陳小存，魏譚軍，陳飛，肖成，陳勇

（1.達州市中西醫(yī)結合醫(yī)院，達州 635000；2.成都地奧集團天府藥業(yè)有限公司，達州 635027）

陰虛胃痛顆粒由麥冬、北沙參、白芍等7 味中藥組成，具有養(yǎng)陰益胃、緩急止痛的功效，臨床上主要用于胃陰不足及慢性胃炎引起的胃脘隱隱灼痛、口干舌燥、納呆干嘔等病癥的治療[1]。現代研究表明陰虛胃痛顆粒聯合三聯療法對陰虛型慢性胃炎治療效果顯著，可明顯改善患者臨床癥狀，且不良反應較少[2]。

中藥及其制劑，尤其是中成藥復方制劑，由多味中藥材按照中醫(yī)基礎理論配伍組方而來，具有多成分-多靶點-多途徑的整體特點，不同成分的生物活性各異，方中藥物所含化學成分相互協同、相互制約以達到臨床治療效果?！吨腥A人民共和國藥典》（2020 年版）陰虛胃痛顆粒[1]項下僅對佐藥白芍所含芍藥苷進行定量測定，暫無對該制劑所含成分的文獻報道，難以全面反映陰虛胃痛顆粒的整體質量。本研究參考中藥質量標志物以君藥所含成分為首選，兼顧臣、佐、使藥成分的確認原則，選取君藥北沙參所含活性成分法卡林二醇和人參炔醇、麥冬所含特征成分麥冬甲基黃烷酮A 和甲基麥冬二氫高異黃酮B，以及佐藥白芍所含主要成分氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷為定量控制指標成分，采用高效液相一測多評（HPLC-QAMS）法對上述成分含量同時進行測定，建立陰虛胃痛顆粒多指標成分質量控制模式，以期全面評價陰虛胃痛顆粒的整體質量，指導藥品生產企業(yè)提升制劑的質量控制標準，完善制劑生產過程和原藥材來源質量控制，為指導臨床合理用藥提供基礎保障。

1 儀器與試藥

對照品芍藥苷（批號110736-202044，質量分數96.8%）來源于中國食品藥品檢定研究院；對照品氧化芍藥苷（批號PRF9040222，質量分數98.4%）、芍藥內酯苷（批號PRF8101147，質量分數98.6%）、苯甲酰芍藥苷（批號PRF8040621，質量分數97.2%）、麥冬甲基黃烷酮A（批號PRF8041122，質量分數99.9%）、甲基麥冬二氫高異黃酮B（批號PRF7102423，質量分數98.3%）、法卡林二醇（批號PRF9061222，質量分數99.4%）和人參炔醇（批號PRF8033144，質量分數98.5%）均來源于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司；陰虛胃痛顆粒（規(guī)格：每袋裝10 g，批號分別為20190501、20200221 和20200309）來源于遼寧華潤本溪三藥有限公司；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純。Agilent 1260 Infinity Ⅱ型高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）、島津LC-2030 型高效液相色譜儀（日本島津公司）；Agilent HC C18、Kromasil C18和Xtimate C18色譜柱（規(guī)格250 mm×4.6 mm，5 μm）；Quintix125D-1CN 型十萬分之一電子天平（德國賽多利斯公司）；CSA-10BT 型超聲波發(fā)生器（上海沙鷹科學儀器有限公司）。

2 方法與結果

2.1 混合對照品溶液的配制 各取氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇對照品適量，精密稱定，用稀乙醇制成1 mL 含氧化芍藥苷0.454 mg、芍藥內酯苷1.208 mg、芍藥苷3.516 mg、苯甲酰芍藥苷0.322 mg、麥冬甲基黃烷酮A 0.270 mg、甲基麥冬二氫高異黃酮B 0.138 mg、法卡林二醇0.212 mg 和人參炔醇0.396 mg 的混合對照品貯備液。精密吸取上述貯備液1.0 mL，用稀乙醇稀釋至25 mL，制成混合對照品溶液（氧化芍藥苷18.16 μg/mL、芍藥內酯苷48.32 μg/mL、芍藥苷140.64 μg/mL、苯甲酰芍藥苷12.88 μg/mL、麥冬甲基黃烷酮A 10.80 μg/mL、甲基麥冬二氫高異黃酮B 5.52 μg/mL、法卡林二醇8.48 μg/mL 和人參炔醇15.84 μg/mL）。

2.2 供試品溶液的配制 取陰虛胃痛顆粒適量，精密稱定研細后細粉2.0 g，加稀乙醇20 mL，對供試品超聲處理30 min，放冷并用稀乙醇稀釋至25 mL，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，續(xù)濾液作為陰虛胃痛顆粒供試品溶液。取按照陰虛胃痛顆粒質量標準處方比例和制法制備的缺白芍、缺麥冬、缺北沙參的陰性供試品各適量，按上述方法制得陰性供試品溶液。

2.3 色譜條件及系統(tǒng)適用性 色譜柱為Agilent HC C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），柱溫30 ℃；檢測波長分別為230 nm（0～25 min 測定氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷）[3-5]、296 nm（25～34 min 測定麥冬甲基黃烷酮A 和甲基麥冬二氫高異黃酮B）[6-7]和254 nm（34～55 min，測定法卡林二醇和人參炔醇）[8-9]；流動相為乙腈-0.1%磷酸，梯度洗脫（0～9 min，16.0%乙腈；9～25 min，16.0%→48.0%乙腈；25～34 min，48.0%A→55.0%乙腈；34 ～46 min，55.0%→78.0%乙腈；46 ～55 min，78.0%→16.0%乙腈），流速1.0 mL/min，進樣量10 μL。理論塔板數按各成分色譜峰計均應≥4 500。

2.4 方法學考察

2.4.1 專屬性 精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液及“2.2”項下溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄所測色譜圖，見圖1。結果顯示陰虛胃痛顆粒供試品溶液中氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇與相鄰色譜峰分離良好，分離度均＞1.5；所測指標成分色譜峰峰形對稱，拖尾因子符合《中華人民共和國藥典》規(guī)定；陰性供試品對陰虛胃痛顆粒中氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的同時測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖

2.4.2 線性關系 精密吸取“2.1”項下氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇混合對照品貯備液0.1、0.5、1.0、1.5、2.0 和2.5 mL，置于不同的20 mL 容量瓶中，用稀乙醇稀釋至20 mL 配制成6 個不同濃度的混合對照品溶液，各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積，以質量濃度（μg/mL）為X 軸，峰面積為Y 軸進行線性回歸分析，得回歸方程及線性范圍。見表1。

表1 陰虛胃痛顆粒中氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的回歸方程及線性范圍

2.4.3 日內精密度和日間精密度 精密吸取批號為20190501 的陰虛胃痛顆粒同一份供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積，重復操作6 次，測得8 種成分峰面積的RSD 值分別為1.11%、0.86%、0.53%、1.07%、1.20%、1.13%、0.99%和0.85%，表明該方法日內精密度良好；連續(xù)3 d，每日重復進樣3 次進行日間精密度考察，結果8 種成分峰面積的RSD 值分別為1.05%、0.79%、0.63%、1.20%、1.16%、1.19%、0.92%和1.07%，表明該方法日間精密度良好。

2.4.4 重復性 取批號為20190501 的陰虛胃痛顆粒6 份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積并計算各成分含量，結果8 種成分含量的RSD 值分別為1.08%、0.91%、0.60%、1.15%、1.19%、1.07%、1.02%和0.96%。

2.4.5 穩(wěn)定性 取批號為20190501 的陰虛胃痛顆粒同一份供試品溶液，于0、2、4、8、16 和24 h 各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積，結果陰虛胃痛顆粒供試品溶液24 h 內穩(wěn)定，8 種成分峰面積的RSD 值分別為1.82%、1.35%、0.96%、1.42%、1.80%、0.89%、1.74%和1.62%。

2.4.6 加樣回收率 取已知氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇含量的批號為20190501 的陰虛胃痛顆粒細粉9 份，每份1.0 g，精密稱定，隨機平分成3 組，每組精密加入混合對照品溶液（氧化芍藥苷0.242 mg/mL、芍藥內酯苷0.752 mg/mL、芍藥苷1.858 mg/mL、苯甲酰芍藥苷0.174 mg/mL、麥冬甲基黃烷酮A 0.130 mg/mL、甲基麥冬二氫高異黃酮B 0.058 mg/mL、法卡林二醇0.114 mg/mL、人參炔醇0.218 mg/mL）0.8、1.0 和1.2 mL，使加入量與所取陰虛胃痛顆粒中各目標成分含量之比約控制在0.8∶1、1∶1 和1.2∶1，再按“2.2”項下方法制備成加樣供試品溶液。各精密吸取10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積并計算各成分加樣回收率及RSD 值。結果表明陰虛胃痛顆粒中8 種成分的平均加樣回收率及RSD分別為98.90%（1.01%）、100.02%（0.94%）、99.52%（0.76%）、97.88%（1.35%）、99.14%（1.42%）、96.85%（0.65%）、97.83%（0.92%）和98.65%（1.24%）。

2.5 HPLC-QAMS 法的質量評價模式建立

2.5.1 建立相對校正因子（RCF） 精密吸取“2.4.2”項6 個不同濃度的混合對照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積，用質量濃度與峰面積之比計算各成分校對因子，將待測成分與內參物的校正因子之比計算為各成分的RCF，即RCFk/s=fk/fs=（Wk/Ak）/（Ws/As）=（Wk×As）/（Ws×Ak），f、W 和A 分別代表RCF、質量濃度和峰面積，k、s 分別代表其他待測成分及內參物。以芍藥苷為內參物，根據上述公式分別計算得芍藥苷對氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的RCF。見表2。

表2 芍藥苷對氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的RCF

2.5.2 不同儀器及色譜柱對RCF 的影響 在不同儀器（Agilent 1260 Infinity Ⅱ型和島津LC-2030 型高效液相色譜儀）和色譜柱（Agilent HC C18、Kromasil C18和Xtimate C18柱）條件下，精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積，計算得芍藥苷對氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的RCF。見表3。

表3 不同儀器及色譜柱對RCF 的影響

2.5.3 不同流速對RCF 的影響 在不同流速（0.8、0.9、1.0、1.1 和1.2 mL/min）條件下，精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積，計算得芍藥苷對氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的RCF。見表4。

表4 不同流速對RCF 的影響

2.5.4 不同柱溫對RCF 的影響 在不同柱溫（28、29、30、31 和32 ℃）條件下，精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積，計算得芍藥苷對氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的RCF。見表5。

2.5.5 色譜峰定位 待測物色譜峰的準確定位是HPLC-QAMS 法可行性的基礎，在不同儀器（Agilent 1260 Infinity Ⅱ型和島津LC-2030 型高效液相色譜儀）和色譜柱（Agilent HC C18、Kromasil C18和Xtimate C18柱）條件下，精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中進樣檢測，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇色譜峰的保留時間，將待測成分與內參物保留時間之比計算各成分的相對保留時間值（RRT），計算得芍藥苷對氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的RRT。見表6。

表6 不同儀器及色譜柱對RRT 的影響

2.6 HPLC-QAMS 法與外標法（ESM）測定結果的比較 為驗證所建立的HPLC-QAMS 方法的準確性和可行性，各取3 個批次的陰虛胃痛顆粒適量，按“2.2”項方法制備陰虛胃痛顆粒供試品溶液（每個批次平行制備3 份），各精密吸取上述供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀中，記錄氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的峰面積，分別采用ESM 和HPLC-QAMS 法計算陰虛胃痛顆粒中氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的含量，并采用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件對兩種方法檢測結果進行分析，結果顯示兩種方法所得結果無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）。見表7。

表7 陰虛胃痛顆粒中氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的ESM 和HPLC-QAMS 法含量測定結果（n=3）mg/g

3 討論

陰虛胃痛顆粒由白芍、麥冬、北沙參、石斛、玉竹、川楝子和炙甘草組方而來，北沙參養(yǎng)陰清肺、益胃生津，麥冬養(yǎng)陰生津、潤肺清心，合為君藥；石斛益胃生津、滋陰清熱，玉竹養(yǎng)陰潤燥、生津止渴，共為臣藥；白芍養(yǎng)血斂陰、柔肝止痛，川楝子疏肝泄熱、行氣止痛，合為佐藥；炙甘草補脾和胃、益氣復脈、調和諸藥，為使藥。7 味中藥材所含化學成分相互協調、相互制約，共達養(yǎng)陰益胃、緩急止痛的臨床功效。為全面評價陰虛胃痛顆粒的整體質量，本研究參考中藥質量標志物的確認原則[10]，以君藥所含成分為首選，兼顧臣、佐、使藥所含成分，選取君藥北沙參活性成分法卡林二醇和人參炔醇、麥冬特征成分麥冬甲基黃烷酮A 和甲基麥冬二氫高異黃酮B，以及佐藥白芍主要成分氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷8 種成分進行定量控制研究。內參物的選擇對所建立HPLC-QAMS 法的準確性和可行性至關重要，本研究選取成分較為穩(wěn)定、樣品中含量較高、價格低廉易得、出峰時間適中的芍藥苷為內參物。

以陰虛胃痛顆粒中目標成分氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的分離效果為主要考察指標，兼顧分析檢測用時、色譜圖基線平穩(wěn)等因素，考察了不同流動相洗脫系統(tǒng)，結果顯示乙腈-水[6-7，9]優(yōu)于甲醇-水流動相洗脫，但目標成分氧化芍藥苷、人參炔醇達不到有效分離。以乙腈為有機相，參考文獻報道對乙腈-0.1%磷酸溶液[3-5]、乙腈-0.1%甲酸溶液[7-8]進行對比考察，選取乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，通過對流動相中有機相和水相比例的不斷摸索，最終確定以“2.3”項下的梯度洗脫程序對陰虛胃痛顆粒中氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇含量同時進行檢測。結果提示在此條件下，各成分分離效果較好，色譜圖基線平穩(wěn)，雜質對目標成分的測定干擾較小。本實驗在處理陰虛胃痛顆粒供試品溶液時，依次考察了甲醇[6]、70%甲醇[7]、稀乙醇[3-5，8]等提取溶劑以及超聲[3-9]和加熱回流提取兩種提取方式，以氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇的綜合提取率為首要指標，兼顧雜質干擾程度，最終確定以稀乙醇超聲處理30 min 對陰虛胃痛顆粒進行供試品制備。

4 結論

自“2.6”項下氧化芍藥苷、芍藥內酯苷、芍藥苷、苯甲酰芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、甲基麥冬二氫高異黃酮B、法卡林二醇和人參炔醇含量檢測結果可以看出，HPLC-QAMS 法的計算結果與外標法實測值之間無明顯差異，表明本研究所建立的HPLC-QAMS法結果準確，可用于對陰虛胃痛顆粒中8 種指標成分的同時測定，能夠作為陰虛胃痛顆粒多指標成分的質量控制方法。同時也反映出8 種目標成分存在一定的批間差異，尤其氧化芍藥苷、麥冬甲基黃烷酮A、法卡林二醇和人參炔醇含量差異較為明顯，表明多指標成分的質量控制對穩(wěn)定陰虛胃痛顆粒產品質量、確保臨床用藥療效一致性具有重要意義，有助于藥品生產企業(yè)和監(jiān)管部門不斷提升陰虛胃痛顆粒的質量控制標準，建立健全該制劑原藥材來源及內控質量標準，不斷細化完善制劑生產過程的操作參數控制，以期保證陰虛胃痛顆粒產品質量穩(wěn)定，為指導臨床合理用藥提供有效參考依據。