張文剛，蘭永麗，黨 斌，張 杰，楊希娟

(青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海省青藏高原農(nóng)產(chǎn)品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青藏高原種質(zhì)資源研究與利用實(shí)驗(yàn)室，省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海大學(xué)，青海 西寧 810016)

藜麥(ChenopodiumquinoaWilld.)為一年生雙子葉“假谷物”，亦稱南美藜、奎奴亞藜、藜谷等，在我國山西、青海、西藏、甘肅、云南、浙江、吉林等地均有分布[1]。藜麥富含蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、膳食纖維、礦物質(zhì)、維生素、皂苷和多酚等成分，可滿足人體基本的營養(yǎng)需求，并在預(yù)防癌癥、心血管疾病、炎癥等方面具有突出優(yōu)勢，被國際營養(yǎng)學(xué)家稱為“超級谷物”[2]。鑒于其食用和藥用價(jià)值，藜麥活性成分的分離純化及功能特性研究、相關(guān)食品開發(fā)引起了國內(nèi)外學(xué)者的廣泛關(guān)注[3]。花青素(Anthocyanidins)屬于黃酮醇類化合物，色澤鮮亮，無特殊氣味，食用安全，具有清除自由基、護(hù)肝、降血脂、抗突變等特點(diǎn)，是谷物一類重要的天然抗氧化物質(zhì)[4]。藜麥有紅、白、黑等不同粒色，而花青素可能是除甜菜素外賦予籽粒顏色的關(guān)鍵化合物，掌握彩色藜麥花青素的提取與利用對探究藜麥的保健功能具有重要意義[5]。花青素的提取方法較多，包括溶劑萃取法、酶水解法、樹脂法、超聲萃取法和微波法等[6-8]。其中溶劑萃取法是提取花青素的傳統(tǒng)方法，常選用甲醇、乙醇、石油醚、乙酸乙酯等作為有機(jī)溶劑，鹽酸、磷酸、醋酸、檸檬酸等作為酸化劑。該方法操作簡單，萃取效率和純度較高，在花青素富集中應(yīng)用廣泛[9-11]。目前，有關(guān)不同粒色藜麥花青素分離提取的研究較少。因此，本研究以青白藜1號(白藜麥)、青藜2號(黑藜麥)和貢扎4號(紅藜麥)為試驗(yàn)材料，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析法探討溶劑體系、提取參數(shù)等對不同粒色藜麥花青素提取的影響，為藜麥花青素的制備和開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

青白藜1號(白藜麥)、青藜2號(黑藜麥)和貢扎4號(紅藜麥)由青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院作物所提供；矢車菊素-3-O-葡萄糖苷標(biāo)準(zhǔn)品(美國Sigma公司)；醋酸鈉、醋酸、氯化鉀、鹽酸、磷酸、檸檬酸、乳酸、硫酸、乙酸、甲醇、無水乙醇、丙酮等(天津科密歐試劑公司)。

1.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

FW200高速中藥粉碎機(jī)(天津華鑫儀器廠)；N4S型紫外可見分光光度計(jì)(上海儀電分析儀器有限公司)；TGL-20M型高速冷凍離心機(jī)(湘儀離心機(jī)儀器有限公司)；PHS-3C型pH計(jì)(上海雷磁儀器廠)；SHA-C型恒溫振蕩器(國華電器有限公司)。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 花青素的提取 藜麥籽粒除雜、清洗后45 ℃烘干，粉碎過60目篩。稱取1.000 g藜麥粉置于50 mL離心管，加入酸化乙醇，混合均勻后在一定溫度下浸提，12 000 r/min、4 ℃ 離心10 min，收集上清液。

1.3.2 單因素試驗(yàn) 以花青素提取量為指標(biāo)，探討溶劑(水、60%甲醇、60%乙醇、60%丙酮，V/V)、溶劑體積分?jǐn)?shù)(20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%)、酸化劑(鹽酸、磷酸、檸檬酸、乳酸、硫酸、乙酸，4 mol/L)、pH(3.0、4.0、5.0、6.0、7.0)、料液比(1∶2、1∶4、1∶6、1∶9、1∶12、1∶15、1∶18、1∶21、1∶24 g/mL)、浸提溫度(20、30、40、50、60、70、80 ℃)及浸提時(shí)間(20、40、60、90、120、150、180 min)對提取藜麥花青素的影響。各因素固定條件：60%乙醇，鹽酸，pH 4.0，料液比1∶4 g/mL、浸提溫度50 ℃，浸提時(shí)間60 min。

1.3.3 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以藜麥花青素提取量為響應(yīng)值，選擇料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間為因素，采用Design-Expert 11軟件進(jìn)行Box-Behnken三因素三水平響應(yīng)面設(shè)計(jì)(表1)。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平設(shè)計(jì)Tab.1 Design of factors and levels of response surface test

1.3.4 藜麥花青素含量的測定 利用雙波長pH示差法[12]測定花青素含量。取1 mL花青素提取液，加入9 mL 0.4 mol/L、pH 4.5的NaAc-HAc緩沖液或0.25 mol/L、pH 1.0的KCl-HCl緩沖液，混合均勻后倒入1 mL比色皿，以蒸餾水替代樣品作空白對照，分別在510 nm和700 nm下測定光密度(optical density，OD)。

花青素提取量(μg/g)=A×Mw×DF×V/(ε×1×W)

式中：A=(OD510 nm，pH 1.0-OD700 nm，pH1.0)-(OD510 nm，pH 4.5-OD700 nm，pH 4.5)，Mw為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾質(zhì)量 449.2 g/mol，DF為待測液稀釋倍數(shù)，V是提取液體積(mL)，ε為矢車菊素-3-O-葡萄糖苷摩爾消光系數(shù)26 900 L/(mol·cm)，W為藜麥粉干重(g)。

1.3.5 紅外光譜分析 采用KBr壓片法[10]測試藜麥花青素紅外光譜。取藜麥花青素提取物粉末與干燥KBr混合均勻，壓片后在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)、分辨率4 cm-1條件下掃描紅外光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 提取溶劑的影響 由圖1a可知，藜麥粒色不同，所適宜的酸化劑也有差異。白藜麥提取量為乙酸>硫酸>磷酸，黑藜麥提取量為磷酸>檸檬酸>乳酸，紅藜麥提取量為檸檬酸>乳酸>磷酸。為便于操作，選擇對三種粒色藜麥花青素提取量均較高的磷酸作為優(yōu)選酸化劑。由圖1b看出，不同溶劑對藜麥花青素提取效果均表現(xiàn)為乙醇>甲醇>丙酮>水，乙醇顯著高于其他溶劑(P<0.05)。因此，選擇乙醇溶液作為最適提取溶劑。

圖1 提取溶劑對花青素提取量的影響Fig.1 Effects of extraction solvent on anthocyanins extraction

2.1.2 不同提取條件的影響 由圖2a可知，藜麥花青素提取量隨乙醇體積分?jǐn)?shù)的增大先增大后減小，乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%時(shí)藜麥花青素提取量達(dá)到最大值。圖2b表明，藜麥花青素提取量隨著溶劑pH的升高而降低，pH為3.0時(shí)花青素提取量最大。圖2c表明，藜麥花青素提取量隨料液比的減小先增大后減小，料液比為1∶6 g/mL時(shí)效果最佳。圖2d表明，藜麥花青素提取量隨溫度的升高先增大后減小，50 ℃時(shí)提取量最大。圖2e表明，藜麥花青素提取量隨浸提時(shí)間的延長先增大后減小，浸提時(shí)間為120 min時(shí)提取量最大。

圖2 提取參數(shù)對花青素提取量的影響Fig.2 Effects of extraction parameters on anthocyanins extraction

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 試驗(yàn)結(jié)果 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果見表2。經(jīng)二次多項(xiàng)式回歸擬合并在α=0.05水平剔除不顯著項(xiàng)，得出藜麥花青素提取量與各編碼因素間的方程：

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of response surface test

白藜麥：YW=49.61-1.51X2+2.93X1X2-3.00X2X3-4.82X12-2.41X22-3.92X32

黑藜麥：YB=51.82+1.26X1-2.03X2+1.63X3-2.08X1X3-2.75X12-3.72X22-3.27X32

紅藜麥：YR=49.73+1.76X1-1.05X2+1.51X2X3-3.98X12-3.06X22-1.71X32

由表3可知，不同粒色藜麥花青素提取擬合模型的P<0.01，表明建立的模型極顯著。失擬項(xiàng)均不顯著(P>0.05)，方程擬合度高。模型R2為0.954 1～0.964 4，說明響應(yīng)值的95.41%～96.44%來自所選變量。RAdj2為0.871 5～0.900 3，說明模型可解釋87.15%～90.03%的響應(yīng)值變化。C.V.值為2.50%～3.46%，表明試驗(yàn)受外界因素影響較小。根據(jù)一次項(xiàng)P值可知，各因素影響主次順序具體為X2>X3>X1(白藜麥)、X2>X3>X1(黑藜麥)、X1>X2>X3(紅藜麥)。

表3 二次模型方差分析Tab.3 Variance analysis of quadratic model

表3(續(xù))

2.2.2 交互作用分析 由圖3可知，藜麥花青素提取量隨料液比、浸提溫度和時(shí)間的增大先增大后減小，效應(yīng)曲面均較陡。由圖3A、圖3B、圖3C可知，溫度對效應(yīng)曲面的影響更明顯，依次為浸提溫度>浸提時(shí)間>料液比，與表3結(jié)果一致。由圖3D、圖3E、圖3F浸提溫度對效應(yīng)曲面彎曲程度的影響最大，控制好浸提溫度對黑藜麥花青素提取較為關(guān)鍵。從圖3G、圖3H、圖3I看出，料液比對紅藜麥花青素提取量的影響最大，表現(xiàn)為圖3G和圖3H曲面陡峭，圖3C較為平緩，各因素影響順序?yàn)榱弦罕?浸提溫度>浸提時(shí)間。此外，由圖3A～圖3I的等高線形狀和密集度可知，白藜麥X1X2交互作用明顯，X2X3次之；圖E中橢圓明顯，表明黑藜麥X1X3交互作用顯著；紅藜麥X2X3交互作用顯著。

圖3 各因素交互作用對三種粒色藜麥花青素提取量的影響Fig.3 Effects of interaction of various factors on anthocyanins extraction from three colors of Chenopodium quinoa Willd.

2.2.3 試驗(yàn)驗(yàn)證 由回歸方程預(yù)測的白藜麥、黑藜麥、紅藜麥花青素最佳提取參數(shù)分別為料液比6.25∶1、6.69∶1、7.11∶1 mL/g，浸提溫度46.10、47.40、47.66 ℃，浸提時(shí)間90.78、98.92、86.29 min，預(yù)測提取量49.88、52.34、49.47 μg/g。為便于操作，將各參數(shù)修正為料液比6.3∶1、6.7∶1、7.0∶1 g/mL，浸提溫度49.0、47.0、48.0 ℃，提取時(shí)間90、100、85 min，得到3種粒色藜麥花青素平均提取量為49.15、52.27、49.06 μg/g，與響應(yīng)預(yù)測值基本接近，表明建立的模型可行。

2.3 紅外光譜分析

由圖4可知，藜麥花青素提取物的紅外光譜特征峰基本一致，集中在800～500 cm-1指紋區(qū)和1 700～1 000 cm-1高頻區(qū)。3 376 cm-1的強(qiáng)吸收由花青素分子中締合態(tài)酚羥基產(chǎn)生，2 926 cm-1處為飽和—C—H的反對稱伸縮，對應(yīng)烷基—CH3，而2 855 cm-1處是飽和—C—H的對稱伸縮，對應(yīng)結(jié)構(gòu)為—CH2；1 680～1 450 cm-1是芳香環(huán)的飽和骨架振動(dòng)，1 728 cm-1的吸收峰由C=O 引起，1 300～1 000 cm-1屬于醇、酚等C—O的伸縮振動(dòng)，其中1 055 cm-1和1 236 cm-1可能是花青素分子中C—O—C的伸縮振動(dòng)980～650 cm-1的吸收峰由O—H的面內(nèi)外彎曲振動(dòng)引起[10，13]。綜上所述，藜麥花青素是具有醇羥基和酚羥基的芳環(huán)結(jié)構(gòu)化合物。

圖4 藜麥花青素提取物的紅外光譜圖Fig.4 Infrared spectrogram of anthocyanins extract from Chenopodium quinoa Willd.

3 討論與結(jié)論

研究藜麥花青素的提取可為藜麥資源的功能化開發(fā)與利用提供一定的理論依據(jù)，前人主要對藜麥中甜菜素類色素成分做了初步探究。Escribano等[14]發(fā)現(xiàn)4種甜菜黃素是橙黃色藜麥籽粒顏色形成的重要原因。Laqui-Vilca等[15]優(yōu)化了藜麥殼中甜菜花青素和甜菜黃素的超聲輔助提取工藝。除甜菜素外，花青素也是賦予籽粒顏色特征的關(guān)鍵成分，但目前有關(guān)藜麥花青素的提取和分析鮮有研究。因此，本文以青白藜1號(白藜麥)、青藜2號(黑藜麥)和貢扎4號(紅藜麥)為試驗(yàn)材料，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)和響應(yīng)面分析探討溶劑體系、提取參數(shù)等對藜麥花青素提取影響，并得到如下結(jié)論：

(1)三種不同粒色藜麥中，黑藜麥花青素更為豐富。影響白藜麥和黑藜麥花青素提取量的因素主次順序?yàn)榻釡囟取⒔釙r(shí)間和料液比，而影響紅藜麥花青素提取量的因素主次順序?yàn)榱弦罕?、浸提溫度和浸提時(shí)間。

(2)優(yōu)化得到的藜麥花青素提取條件為磷酸作酸化劑、70% pH 3.0的乙醇作溶劑、料液比6.3～7.0 g/mL、浸提溫度47～49 ℃、浸提時(shí)間85～100 min，花青素提取量達(dá)到49.06～52.27 μg/g，與模型預(yù)測結(jié)果較為一致。