外源褪黑素對‘南果梨’果實貯藏品質和細胞壁降解酶的影響

劉佳欣，李燦嬰,2，蔣超男，李伊涵，程 園，葛永紅,2,*

（1.渤海大學食品科學與工程學院，遼寧 錦州 121013；2.生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯(lián)合工程研究中心，遼寧 錦州 121013）

‘南果梨’（后文簡稱南果梨）屬于薔薇科（Rosaceae）梨屬（）植物，果實營養(yǎng)豐富、香氣濃郁、爽口多汁、略帶酒香味，深受消費者喜愛。新鮮采摘的南果梨果皮呈綠黃色，果實脆而硬，并且風味淡，常溫貯藏10～15 d果皮變金黃色，散發(fā)出特有的芳香氣味，達到最佳可食度。南果梨屬于呼吸躍變型果實，采后旺盛的呼吸代謝加速了果實體內營養(yǎng)物質的消耗，從而降低了果實品質并縮短貯藏期。

果肉軟化是果實后熟的重要標志之一，不僅受果實的乙烯代謝、蒸騰作用和呼吸作用的影響，而且與果膠物質、纖維素、半纖維素的結構和含量變化密切相關。劉帥民研究發(fā)現(xiàn)，半纖維素分子質量隨果實軟化逐漸降低，且小分子質量的半纖維分子片段含量明顯增加。多聚半乳糖醛酸酶（polygalacturonase，PG）、果膠甲酯酶（pectin methylesterase，PME）、果膠裂解酶（pectin lyase，PL）、纖維素酶（cellulase，Cx）和半纖維素酶等可逐步水解細胞壁物質并最終生成單糖，引起組織的軟化。已有研究表明，1-甲基環(huán)丙烯（1-methylcyclopropene，1-MCP）處理有效抑制了南果梨果實Cx、PG和PME等細胞壁降解酶的活力，同時延緩了纖維素和果膠物質的降解。程玉豆等研究發(fā)現(xiàn)，1-MCP結合延遲冷藏能夠維持‘早紅考密斯’梨貨架期較高的果實硬度和較低的乙烯生成速率，同時還能減少果實腐爛，但較長的冷藏處理時間加速了乙烯生成速率和果實軟化。

褪黑素化學名稱為-乙?；?5-甲氧基色胺，是一種吲哚類色胺，屬于內源性激素，能夠延緩獼猴桃、石榴、油桃、草莓、桃、柑橘、棗和枸杞等果實的采后衰老。Hu Wei等研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素可抑制香蕉果實乙烯生物合成和淀粉轉化為可溶性糖，有助于延緩果實成熟和保持果實品質。此外，外源褪黑素處理能夠推遲梨和棗果實乙烯釋放高峰和降低呼吸速率，同時提高果實抗氧化酶活力，改善細胞氧化還原狀態(tài)，從而延緩果實成熟和生理代謝紊亂。采前褪黑素處理可促進番茄果實糖分和有機酸積累，提高番茄紅素和抗壞血酸含量。然而，目前鮮見外源褪黑素在南果梨采后貯藏品質及果實軟化方面的相關研究。

本實驗研究褪黑素處理對南果梨果實常溫貯藏期間質量損失率、硬度、可溶性固形物質量分數(shù)等指標及PG、PME、Cx和-葡萄糖苷酶（-glucosidase，-glu）活力和基因表達的影響，為南果梨果實的采后品質保持提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

南果梨果實采自錦州市羅羅堡鎮(zhèn)；褪黑素、果膠、3,5-二硝基水楊酸、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鉀、乙二胺四乙酸二鈉、三羥甲基氨基甲烷 北京索萊寶生物科技有限公司；濃硫酸、濃鹽酸 錦州古城化學試劑廠；磷酸鈉 山東西亞化工有限公司；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮上海阿拉丁生化科技股份有限公司；RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、Fast Quant-RT試劑盒、Super Real PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒 天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 儀器與設備

H1650R低溫離心機 湘儀離心機儀器有限公司；UV-2550紫外-可見分光光度計 島津儀器（蘇州）有限公司；7820氣相色譜儀 美國安捷倫公司；5424R小型冷凍離心機 德國Eppendorf公司；GY-1水果硬度計杭州托普儀器有限公司；WYT-32阿貝折光儀 廈門中村光學儀器廠；CR-400色差計 柯尼卡美能達（南京）有限公司；Light Cycle 96實時熒光定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）儀 瑞士羅氏公司。

1.3 方法

1.3.1 果實預處理

南果梨果實在商業(yè)成熟度時采收，紙箱（50個/箱）包裝后當天運抵實驗室進行處理。選取質量基本一致、顏色均勻、無機械傷和病蟲害的南果梨果實，分別用25 μmol/L褪黑素（含0.01 mL/L吐溫20）和蒸餾水（對照）常溫浸泡10 min。待室溫晾干后裝入600 mm×400 mm的聚乙烯（polyethylene，PE）袋，每個袋子裝20個果實，于（21±1）℃、相對濕度（45±5）%條件下貯藏待用，共處理果實130個。

參考文獻[20]的方法。于貯藏第0、3、6、9、12天分別取20個褪黑素處理和對照組果實，切取果實中部皮下0.2～0.8 mm處果肉組織，液氮冷凍后置于-80 ℃冰箱保存。

1.3.2 質量損失率及乙烯釋放速率測定

貯藏第0、3、6、9、12天分別取10個對照和褪黑素處理果實稱量質量，重復3 次。按下式計算質量損失率。

乙烯釋放速率測定參照文獻[21]并稍作修改。分別于貯藏第0、3、6、9、12天取對照和褪黑素處理果實30個，在5 L干燥器中放入南果梨，以10個為一組并密封，1 h后用排水集氣法收集氣體，用氣相色譜儀測定乙烯含量。乙烯釋放速率以μL/（kg·h）表示。

1.3.3 色澤測定

參考文獻[22]的方法，在貯藏第0、3、6、9、12天，分別隨機選取15個對照和褪黑素處理果實，圍繞果實赤道區(qū)域取3 點采用CR400型色差計測定果皮（亮度）、（紅綠度）、（黃藍度）值。

1.3.4 可滴定酸及葉綠素水平測定

可滴定酸質量分數(shù)和葉綠素（葉綠素a和葉綠素b）含量測定分別參照文獻[23]和文獻[24]。

1.3.5 果肉硬度及可溶性固形物質量分數(shù)測定

參考文獻[20]的方法測定果肉硬度及可溶性固形物質量分數(shù)。

1.3.6 水溶性果膠及不溶性果膠質量分數(shù)的測定

水溶性果膠、不溶性果膠質量分數(shù)測定均參考文獻[25]的方法，將樣品（3.0 g）研磨呈勻漿后在沸水浴中保溫30 min，冷卻后在4 500 r/min離心15 min，蒸餾水定容上清液至100 mL，即得到水溶性果膠。向上述留有沉淀的離心管中加入25 mL、0.5 mol/L硫酸溶液，在沸水浴中加熱1 h后取出冷卻至室溫，4 500 r/min離心15 min，用蒸餾水將上清液定容至100 mL，得到不溶性果膠。用半乳糖醛酸繪制標準曲線，以生成半乳糖醛酸的質量分數(shù)表示水溶性果膠和不溶性果膠質量分數(shù)。

1.3.7 細胞壁降解酶活力及相關基因表達分析

PG、PME、Cx和-glu的粗酶液提取及活力測定均參考文獻[24]的方法，以葡萄糖繪制標準曲線。PG和PME活力單位為mg/（h·g），即37 ℃條件下1 g果實組織1 h內催化底物分解形成葡萄糖的質量。Cx和-glu活力測定采用DNS法，單位為mg/（h·g）。各細胞壁降解酶活力均以鮮質量計。

參考RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書，從果肉組織中提取總RNA。用Fast Quant-RT試劑盒合成第一鏈cDNA。引物序列設計（表1）及合成由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。參照Super Real PreMix Plus（SYBR Green）試劑盒說明書進行實時熒光定量PCR。PCR反應混合物在95 ℃下預培養(yǎng)30 s，用三步擴增法分析每個基因：95 ℃孵育30 s；95 ℃變性持續(xù)5 s；降到退火溫度后持續(xù)30 s；在72 ℃下延伸30 s。以為內參基因，采用2法計算基因相對表達量。

表1 PCR引物序列Table 1 Primer sequences used for PCR

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗設置3 次重復，結果以平均值±標準差表示。采用Excel 2010軟件處理數(shù)據(jù)，采用SPSS 16.0軟件進行單因素方差分析和皮爾遜相關性分析，采用檢驗進行顯著性分析，＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 果實乙烯釋放速率和質量損失率的變化

乙烯促進果實后熟衰老，抑制乙烯生成可以延長果實貯藏壽命。圖1A中乙烯釋放速率在貯藏0～9 d呈上升趨勢，在第9天達到高峰后下降，且褪黑素處理果實乙烯釋放速率始終低于對照組。在貯藏第9天，對照組乙烯釋放速率是褪黑素處理果實的1.3 倍。水分蒸騰、呼吸消耗及其他生理代謝是果實采后質量損失的主要原因，質量損失率是反映果實新鮮度的重要指標。圖1B中對照與褪黑素處理南果梨果實質量損失率整體無顯著差異（＞0.05）。

圖1 外源褪黑素對南果梨果實乙烯釋放速率（A）和質量損失率（B）的影響Fig. 1 Effect of exogenous melatonin treatment on ethylene release rate (A)and mass-loss rate (B) of ‘Nanguo’ pear fruit

2.2 果實色澤的變化

果實表皮的色澤可以直觀地反映果實的成熟度和新鮮度。南果梨果實采后果皮顏色由綠轉黃，質地逐漸變軟，表現(xiàn)出果實特有的質地和風味。由圖2可知，對照組果實、和值在整個貯藏期間均呈上升趨勢，且對照組*、*值始終高于褪黑素處理組，兩組間、值在貯藏6～12 d具有顯著性差異（＜0.05），而褪黑素處理組*值始終高于對照組，說明褪黑素處理可以延緩南果梨果皮顏色轉黃，從而延緩衰老。

圖2 外源褪黑素對南果梨果實L*（A）、a*（B）和b*值（C）的影響Fig. 2 Effect of exogenous melatonin treatment on L* (A), a* (B), and b* (C) values of ‘Nanguo’ pear fruit

2.3 果實可滴定酸、葉綠素水平的變化

可滴定酸水平是影響果實風味品質的重要指標之一。由圖3A可知，對照和褪黑素處理果實可滴定酸質量分數(shù)在貯藏0～12 d逐漸下降，且褪黑素處理顯著提高了貯藏6～12 d果實可滴定酸質量分數(shù)（＜0.05），說明褪黑素處理有利于延緩南果梨果實可滴定酸質量分數(shù)的下降。葉綠素是構成果蔬的色素之一，主要由葉綠素a和葉綠素b構成，隨著果實后熟衰老逐漸被分解，使果實退綠而顯示出類胡蘿卜素的黃色。由圖3B、C可知，褪黑素處理和對照組果實中葉綠素a和葉綠素b含量在貯藏0～12 d均呈下降趨勢，且褪黑素處理明顯抑制了葉綠素含量的下降。由此說明外源褪黑素通過抑制南果梨果實果皮葉綠素的降解，從而延緩果實轉黃。

圖3 外源褪黑素對南果梨果實可滴定酸（A）、葉綠素a（B）和葉綠素b（C）水平的影響Fig. 3 Effect of exogenous melatonin treatment on titratable acid (A),chlorophyll a (B) and chlorophyll b (C) contents in ‘Nanguo’ pear fruit

2.4 果肉硬度和可溶性固形物質量分數(shù)的變化

果實成熟度增加會使其逐漸軟化而失去光澤。由圖4A可知，在貯藏0～12 d褪黑素處理和對照組果實的果肉硬度均呈下降趨勢，褪黑素處理在貯藏3～12 d顯著抑制了果肉硬度的下降（＜0.05）。果實中的可溶性固形物主要由可溶性糖構成，其種類和含量影響果實的口感。由圖4B可知，對照和褪黑素處理果實可溶性固形物質量分數(shù)在貯藏0～12 d逐漸升高，其間，褪黑素處理在貯藏6～12 d顯著抑制了可溶性固形物質量分數(shù)的升高（＜0.05）。

圖4 外源褪黑素對南果梨果實果肉硬度（A）和可溶性固形物質量分數(shù)（B）的影響Fig. 4 Effect of exogenous melatonin treatment on flesh firmness (A)and soluble solid content (B) of ‘Nanguo’ pear fruit

2.5 水溶性果膠和不溶性果膠質量分數(shù)的變化

不溶性果膠可保持果實的硬度，但隨著果實貯藏時間的延長，不溶性果膠（原果膠）逐漸轉化為水溶性果膠，在PG作用下分解為多聚半乳糖醛酸，導致細胞間松弛，引起果實軟化。如圖5A所示，褪黑素處理和對照組果實水溶性果膠質量分數(shù)在貯藏0～12 d呈逐漸上升趨勢，但褪黑素處理在貯藏6～12 d顯著抑制了水溶性果膠質量分數(shù)的升高（＜0.05），貯藏第9天對照組果實水溶性果膠質量分數(shù)為褪黑素處理的1.18 倍。由圖5B可知，不溶性果膠質量分數(shù)在貯藏期間整體呈下降趨勢，且褪黑素處理果實不溶性果膠質量分數(shù)始終高于對照組果實，且在貯藏3～12 d差異顯著（＜0.05），褪黑素處理果實不溶性果膠質量分數(shù)分別是相同貯藏時間對照組果實的1.04、1.12、1.21、1.17 倍。

圖5 外源褪黑素對南果梨果實水溶性果膠（A）和不溶性果膠（B）質量分數(shù)的影響Fig. 5 Effect of exogenous melatonin treatment on the contents of waterinsoluble pectin (A) and water-soluble pectin (B) in ‘Nanguo’ pear fruit

2.6 果實細胞壁降解酶活力及基因表達的變化

2.6.1 PME、PG、Cx和-葡萄糖苷酶活力的變化

PME和PG是分解果膠物質的關鍵酶，PME通過使果膠去酯化，產生水溶性的果膠酸和甲醇，PG進一步將果膠分解為小分子物質半乳糖醛酸。如圖6A所示，對照和褪黑素處理果實PG活力在貯藏0～12 d均升高，其中褪黑素處理果實PG活力在貯藏3～12 d顯著低于對照組果實（＜0.05）。如圖6B所示，PME活力的整體變化趨勢和PG一致，但褪黑素處理僅在貯藏6～12 d顯著抑制PME活力升高（＜0.05）。纖維素和半纖維素能在Cx和-glu的作用下最終水解為單糖，從而破壞細胞壁的成分和結構，使果實軟化。如圖6C所示，褪黑素處理與對照組果實Cx活力在貯藏0～12 d均呈升高趨勢，并且褪黑素處理在貯藏6～12 d顯著降低了果實Cx活力（＜0.05）。如圖6D所示，南果梨果實的-glu活力在貯藏0～12 d呈逐漸升高趨勢，但褪黑素處理顯著抑制了貯藏6～12 d果實-glu活力（＜0.05）。

圖6 外源褪黑素對南果梨果實 PG（A）、PME（B）、Cx（C）和β-glu（D）活力的影響Fig. 6 Effect of exogenous melatonin treatment on the activities of PG(A), PME (B), Cx (C) and β-glu (D) in ‘Nanguo’ pear fruit

2.6.2、和表達的變化

由圖7A可知，對照和褪黑素處理果實相對表達量在貯藏0～12 d逐漸升高，但在貯藏6～9 d褪黑素處理顯著抑制了表達（＜0.05）。由圖7B可知，對照和褪黑素處理果實相對表達量在貯藏0～9 d逐漸升高，隨后開始下降，并且褪黑素處理顯著降低了貯藏3～12 d果實相對表達量（＜0.05）。由圖7C可知，相對表達量在貯藏0～12 d呈先下降后升高再下降的趨勢，其中褪黑素處理果實表達量在貯藏3～12 d顯著低于對照組果實（＜0.05）。由圖7D可知，褪黑素處理顯著下調了貯藏3～12 d果實的表達（＜0.05），褪黑素處理果實相對表達量分別是對照的2.38、2.70、1.96、1.83 倍。由圖7E可知，褪黑素處理降低了果實相對表達量，并且在貯藏3、6 d和9 d顯著低于對照（＜0.05），分別為對照組的1.2、1.4、2.2 倍。

圖7 外源褪黑素對南果梨果實PcPG1（A）、PcPG2（B）、PcPME（C）、Pcβ-glu13（D）和Pcβ-glu40（E）表達的影響Fig. 7 Effect of exogenous melatonin treatment on PcPG1 (A),PcPG2 (B), PcPME (C), Pcβ-glu13 (D) and Pcβ-glu40 (E) expression in‘Nanguo’ pear fruit

2.7 相關性分析結果

果肉硬度、不同果膠質量分數(shù)和相關酶活力的相關性分析結果如表2所示，果肉硬度與不溶性果膠質量分數(shù)呈極顯著正相關（＜0.01），與不溶性果膠質量分數(shù)、PG、PME、Cx和-glu活力呈極顯著負相關（＜0.01），水溶性果膠質量分數(shù)與PG、PME、Cx和-glu活力呈極顯著正相關（＜0.01），與不溶性果膠質量分數(shù)呈極顯著負相關（＜0.01）。不溶性果膠質量分數(shù)與PG、PME、Cx、-glu活力均呈極顯著負相關（＜0.01）。PG活力與PME、Cx和-glu活力呈極顯著正相關（＜0.01），PME活力與Cx、-glu活力呈極顯著正相關（＜0.01），Cx活力與-glu活力呈極顯著正相關（＜0.01）。由此表明，果膠物質的降解與細胞壁降解酶活力的變化密切相關。

表2 果肉硬度、不同果膠質量分數(shù)和相關酶活力的相關性分析結果Table 2 Correlation analysis of flesh firmness, different pectin content and related enzyme activities

3 討 論

衰老是果蔬采后的正常生理代謝過程，與果實軟化、乙烯代謝和呼吸代謝密切相關。因此，采用合適的保鮮措施進行采前或采后處理抑制呼吸和乙烯代謝，可以減緩果實的軟化及品質下降。本研究發(fā)現(xiàn)，采后褪黑素處理不影響乙烯釋放高峰出現(xiàn)時間，但明顯抑制了南果梨果實乙烯釋放速率。TangQi等研究發(fā)現(xiàn)，采后褪黑素處理顯著抑制了大棗果實乙烯釋放速率和呼吸速率。此外，褪黑素處理還能抑制芒果果實乙烯釋放速率，從而延緩果實衰老。本研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理對南果梨果實質量損失率沒有顯著影響（＞0.05），這與唐琦在大棗中的研究結果一致。由此推測，外源褪黑素可能改變了果實的生理代謝途徑，而對水分蒸騰沒有明顯的影響，但詳細的機理還需進一步研究。本研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素處理延緩了果實亮度的降低，抑制了值的上升和值的下降，同時，褪黑素處理還抑制了果實葉綠素a和葉綠素b含量的下降。由此說明，外源褪黑素能夠降低果實中葉綠素的降解速度，從而延緩果實的黃化。植物中，葉綠素在一系列降解酶的作用下逐步分解為無熒光葉綠素降解物，從而影響葉綠素含量及果實色澤變化。Tan Xiaoli等發(fā)現(xiàn)褪黑素處理菜心可以顯著延緩葉綠素分解，延緩其衰老進程。此外，外源褪黑素處理還能抑制采后青花菜、菜心的葉綠素降解和黃花率的升高。

有機酸在植物的生物和非生物脅迫中發(fā)揮重要作用，其含量是衡量果蔬營養(yǎng)品質的重要指標。褪黑素處理延緩了南果梨果實中可滴定酸質量分數(shù)的下降。草莓果實中的研究也發(fā)現(xiàn)，采后褪黑素處理保持了果實相對較高的可滴定酸水平。崔建潮等研究發(fā)現(xiàn)，采后碳酸氫鈉和碳酸鈉處理能夠延緩南果梨果實貯藏期間的果肉硬度和可溶性固形物質量分數(shù)的下降。此外，外源褪黑素處理還能降低果實的腐爛指數(shù)，抑制呼吸速率，延緩果實硬度的下降。淀粉降解是可溶性固形物含量增加的原因之一，褪黑素處理可能抑制了淀粉的降解過程。褪黑素處理還可以有效降低貯藏期間香菇的呼吸強度，延緩香菇子實體硬度和色澤的下降，維持香菇的外觀品質。

細胞壁降解酶催化果膠、半纖維素和纖維素等細胞壁組分降解是果實軟化的根本原因，細胞因中膠層溶解使細胞間產生空隙，導致果肉組織瓦解漿化。本研究發(fā)現(xiàn)，外源褪黑素顯著抑制了南果梨果實硬度下降（＜0.05），同時抑制了果膠物質、纖維素和半纖維素降解相關酶PG、PME、-glu和Cx的活力和基因表達。已有研究表明，褪黑素處理能通過延緩細胞壁多糖降解酶活力而抑制芒果果實軟化。果實后熟衰老過程中，PG參與果膠物質的降解，使細胞壁結構解體，導致果實軟化，-glu主要改變果膠分子相互作用，導致細胞壁的完整性下降。纖維素在Cx水解作用下破壞果實細胞壁網絡結構。海藻酸鈉/納米TiO（sodium alginate/nano-TiO，SA/TiO）復合涂膜處理與1-MCP和自發(fā)氣調包裝（modified atmosphere packaging，MAP）結合處理分別可以有效地抑制采后番木瓜和‘空心李’果實中PG、PME和Cx的活力，延緩不溶性果膠和纖維素的水解，保持較完整的細胞壁結構，從而維持果實硬度。劉帥民研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素處理有效緩解PME活力下降，延緩成熟過程中果實快速軟化。還有研究證明，外源褪黑素處理通過下調桃、梨果實中、和表達維持果實硬度，進而抑制果實軟化進程。不溶性果膠通過連接果實的細胞，來保持果實的硬度，但是隨著果實貯藏時間的延長，不溶性果膠逐漸向水溶性果膠轉化，造成果實細胞間松弛，引起果實軟化。外源褪黑素處理減緩了水溶性果膠產生的同時維持了不溶性果膠的含量。這與唐琦研究結果相似，褪黑素處理后的果實延緩了不溶性果膠質量分數(shù)下降，且抑制了水溶性果膠質量分數(shù)上升。這些結果表明，褪黑素處理延緩南果梨果實貯藏過程中硬度的下降與其抑制細胞壁降解酶活力的升高密切相關。

外源褪黑素處理明顯抑制南果梨果實乙烯的釋放，提高值，降低值，提高葉綠素含量，從而延緩果實黃化。褪黑素還通過抑制果實PME、PG、Cx和-glu的活力及基因表達，延緩不溶性果膠的降解和水溶性果膠質量分數(shù)的上升，從而保持較高的果實硬度。