內源性n-3多不飽和脂肪酸對下丘腦神經干細胞來源外泌體miRNA的調節(jié)

路宗博，張盈月，葛科立，張金玉，薛美蘭，葛銀林

（青島大學基礎醫(yī)學院，山東 青島 266073）

肥胖是由多種因素導致的慢性代謝性疾病，表現為脂肪在體內過多堆積和異常分布。下丘腦對機體能量平衡的調節(jié)發(fā)揮重要作用，下丘腦炎癥和肥胖之間有密切關系，抑制下丘腦炎癥有助于抵抗肥胖的發(fā)生與發(fā)展。下丘腦神經核團的肽能神經元可以合成并釋放對能量代謝和攝食行為進行調節(jié)的神經肽。炎癥反應在糖脂代謝紊亂中發(fā)揮重要作用，抑制炎癥反應有利于改善糖脂代謝。

-3多不飽和脂肪酸（-3 polyunsaturated fatty acids，-3 PUFAs）是人體必需脂肪酸，有研究顯示，其具有抗炎作用，可以抑制炎性因子白細胞介素（interleukin，IL）-1、IL-6、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α的釋放，阻斷機體過度炎癥反應，也可能通過下調Toll樣受體4（Toll-like receptor 4，TLR4）/髓樣分化因子88（myeloid differentiation factor 88，MyD88）/核因子κB（nuclear factor-κB，NF-κB）通路相關基因表達而抑制炎癥反應。攝入富含-3 PUFAs的膳食可以減輕胰島素抵抗和降低肥胖癥患病率，能夠有效改善糖脂代謝異常的情況。Kang將秀麗隱桿線蟲（）的基因轉入C57BL/6小鼠，得到轉基因小鼠，使其可以將-6 PUFAs轉化為-3 PUFAs，增加內源性-3 PUFAs的含量，小鼠成為研究-3 PUFAs作用的最佳模型。前期研究發(fā)現，相同飼養(yǎng)條件下，小鼠體質量以及Lee’s指數顯著低于野生型小鼠，且小鼠下丘腦組織中的炎癥因子、、、、的mRNA相對表達量明顯下調，mRNA相對表達量明顯上調，表明小鼠下丘腦中的炎癥反應明顯低于野生型小鼠。這提示內源性-3 PUFAs含量的增加與減輕小鼠下丘腦炎癥并抵抗肥胖有關，但其機理目前尚不明確。

外泌體是一種包含蛋白質、核酸（DNA、mRNA、microRNA、lncRNA、circRNA等）和脂質等內容物的囊泡結構，對于外泌體參與疾病發(fā)生發(fā)展影響的具體分子機制，目前研究還不夠透徹。外泌體可以通過參與細胞間通訊、細胞增殖與遷移等過程，影響受體細胞基因的表達和功能的改變，進而廣泛參與眾多疾病的發(fā)生與發(fā)展。其中，研究最多的就是外泌體內容物中的miRNA，雖然以當前的技術水平還很難排除外泌體中其他內容物對受體細胞的影響，但是miRNA仍被視為外泌體中最關鍵的功能元件。研究表明，細胞釋放的外泌體miRNA有兩種類型的功能，一種是直接與靶基因mRNA特異結合，影響受體細胞中基因的表達；另一種方式是作為特異受體的激動劑發(fā)揮配體作用從而直接與蛋白質相互作用。外泌體miRNA可以與相鄰細胞直接反應或者通過體液循環(huán)到達受體細胞發(fā)揮作用。推測可能是下丘腦神經干細胞來源的外泌體經腦脊液等渠道，影響臨近小膠質細胞和下游與脂質代謝相關細胞的基因表達，從而發(fā)揮抑制下丘腦炎癥并抵抗肥胖的作用。

本實驗以轉基因小鼠為模型，以野生型C57BL/6小鼠為對照，研究內源性-3 PUFAs對下丘腦神經干細胞來源的外泌體miRNA的調節(jié)作用，探究-3 PUFAs抑制下丘腦炎癥及肥胖的作用機理。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

本課題組所飼養(yǎng)的SPF級轉基因小鼠（雜合）由美國哈佛醫(yī)學院康景軒教授建立及贈送，野生型C57BL/6小鼠由轉基因小鼠傳代獲得。將上述小鼠置于青島大學生物醫(yī)學中心的實驗動物中心進行飼養(yǎng)。動物實驗通過青島大學生物醫(yī)學中心倫理委員會審查。

DNA提取酚試劑 北京索萊寶科技有限公司；無水乙醇、氯仿；異戊醇 國藥集團化學試劑有限公司；T3 Super PCR Mix 北京擎科生物科技有限公司；PAGE凝膠快速制備試劑盒 上海雅酶生物科技有限公司；一抗兔抗鼠CD63、標記山羊抗兔IgG二抗 美國Abcam公司；HiScriptIII RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、ChamQTMSYBRColor qPCR Master Mix南京諾唯贊生物科技有限公司；NEBNextPoly(A) mRNA Magnetic Isolation Module 美國New England Biolabs公司；Ribo-ZeroMagnetic Gold Kit (Human/Mouse/Rat)美國Epicentre公司；NEB Multiplex Small RNA Library Prep Set for Illumina、TruSeq Rapid SR Cluster Kit 美國Illumina公司。

1.2 儀器與設備

1.3 方法

1.3.1 小鼠的飼養(yǎng)及基因型鑒定分組

將轉基因小鼠與野生型C57BL/6小鼠進行雜交，待雌鼠懷孕后單獨飼養(yǎng)，直至幼鼠出生。對同窩新生幼鼠進行標記后剪取新生幼鼠尾尖1～2 mm，用酚-氯仿法提取組織的基因組DNA。通過普通PCR法擴增基因，根據瓊脂糖凝膠電泳結果，將新生幼鼠分為轉基因組與野生型C57BL/6組（WT組）。

1.3.2 小鼠下丘腦神經干細胞的培養(yǎng)及細胞鑒定

分別取轉基因組與WT組新生幼鼠各3 只，用體積分數75%乙醇溶液進行體表消毒后，在超凈工作臺進行解剖，獲得其下丘腦組織。用移液器槍頭將下丘腦組織在細胞篩中進行充分研磨，然后用無菌磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）（pH 7.4，下同）重懸洗滌。3 000 r/min離心5 min后，棄上清液，用神經干細胞完全培養(yǎng)基將細胞重懸，按照5×10個/mL的密度接種于T75一次性培養(yǎng)瓶中，進行原代培養(yǎng)。

在37 ℃ CO恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)7 d后傳代，同時取部分細胞進行形態(tài)學及蛋白水平的鑒定。在光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，與ATCC細胞庫中的下丘腦神經干細胞（hypothalamus neural stem cells，htNSCs）形態(tài)學信息進行比對，鑒定所培養(yǎng)的細胞是否為htNSCs。此外，取部分細胞進行蛋白質提取，然后通過Western blotting對神經干細胞標志蛋白Nestin進行表達鑒定。

1.3.3 htNSCs來源的外泌體提取與鑒定

對于攜手共建瀾湄合作命運共同體，云南省人民政府副省長任軍號提出三點倡議：一是提升區(qū)域經濟整體競爭力，積極推動落實《瀾湄國家關于加強跨境經濟合作的部長級聯合聲明》，共同編制《瀾湄國家跨境經濟合作五年發(fā)展規(guī)劃》，實施《瀾湄區(qū)域合作智能貿易網絡倡議》。二是基礎先行，不斷加快瀾湄合作互聯互通建設，推動各類互聯互通便利化措施取得實效。三是親誠惠容，不斷深化交流合作，使瀾湄合作的成果更多惠及民眾。

收集組、WT組htNSCs培養(yǎng)上清液，每個樣本取細胞上清液50 mL，差速超速離心法提取外泌體進行鑒定。500×離心5 min，從細胞上清液樣品中去除細胞。轉移上清液到新的離心管中，2 000×離心10 min，再將上清液轉移到新的離心管中，10 000×離心30 min，去除脫落的微泡。上清液用0.22 μm的過濾膜過濾，100 000×離心2 h，沉淀中加1×PBS，吹打混勻。重復上一步驟一次，用50～100 μL 1×PBS重溶外泌體，-80 ℃保存。采用透射電子顯微鏡觀察外泌體微結構，從-80 ℃冰箱取出樣本的PBS懸液解凍，用鑷子輕輕夾取一枚銅網，用銅網在樣本的PBS懸液中撈取2～3 次，使樣本附于銅網上，吸取1%的磷鎢酸滴加到銅網上，染色2～10 s，用滅菌的濾紙片吸去多余的懸液與染色液，輕輕將銅網放置于透射電子顯微鏡樣品槽中進行觀察；采用NTA技術測定樣本濃度與粒徑分布，該技術依賴于Nanosight平臺，可以根據觀察到的樣本中顆粒的運動軌跡得到顆粒的粒徑數據，并利用平臺對所有樣本顆粒做跟蹤分析，最終得出樣本的粒徑數量分布情況與顆粒物的濃度數據；利用Western blotting進行外泌體表面標志蛋白CD63的表達鑒定。

1.3.4 miRNA高通量測序及miRNA差異表達分析

提取外泌體總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳和NanoDrop ND-1000超微量分光光度計質檢定量后，構建文庫，采用2100芯片生物分析儀進行文庫質量測定，測序文庫在0.1 mol/L NaOH溶液作用下變性成單鏈DNA，在Illumina NextSeq 500測序儀上進行51個循環(huán)測序。使用edgeR軟件包進行組間miRNAs的差異表達分析。通過設定閾值為1.5 倍差異（fold change）、≤0.05且組內CPM平均值≥1來篩選差異表達miRNA。對比小鼠與WT組野生型C57BL/6小鼠htNSCs來源的外泌體差異表達的miRNA。

1.3.5 差異表達miRNA的靶基因預測及靶基因功能富集分析

基于已知的和新預測的miRNA，根據種子區(qū)與靶基因3’ UTR區(qū)的互補關系，結合自由能的情況預測miRNA的靶基因。將差異表達的miRNA在miRDB和TargetScan兩個數據庫進行靶基因預測。通過基因本體（gene ontology，GO）分析，找出差異表達的miRNA靶基因和哪些具體的功能條目聯系最大，重點關注和炎癥及肥胖相關的生物學過程條目。采用R軟件包ClusterProfiler分析，根據＜0.05且出現在相應富集條目中的差異表達基因數目（Count）＞1的標準篩選顯著富集的KEGG通路。

1.3.6 qPCR測定預測的靶基因相對表達量

取分離上清液后的htNSCs，提取RNA，用超微量分光光度計檢測RNA樣品濃度，取等質量RNA樣品進行反轉錄。以為內參基因，采用qPCR法檢測組和WT組小鼠之間相關靶基因mRNA的相對表達量。反轉錄、qPCR體系及程序按諾唯贊試劑盒構建。引物序列見表1。

表1 qPCR引物序列Table 1 Primer sequences used for qPCR in this study

1.4 數據統(tǒng)計與分析

所有數據采用GraphPad Prism 6.01軟件進行分析，各組間數據的比較采用檢驗，＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 小鼠基因型鑒定及分組結果

利用瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，結果如圖1所示，2、5、8泳道在預期位置出現單一高亮條帶，證明新生幼鼠為轉基因小鼠，1、3、4、6、7、9泳道在預期位置無條帶，證明新生幼鼠為野生型C57BL/6小鼠。

圖1 新生幼鼠基因型鑒定結果Fig. 1 Genotype identification of newborn mice

2.2 小鼠htNSCs的鑒定結果

光學倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)，結果顯示，該神經球外圍分布有一層大小較均勻、折光性好的細胞（圖2A），符合htNSCs形態(tài)學特征；將該細胞裂解后提取蛋白，經Western blotting鑒定，結果如圖2B所示，細胞表達了神經干細胞的標志蛋白Nestin，即證明該細胞為htNSCs。

圖2 小鼠htNSCs鑒定結果Fig. 2 Identification of hypothalamic neural stem cells (htNSCs)

2.3 htNSCs來源的外泌體鑒定結果

樣本的粒徑分布結果如圖3A所示，樣本粒徑集中分布在110 nm左右，該粒徑樣本占比為97.9%，符合外泌體的粒徑特征。經透射電子顯微鏡觀察樣本發(fā)現了茶托型或一側凹陷的半球形的典型外泌體結構（圖3B），且直徑在110 nm左右，符合外泌體結構特征。通過Western blotting實驗對外泌體標志蛋白CD63進行表達鑒定，結果如圖3C所示，樣本中有外泌體表面標志蛋白CD63表達，表明該樣本中含有外泌體。綜上，經多種方式鑒定，判定所提取樣本為外泌體，可以繼續(xù)進行后續(xù)實驗。

圖3 外泌體鑒定結果Fig. 3 Results of exosome identification

2.4 htNSCs來源外泌體差異表達miRNA聚類分析結果

層次聚類是一種廣泛應用于miRNA表達數據分析的聚類方法，表達模式相似的miRNA和生物學性質相近的樣本會聚到一個簇中。本實驗根據組間比較獲得的顯著表達miRNA的CPM值進行聚類分析，樹狀圖結構展示了miRNA和樣本的表達模式的關系。由聚類熱圖可以發(fā)現，兩組樣本聚類明顯（圖4）。

圖4 miRNA聚類熱圖Fig. 4 Cluster heat map of miRNAs

2.5 htNSCs來源外泌體差異表達的miRNA分析

火山圖可以對不同樣本組間差異表達基因進行圖形化展示，使用兩個條件篩選得到差異表達的miRNA并繪制火山圖。由圖5可以發(fā)現，與WT組相比，組顯著上調的miRNA有65 條，顯著下調的miRNA有40 條。

圖5 htNSCs來源外泌體差異表達的miRNA火山圖Fig. 5 Volcanic maps of differentially expressed miRNAs in exosomes derived from htNSCs

2.6 小鼠差異表達的miRNA靶基因預測

根據miRDB、Targetscan數據庫資料及文獻[18-23]，篩選得到7 條可能與下丘腦炎癥、脂質代謝及相關的miRNA，其靶基因及靶基因功能見表2。

表2 htNSCs來源的外泌體中可能與下丘腦炎癥及脂質代謝相關的miRNATable 2 miRNAs in htNSCs-derived exosomes that may be associated with hypothalamic inflammation and lipid metabolism

2.7 預測的靶基因mRNA相對表達量

對差異表達的miRNA的靶基因mRNA表達量進行qPCR測定，如圖6所示，組與WT組相比，基因、-、表達量顯著下調，相對表達量分別是0.264±0.014（＜0.01）、0.762±0.038（＜0.05）、0.211±0.100（＜0.01）；基因、、、、表達量極顯著上調（＜0.01），相對表達量分別是2.457±0.057、2.603±0.044、3.006±0.167、3.053±0.378、2.772±0.357。其中，TLR-4、IL-6、IL-1α均為炎癥因子，其基因表達量降低，表明內源性的-3PUFAs可以抵抗炎癥反應?；颉?、、均為脂質代謝通路關鍵基因，表達量均有所上調，對脂質代謝具有重要調控作用。

圖6 htNSCs來源外泌體差異表達miRNA靶基因水平Fig. 6 Expression levels of differentially expressed miRNA target genes in htNSCs derived exosomes

3 討 論

本課題組前期研究發(fā)現，小鼠體內3 PUFAs水平增加可以改善能量代謝控制小鼠的體質量，其機理可能是-3 PUFAs抑制下丘腦炎癥因子、趨化因子的表達，緩解下丘腦炎癥反應，維持下丘腦能量平衡，進而維持機體全身能量平衡抵抗肥胖的發(fā)生。吳聰等研究發(fā)現體內-3 PUFAs水平的增加可影響小鼠外周血外泌體中miRNA的表達，且與野生型C57BL/6小鼠相比有顯著差異表達的miRNA所調控的靶基因大多集中在調控脂質代謝的分子通路中，這與本實驗得到的結果相印證，本實驗得到的具有差異表達的小鼠htNSCs來源的7 條外泌體miRNA均在炎癥反應及脂質代謝中發(fā)揮重要作用。

miR-17-92基因簇編碼6個miRNA，包括miR-17-5P、miR-18a、miR-19a、miR-19b、miR-20a和miR-92a-1，有研究發(fā)現轉錄因子c-Myc和E2F1可以直接調節(jié)miR-17-92基因簇的表達。此外，IL-6可以通過將與其啟動子區(qū)域直接結合來調節(jié)miR-17-92基因簇的表達，說明miR-17-92基因簇與炎癥之間存在潛在聯系。本實驗發(fā)現，與野生型C57BL/6小鼠相比具有差異表達的miR-17-92基因簇編碼的6個miRNA均表現出差異表達，3個炎癥因子相關基因、、的mRNA都出現表達量下降，表明-3 PUFAs可以通過改變htNSCs來源的外泌體中miRNA的表達，調節(jié)炎癥因子相關基因的表達，從而抑制下丘腦炎癥。

此外，這些差異表達的miRNA靶基因在脂質代謝中具有非常關鍵的作用。例如miR-694-5p的靶基因，該基因產物在AMPK信號通路中非常關鍵，研究發(fā)現miR-24可以通過胰島素誘導基因1（）/固醇調節(jié)元件結合蛋白1（）通路軸調控PUFAs的生物合成。本實驗中小鼠基因表達量極顯著上調，說明差異表達的miRNA對基因具有調節(jié)作用，但是其具體分子機制還需要進一步研究。脂肪?；ワ柡兔福╢atty acid desaturase，Fads）對碳鏈較長的不飽和脂肪酸的合成具有十分重要的作用，其中的上游基因是。硬脂酰輔酶A去飽和酶（stearoyl-CoA desaturase，SCD）的表達或活性改變可影響細胞內飽和脂肪酸與不飽和脂肪酸的比例。本實驗中小鼠基因表達量也顯著上調，表明差異表達的miRNA對于調節(jié)體內脂肪酸代謝具有重要作用。周飛等發(fā)現-3 PUFAs在能夠抑制小鼠體質量增長的同時，還可以顯著降低小鼠的血糖和血脂水平，也可以反映出-3 PUFAs對于脂質代謝的調節(jié)作用。

綜上，內源性-3 PUFAs水平的增加影響了htNSCs來源的外泌體中miRNA的表達，差異表達的miRNA不僅可以調控、、等炎癥因子基因的表達，還可以調控脂質代謝中的、等關鍵基因的表達，印證了本課題組前期小鼠體內增加的-3 PUFAs通過抑制下丘腦炎癥、調節(jié)脂質代謝來抵抗肥胖的結論。這提示調節(jié)htNSCs的外泌體內miRNA可以改變下游相關基因的表達，可能是-3 PUFAs抑制下丘腦炎癥和抵抗肥胖的機理之一。這些差異表達的miRNA有望成為診斷代謝異常與肥胖的參考標志物及潛在治療靶標。接下來將對-3 PUFAs抑制下丘腦炎癥和抵抗肥胖的具體機制開展進一步研究。