于瑞麗，周雅婷，張玥，2，于英莉，2，周昆，2

（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，天津 301617；2.天津市中藥藥理學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 301617）

補(bǔ)骨脂是豆科植物補(bǔ)骨脂（Psoralea corylifolia L.）的干燥成熟果實(shí)，為臨床常用中藥，其味辛、苦、性溫，具有補(bǔ)腎助陽(yáng)、消風(fēng)祛斑及溫脾止瀉等功效[1]。補(bǔ)骨脂被應(yīng)用于許多中成藥中，如二神丸、壯骨關(guān)節(jié)丸、仙靈骨葆等方中均含有補(bǔ)骨脂。然而如果補(bǔ)骨脂在臨床中用藥不當(dāng)、過(guò)量或長(zhǎng)期用藥也會(huì)引起肝毒性[2]、光毒性[3]、腎毒性[4]等危害。性別差異是導(dǎo)致藥物有效性、安全性出現(xiàn)個(gè)體差異的重要因素之一[5]。目前雖然有關(guān)于補(bǔ)骨脂毒性的研究報(bào)道，但對(duì)補(bǔ)骨脂毒性的性別差異研究還未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究對(duì)補(bǔ)骨脂的3 種主要成分（補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素、補(bǔ)骨脂酚）對(duì)雌雄小鼠的急性毒性作用進(jìn)行比較，探討其可能存在的性別差異。

1 材料

1.1 藥物與儀器 補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素（純度＞98%，批號(hào)201502）購(gòu)于天津市月牙湖科技有限公司，補(bǔ)骨脂酚（純度＞98%，批號(hào)2018041103）購(gòu)于成都普菲德生物技術(shù)有限公司。JA1003 電子分析天平購(gòu)于上海恒平科技儀器有限公司，LT1000B 電子天平購(gòu)于常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司。

1.2 動(dòng)物 SPF 級(jí)ICR 小鼠，雌雄各半，4～6 周齡，體質(zhì)量18～20 g，購(gòu)于北京華阜康生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（京）2014-0004。動(dòng)物飼養(yǎng)于天津中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心，環(huán)境溫度20～25 ℃，濕度40%～60%，自由攝食和飲水，光暗周期為12 h。實(shí)驗(yàn)前12 h 禁食，自由飲水。

2 方法

2.1 急性毒性實(shí)驗(yàn)方法 前期研究發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素劑量為633 mg/kg 時(shí)死亡的雄性小鼠較多，并且預(yù)實(shí)驗(yàn)中雄性小鼠劑量為633 mg/kg 時(shí)3 只小鼠全部死亡[6]。最終，本研究中各受試藥劑量設(shè)置為：補(bǔ)骨脂素組雌性組（1 125、843、633、475、356 mg/kg）、雄性組（633、475、356、267、200 mg/kg），異補(bǔ)骨脂素組雌性組（404、343、292、248、210 mg/kg）、雄性組（317、292、269、248、229 mg/kg），補(bǔ)骨脂酚組雌性組和雄性組（2 000、1 765、1 500、1 200、1 020 mg/kg）。280 只ICR 小鼠根據(jù)體質(zhì)量隨機(jī)分組，除補(bǔ)骨脂酚2 000、1 020 mg/kg 劑量組為雌雄各5 只，其他劑量組及對(duì)照組均為雌雄各10 只。給藥前，小鼠禁食不禁水12 h。對(duì)小鼠進(jìn)行0.4 mL/10 g 體積灌胃給藥處理，一次性給藥。連續(xù)觀察給藥后2 周小鼠毒性反應(yīng)和死亡情況，并于給藥后的第1、3、7、14 天測(cè)量存活小鼠體質(zhì)量。

2.2 統(tǒng)計(jì)分析方法 應(yīng)用SPSS 11.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，采用Probit 回歸法計(jì)算半數(shù)致死量（LD50）、最小中毒量（LD5）數(shù)值和95%可信區(qū)間，采用GraphPad Prism 5 軟件生成生存曲線。

3 結(jié)果

3.1 補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及補(bǔ)骨脂酚給藥期間小鼠的行為和體質(zhì)量變化 對(duì)照組小鼠在給藥后2 周內(nèi)均活動(dòng)自如，無(wú)異常，無(wú)死亡；補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及補(bǔ)骨脂酚給藥組小鼠偶有出現(xiàn)四肢強(qiáng)直、抽搐、口眼周有分泌物、心率減慢乃至死亡的現(xiàn)象。與對(duì)照組比較，補(bǔ)骨脂素組的雌性小鼠在給藥3 d 后，體質(zhì)量均出現(xiàn)下降，并于給藥14 d 后體質(zhì)量略有回升。雄性小鼠除了低劑量組外，體質(zhì)量均呈上升趨勢(shì)，低劑量組給藥14 d 后體質(zhì)量下降。異補(bǔ)骨脂素組中，雌雄小鼠的體質(zhì)量與對(duì)照組比較均降低，并于14 d 后出現(xiàn)回升，其中雌性小鼠劑量為248 mg/kg組的體質(zhì)量維持在較低水平且未見(jiàn)回升，而雄性各給藥組小鼠體質(zhì)量升高至正常水平。與對(duì)照組比較，補(bǔ)骨脂酚各給藥劑量對(duì)雌雄小鼠體質(zhì)量并無(wú)顯著影響。見(jiàn)圖1。

圖1 補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚給藥14 d 小鼠體質(zhì)量

3.2 補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素及補(bǔ)骨脂酚的LD50實(shí)驗(yàn)結(jié)果 補(bǔ)骨脂素對(duì)小鼠的急性毒性在雄性表現(xiàn)更明顯，其中356 mg/kg 時(shí)雌性小鼠的死亡率為10%，而雄性小鼠的死亡率達(dá)30%。補(bǔ)骨脂素雌性小鼠LD50為514.35 mg/kg，95%可信區(qū)間為422.63～602.14 mg/kg；雄性小鼠LD50為421.37 mg/kg，95%可信區(qū)間為313.81～746.14 mg/kg。見(jiàn)表1。

表1 補(bǔ)骨脂素灌胃給藥LD50 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

異補(bǔ)骨脂素對(duì)雌雄小鼠的急性毒性并無(wú)明顯性別差異，異補(bǔ)骨脂素雌性小鼠LD50為258.02mg/kg，95%可信區(qū)間為224.24～284.99 mg/kg；雄性小鼠LD50為255.26 mg/kg，95%可信區(qū)間為227.28～273.37 mg/kg。見(jiàn)表2。

表2 異補(bǔ)骨脂素灌胃給藥LD50 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

補(bǔ)骨脂酚對(duì)雌性和雄性小鼠急性毒性也有較大差異，在2 000 mg/kg 劑量下死亡率分別為40%、100%。補(bǔ)骨脂酚雌性小鼠LD50 大于2 000 mg/kg，雄性小鼠LD50為1 679.40 mg/kg，95%可信區(qū)間為1 480.00～2 189.29 mg/kg。見(jiàn)表3。

表3 補(bǔ)骨脂酚灌胃給藥LD50 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

以對(duì)數(shù)劑量為橫坐標(biāo)，給藥后小鼠響應(yīng)概率為縱坐標(biāo)，分別作出補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素以及補(bǔ)骨脂酚的Probit 回歸曲線。其中補(bǔ)骨脂素雌性小鼠的曲線方程為Y=-17.9+2.86X，R2=0.967，雄性小鼠的曲線方程為Y=-8.14+1.35X，R2=0.866；異補(bǔ)骨脂素組中雌性小鼠的曲線方程為Y=-22.7+4.07X，R2=0.834，雄性小鼠的曲線方程Y=-32.47+5.86X，R2=0.924；補(bǔ)骨脂酚組雌性小鼠的曲線方程為Y=-16.86+2.2X，R2=0.942，雄性小鼠的曲線方程為Y=-11.61+1.52X，R2=0.998。根據(jù)公式可外推出，補(bǔ)骨脂素的雌性小鼠LD5為294.02 mg/kg，95%可信區(qū)間為157.44～373.55 mg/kg，而雄性小鼠LD5僅為124.04 mg/kg，95%可信區(qū)間為9.25～203.4 mg/kg。但由于置信區(qū)間較寬，兩者之間差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，從補(bǔ)骨脂酚2 000 mg/kg 劑量時(shí)雌雄小鼠的生存曲線也可以看出雌雄小鼠的毒性反應(yīng)存在一定差異。見(jiàn)圖2。

圖2 補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚的Probit 回歸曲線及補(bǔ)骨脂酚的生存曲線

4 討論

在實(shí)驗(yàn)中對(duì)補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚的給藥毒性進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)雌雄小鼠的毒性表現(xiàn)極為相似，提示不同性別動(dòng)物對(duì)藥物的毒性反應(yīng)機(jī)制可能無(wú)明顯差別。另外，無(wú)論雌性還是雄性小鼠，異補(bǔ)骨脂素的急性毒性都明顯強(qiáng)于補(bǔ)骨脂素和補(bǔ)骨脂酚，LD50和LD5遠(yuǎn)低于后兩者。

從3 條Probit 回歸曲線可發(fā)現(xiàn)，受試藥在不同性別動(dòng)物的曲線斜率不同。補(bǔ)骨脂素和異補(bǔ)骨脂素，高劑量組和低劑量組具有相反的性別差異，補(bǔ)骨脂素在低劑量時(shí)，雌性的耐受性強(qiáng)于雄性，而高劑量時(shí)雄性的耐受性相比于雌性略強(qiáng)；異補(bǔ)骨脂素在低劑量時(shí)，雄性的耐受性略強(qiáng)于雌性，而高劑量時(shí)雌性的耐受性強(qiáng)于雄性；補(bǔ)骨脂酚在高、中、低劑量中都表現(xiàn)為雌性的耐受性強(qiáng)于雄性。根據(jù)Probit回歸曲線可以計(jì)算補(bǔ)骨脂素給藥的LD5，并作為其最小致死量進(jìn)行比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，盡管補(bǔ)骨脂素的雌性小鼠LD50值僅高出雄性小鼠22%，但由于毒性-劑量曲線斜率差異較大，根據(jù)公式可推算雌性小鼠LD5為294.02 mg/kg，而雄性小鼠LD5僅為124.04 mg/kg，補(bǔ)骨脂素雌性小鼠LD5值高出雄性小鼠137%。盡管這種根據(jù)回歸曲線推算的方式不夠準(zhǔn)確，但其結(jié)果也有一定的提示作用，該計(jì)算結(jié)果表明，雌雄動(dòng)物口服補(bǔ)骨脂素出現(xiàn)毒性的最小劑量差異較大，在臨床使用中應(yīng)予以充分注意。

隨著臨床醫(yī)學(xué)進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)療時(shí)代，性別差異在藥物研究中越來(lái)越被關(guān)注。研究表明激素水平可以影響生理狀態(tài)，從而導(dǎo)致藥物在吸收、蛋白結(jié)合率、分布容積及代謝方面出現(xiàn)女性與男性不同的情況[5]。雌激素與各種酶或受體的相互作用還可能減弱或增強(qiáng)配伍藥物的作用，甚至是毒副作用[7]。肝藥酶在藥物代謝過(guò)程中發(fā)揮重要作用，而有研究發(fā)現(xiàn)，婦女在肝臟中有更多的肝藥酶[8]。因此合理判斷性別差異對(duì)藥物療效、安全性的影響是至關(guān)重要的。補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)脂素和補(bǔ)骨脂酚是補(bǔ)骨脂藥材的重要活性成分[9]，這3 個(gè)成分在補(bǔ)骨脂的藥效和毒性中有重要作用。本實(shí)驗(yàn)比較補(bǔ)骨脂素、異補(bǔ)骨脂素以及補(bǔ)骨脂酚急性毒性的性別差異發(fā)現(xiàn)，補(bǔ)骨脂素在較低劑量下的毒性存在較為明顯的性別差異，而補(bǔ)骨脂酚大劑量時(shí)也表現(xiàn)出一定性別差異。本研究?jī)H研究了補(bǔ)骨脂急性毒性時(shí)期的性別差異，尚需進(jìn)一步研究和探討其長(zhǎng)期用藥毒性的性別差異，才可能更好地為臨床上不同性別人群合理選擇藥物劑量、減少藥物不良反應(yīng)提供研究基礎(chǔ)，為提高用藥水平提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

5 結(jié)論

補(bǔ)骨脂素對(duì)雌性小鼠的LD5值高出雄性小鼠137%，盡管差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但仍提示補(bǔ)骨脂素在雄性的最小毒性劑量低于雌性，其毒性具有潛在的性別差異可能。