自交系2年度的平均病情指數(shù)分別為40.74、37.04，是所鑒定自交系中唯一的抗性材料(表3)。以W.144等為代表的8份中抗材料占總數(shù)的9.10%，病情指數(shù)在46.67～59.26之間。感病(S)及高感(HS)自交系79份，占比為89.77%。以上結(jié)果表明，篩選鑒定得到的抗性材料較少。

表3 88份糯玉米自交系病情指數(shù)與抗性評價

挑選出接種后5、10 d病斑長度在前25%的自交系，將其與抗及中抗自交系進(jìn)行集合分析(圖1)，發(fā)現(xiàn)在所有集合中均包含的僅有1個自交系，為W.144；20-5DAI、20-10DAI、21-5DAI|DI中共有自交系有2個，分別為W.55、W.58；20-5DAI、21-5DAI、DI中和21-10DAI、DI中共有自交系均只有1個，分別為W.142、W.106；而W.43、W.54、W.183、W.190未在其他任何一個病斑長度的集合中出現(xiàn)。這表明，抗性種質(zhì)的抗性表現(xiàn)在各個階段可能有所差異，有些種質(zhì)如W.144在各個時期均表現(xiàn)為較好的抗性，而其他則可能在前期表現(xiàn)抗性或后期才表現(xiàn)出抗性。

2.2 9份抗及中抗糯玉米自交系的雜種優(yōu)勢群劃分

以衡白522(W.131)和通系5(W.191)為對照自交系，采用玉米Maize56K SNP芯片對9份抗及中抗自交系進(jìn)行基因型分析。利用 PowerMarker 3.25估算 Nei’s 遺傳距離，選擇NJ法對9份抗及中抗自交系進(jìn)行聚類分析。結(jié)果(圖2)表明，W.55、W.54、W.183和W.190屬于通系5類群 ，W.58、W.106屬于衡白522類群，W.43、W.142和W.144屬于其他另外2個類群。其中，W.190與通系5親緣關(guān)系最近，W.58與衡白522親緣關(guān)系最近。

2.3 病情指數(shù)與部分農(nóng)藝性狀及病斑長度相關(guān)性分析

對88份糯玉米自交系的 3種農(nóng)藝性狀、接種后5、10 d的病斑長度與病情指數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果(圖3)表明，玉米紋枯病的病情指數(shù)與株高(PH)、穗位高(EH)、穗下節(jié)數(shù)(1)呈極顯著負(fù)相關(guān)(<001或<0001)，與穗下節(jié)間長度(2)為負(fù)相關(guān)，與接種后5 d的病斑長度、接種后10 d的病斑長度無相關(guān)性。這表明，植株的抗性受株高、穗位高、穗下節(jié)數(shù)影響較大，植株越高、穗位越高、穗下節(jié)間數(shù)越多、穗下平均節(jié)間距越大，其病情指數(shù)越低，抗性越好。相關(guān)性分析結(jié)果也表明，接種后5 d的病斑長度僅與接種后10 d的病斑長度呈極顯著正相關(guān)(<0.001)，而與其他性狀均無顯著相關(guān)性， 說明接種后5 d的病斑長度表型受其他性狀的影響較小。

3 討論

玉米紋枯病是由立枯絲核菌引起的真菌性病害，在我國各玉米主產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，是南方玉米區(qū)的重要病害之一。目前，篩選抗病種質(zhì)仍是玉米抗紋枯病育種最為根本且有效的方法。李蘆江等經(jīng)大量鑒定篩選，在普通玉米中挖掘了一些抗性較為穩(wěn)定的種質(zhì)材料，但數(shù)量較少。程偉東等對糯玉米農(nóng)家種進(jìn)行紋枯病病菌接種鑒定，發(fā)現(xiàn)糯玉米農(nóng)家種中有較多抗性較好的種質(zhì)。本研究篩選得到的糯玉米抗病種質(zhì)較少，原因可能在于2020—2021年江蘇省雨水偏多，溫濕度條件十分適宜紋枯病病害發(fā)生，致使抗病對照C7-2也表現(xiàn)出高感紋枯病。值得關(guān)注的是，在此種高壓篩選條件下，群體中仍篩選出9份抗和中抗種質(zhì)，說明這些種質(zhì)抗性較為穩(wěn)定，值得后續(xù)進(jìn)行深入研究與應(yīng)用。而抗性種質(zhì)的抗性表型在各個階段有所差異，原因可能在于不同材料自身對病害的抗性持久性或強(qiáng)度不同。又或在與病原菌博弈中，不同自交系在不同階段可能采取的防御策略不同，導(dǎo)致表現(xiàn)出的抗性表型或其他表型在各個階段不一樣。

利用分子標(biāo)記對種質(zhì)資源進(jìn)行遺傳多樣性分析的目的和意義在于能使研究人員比較準(zhǔn)確地了解材料所屬的雜種優(yōu)勢群，以免育種家大量盲目測配，提高自交系利用效率。高嵩等利用SNP標(biāo)記對205份普通玉米種質(zhì)進(jìn)行類群劃分，優(yōu)化雜交組配，選育出吉單 563。趙久然等通過Maize SNP3072 芯片，將 344 份自交系劃分為 8 個類群，明確了京科 968 系列品種的雜優(yōu)模式“群×黃改群”的形成。本研究基于SNP標(biāo)記將9份抗性材料歸類于4個類群中， 為后續(xù)抗病種質(zhì)資源的利用和品種選育工作提供了重要信息，將大大提高抗病育種工作效率。

玉米紋枯病抗性鑒定工作繁瑣，費(fèi)時費(fèi)工，利用其他關(guān)聯(lián)表型(如株高、穗位高等)作為鑒定標(biāo)準(zhǔn)可能會縮短抗病種質(zhì)篩選時間。李蘆江等發(fā)現(xiàn)，玉米的株高和穗位高與植株病情指數(shù)呈極顯著相關(guān)，本研究的結(jié)果與以上結(jié)果相似。然而，玉米株高和穗位過高，并不利于其他性狀的遺傳改良工作，且株高或穗位高的種質(zhì)所表現(xiàn)出的抗病性狀是否與其帶有抗病基因有關(guān)還需進(jìn)一步深入研究。株高或穗位較高的種質(zhì)材料表現(xiàn)出抗病可能是由于病原菌侵染速度一樣，但到達(dá)穗位的距離不同所引起的，并非攜帶抗病基因。因此，株高、穗位高等性狀可以適當(dāng)考慮，而不宜作為抗紋枯病育種重點(diǎn)關(guān)注的表型。通過研究發(fā)現(xiàn)，病情指數(shù)受農(nóng)藝性狀影響較大，并不適合于做需要精確表型的基因定位。相反接種后5 d病斑長度與其他性狀相關(guān)性較小，受其他因素影響小，能在同一水平下更好地做到表型準(zhǔn)確，獲得的定位信息也許更準(zhǔn)確。