王 寶，謝占玲 ，戴大日，毛玉晶，王曉芳，鄭秀娟

(青海大學(xué)生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，青海 西寧 810016)

黃綠卷毛菇(Floccularialuteovirens)隸屬于擔(dān)子菌門(Basidiomycota)、傘菌綱(Agaricomycetes)、傘菌目(Agaricales)、傘菌科(Agaricaceae)、卷毛菇屬(Floccularia)，是一種在青藏高原獨(dú)特的地理環(huán)境和氣候條件下孕育而生的優(yōu)良藥用和食用真菌[1]，又被稱為黃蘑菇、黃環(huán)菇[2]。

食用菌菌絲的顯微結(jié)構(gòu)通常包括菌絲寬度和是否存在鎖狀聯(lián)合及有無橫隔等，菌絲在不同培養(yǎng)條件下，其長勢、色澤等菌落形態(tài)特征存在一定差別，同時(shí)顯微結(jié)構(gòu)也會(huì)發(fā)生細(xì)微變化[3]。陳少珍等[4]以野生黃傘純培養(yǎng)菌絲為試驗(yàn)材料研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)實(shí)菌株的菌絲是具有鎖狀聯(lián)合的雙核菌絲，而非結(jié)實(shí)菌株的菌絲較細(xì)，生長較慢，成熟時(shí)不產(chǎn)生色素，菌絲顏色為白色或淺黃色；張琦等[5]研究發(fā)現(xiàn)，干巴菌菌絲分枝較多，有膈膜，無鎖狀聯(lián)合，未觀察到無性孢子；熊杰等[6]對茯苓菌株進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，茯苓菌絲為少分枝、有隔膜、無鎖狀聯(lián)合的多核菌絲。趙桂云等[7]通過對14種食用菌菌絲形態(tài)的觀察發(fā)現(xiàn)，滑菇等12種食用菌的菌絲有鎖狀聯(lián)合，蛹蟲草等2種食用菌有分生孢子。

目前，對于真菌菌絲顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察的相關(guān)文獻(xiàn)較多，但對顯微結(jié)構(gòu)與真菌菌絲體長勢的研究則較少。為研究黃綠卷毛菇是否可以通過形成雙核菌絲進(jìn)行有性生殖以及黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯(lián)合數(shù)量之間的關(guān)系，本文以8個(gè)黃綠卷毛菇菌株為研究對象，通過對其菌絲體進(jìn)行顯微結(jié)構(gòu)觀察，研究了黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯(lián)合數(shù)量之間的相關(guān)性，以期為黃綠卷毛菇優(yōu)良菌株的篩選及黃綠卷毛菇人工栽培的實(shí)現(xiàn)提供理論基礎(chǔ)和科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

(1)供試菌株。供試菌株為黃綠卷毛菇菌株HNHXF7、TJ、F18-2、F18-3、DTS10、DTS13、SJC6、WRQ18。

(2)培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，20 g瓊脂粉，1.5 g Mg2SO4·7H2O，3 g KH2PO4，10 mg維生素B1，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.0。液體培養(yǎng)基：200 g馬鈴薯，20 g葡萄糖，1.5 g Mg2SO4·7H2O， 3 g KH2PO4，10 mg維生素B1，蒸餾水定容至1 000 mL，pH 6.0。

(3)試劑與藥品。無水乙醇、異丙醇、次氯酸鈉、氯仿、異戊醇、巰基乙醇、CTAB、氯化汞、瓊脂糖、剛果紅、馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)、葡萄糖、硫酸鎂、磷酸二氫鉀、維生素B1、2×Taq PCR MasterMix 均購自天根生化科技(北京)有限公司，D2000 DNA Ladder及引物合成由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

(4)試驗(yàn)儀器。HIRAYAMA立式自動(dòng)壓力蒸汽滅菌鍋、SW-CJ-ZFD型雙人單面凈化工作臺、BS-2F數(shù)顯振蕩培養(yǎng)箱、BCD-539WT海爾冰柜、PCD-246T澳柯瑪冰柜、PCR自動(dòng)序列化分析儀、微量移液器、電子分析天平、DYY-III型電泳儀、紫外成像儀、NikonYS100光學(xué)顯微鏡、玻璃器皿等。

1.2 試驗(yàn)方法

(1)菌絲體顯微結(jié)構(gòu)觀察。取蒸餾水1滴，滴加在干凈的載玻片中央，用接種環(huán)以無菌操作挑取培養(yǎng)17、27、37 d的菌絲體少許，在液滴中輕輕涂抹均勻，并加蓋干凈蓋玻片，在玻片一端滴加2滴剛果紅，將吸水紙放在另一端使菌絲體充分染色后置于光學(xué)顯微鏡下觀察，每個(gè)菌株在1個(gè)視野中測量9～12次菌絲體寬度，統(tǒng)計(jì)鎖狀聯(lián)合數(shù)量，均設(shè)3次重復(fù)。

(2)菌絲體生物量測定。平均日生長速率測定：分別將8個(gè)黃綠卷毛菇菌株的菌絲體(0.5 cm×0.5 cm)接種至固體培養(yǎng)基，設(shè)3次重復(fù)，置于25 ℃ 培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng)30 d，利用游標(biāo)卡尺測量菌落直徑，以(菌落直徑÷30×100%)作為平均日生長速率測定依據(jù)。平均干重測定：將8個(gè)黃綠卷毛菇菌株的菌絲體(0.5 cm×0.5 cm)分別接入裝液量為100 mL(250 mL三角瓶)的液體培養(yǎng)基中，室溫下靜置培養(yǎng)，然后稱量菌絲體的干重。

(3)多基因系統(tǒng)發(fā)育分析。黃綠卷毛菇菌絲體及子實(shí)體DNA的提?。河脺缇蔫囎犹羧∵m量菌絲體到研缽中，子實(shí)體烘干后取干重0.05 g于研缽中，加入液氮研磨，再加入65 ℃預(yù)熱的2×CTAB(1 mL CTAB∶4 μL β-巰基乙醇)1.5 mL，將研磨液放入離心管中，65 ℃水浴1 h，每隔10 min搖勻1次，水浴結(jié)束后，4 ℃、12 000 r/min離心20 min；吸取上清液750 μL，加入等體積的氯仿—異戊醇(24∶1)(預(yù)冷)，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液600 μL，繼續(xù)加入等體積預(yù)冷的氯仿—異戊醇，4 ℃、12 000 r/min離心10 min；吸取上清液400 μL，加入上清液體積1/10的預(yù)冷KAC，再加入總體積2/3的預(yù)冷異丙醇，4 ℃靜置過夜，然后4 ℃、12 000 r/min離心5 min，棄上清液；加入300 μL的70%乙醇混勻，4 ℃、12 000 r/min離心5 min，重復(fù)2次；于4 ℃晾干后加入1×TE緩沖液50 μL溶解DNA，-20 ℃保存。

進(jìn)行ITS、LSU序列擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增引物如表1所示。

表1 PCR擴(kuò)增引物Tab.1 PCR amplification primers

擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，取5 μL PCR產(chǎn)物在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳，同時(shí)加入5 μL的D2000 DNA Ladder，120 V電泳30 min，用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行成像，合格產(chǎn)物送生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序，對測序返回結(jié)果使用BioEdit軟件進(jìn)行判斷修正，在NCBI數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行比對，identity>97%可視為處于同一屬。對所有測序結(jié)果用MEGA 7軟件構(gòu)建聚類分析樹狀圖，分析其親緣關(guān)系。

2 結(jié)果與分析

2.1 黃綠卷毛菇菌絲體顯微結(jié)構(gòu)觀察

圖1為培養(yǎng)17 d 時(shí)8株黃綠卷毛菇菌株在光學(xué)顯微鏡下的顯微結(jié)構(gòu)。由圖1可知，黃綠卷毛菇菌絲體粗細(xì)均勻，分支較少，為有隔菌絲，菌絲體寬度均勻，存在鎖狀聯(lián)合，可作為黃綠卷毛菇菌絲體寬度測量的時(shí)間節(jié)點(diǎn)。

圖1 不同黃綠卷毛菇菌株的顯微結(jié)構(gòu)Fig.1 Microstructure of Floccularia luteovirens stains

圖2為黃綠卷毛菇菌絲體寬度與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)聯(lián)性。

圖2 黃綠卷毛菇菌絲體寬度與培養(yǎng)時(shí)間的關(guān)聯(lián)性Fig.2 Correlation between mycelial width and culture time of Floccularia luteovirens

培養(yǎng)時(shí)間為17、27、37 d時(shí)，黃綠卷毛菇菌絲體寬度變化范圍為(6.31±1.58)～(17.03±3.61) μm，大部分(62.5%)菌絲體寬度與培養(yǎng)時(shí)間呈正相關(guān)，菌株F18-2、DTS13及SJC6與培養(yǎng)時(shí)間無相關(guān)性。

菌絲體生長到17 d，菌株DTS10及DTS13的菌絲體寬度最大，分別為(12.08±1.77)μm、(11.19±1.52)μm。菌絲體生長到27 d，菌株F18-3及DTS10的菌絲體寬度最大，分別為(14.44±1.99)μm、(13.88±4.14)μm；菌株WRQ18菌絲體寬度最小，為(6.31±1.58)μm。菌絲體生長到37 d，菌株DTS10的菌絲體寬度最大，為(17.03±3.61)μm；菌株F18-2及SJC6菌絲體寬度最小，分別為(10.05±1.33)μm、(9.78±2.24)μm。

表2為黃綠卷毛菇菌株在光學(xué)顯微鏡下菌絲體的寬度范圍。

表2 黃綠卷毛菇菌絲體的寬度范圍Tab.2 Width ranges of mycelia of Floccularia luteovirens

由表2可知，菌株HNHXF7菌絲體寬度范圍為(9.68±0.90)～(12.50±1.97) μm，菌株TJ菌絲體寬度范圍為(10.16±1.42)～(15.08±2.94) μm，菌株F18-2菌絲體寬度范圍為(10.03±1.62)～(10.05±1.33) μm，菌株F18-3菌絲體寬度范圍為(10.72±1.86)～(15.16±2.89) μm，菌株DTS10菌絲體寬度范圍為(12.08±1.77)～(17.03±3.61) μm，菌株DTS13菌絲體寬度范圍為(11.19±1.52)～(12.26±2.41) μm，菌株SJC6菌絲體寬度范圍為(9.78±2.24)～(10.42±1.98) μm，菌株WRQ18菌絲寬度范圍為(6.31±1.58)～(14.42±4.51) μm，黃綠卷毛菇菌絲體平均寬度范圍為(9.99±1.61)～(13.37±2.71) μm。

2.2 黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯(lián)合數(shù)量的相關(guān)性

表3為培養(yǎng)17～37 d的黃綠卷毛菇菌株的平均干重、平均日生長速率與鎖狀聯(lián)合數(shù)量。

由表3統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，8個(gè)黃綠卷毛菇菌株長勢可分為優(yōu)(HNHXF7、TJ、WRQ18)、良(F18-2、F18-3)、中(DTS10、DTS13、SJC6)3個(gè)層次，3個(gè)層次間差異顯著(P<0.05)。3個(gè)層次的黃綠卷毛菇菌絲體平均日生長速率分別為優(yōu)(0.50±0.12) mm/d、良(0.27±0.004) mm/d、中(0.19±0.03) mm/d，平均干重分別為優(yōu)(841.8±48.01) mg、良(706±50.24) mg、中(498.7±78.42) mg。

表3 黃綠卷毛菇菌絲體生物量及鎖狀聯(lián)合數(shù)量Tab.3 Mycelial biomass and the number of clamp connection of Floccularia luteovirens

菌株HNHXF7、TJ和WRQ18沒有觀察到鎖狀聯(lián)合，菌株F18-2、F18-3鎖狀聯(lián)合數(shù)量均為2個(gè)，菌株DTS10、DTS13及SJC6鎖狀聯(lián)合數(shù)量均為3個(gè)。

進(jìn)一步分析研究黃綠卷毛菇菌株長勢(平均日生長速率、平均干重)與鎖狀聯(lián)合數(shù)量的相關(guān)性,如圖3所示。

圖3 黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯(lián)合數(shù)量的相關(guān)性Fig.3 Correlation between mycelial growth and the number of clamp connections of Floccularia luteovirens

由圖3可知，黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯(lián)合數(shù)量呈負(fù)相關(guān)。鎖狀聯(lián)合數(shù)量越少，菌絲體生長速度越快。菌株HNHXF7、TJ與WRQ18在光學(xué)顯微鏡下未觀察到鎖狀聯(lián)合，其平均干重最大，為(841.8±48.01) mg，平均日生長速率為(0.50±0.12) mm/d；菌株F18-2與F18-3鎖狀聯(lián)合數(shù)量均為2個(gè)，平均干重為(706±50.24) mg，平均日生長速率為(0.27±0.004) mm/d；菌株DTS10、DTS13及SJC6鎖狀聯(lián)合數(shù)量均為3個(gè)，平均干重為(498.7±78.42) mg，平均日生長速率為(0.19±0.03) mm/d。

2.3 黃綠卷毛菇多基因系統(tǒng)發(fā)育分析

將8個(gè)黃綠卷毛菇菌株的ITS及LSU序列分別提交NCBI數(shù)據(jù)庫獲得登錄號(表4)，基于ITS和LSU系統(tǒng)發(fā)育樹見圖4。由圖4可知，菌株的長勢與進(jìn)化不存在相關(guān)性，除外圍菌株，8個(gè)菌株很好地與參照菌株序列聚集在一支。參照菌株序列與目的序列相似度為99%，標(biāo)尺指示為0.05步變化。

表4 黃綠卷毛菇序列提交登錄號Tab.4 Serial submission login numbers of Floccularia luteovirens

圖4 基于ITS和LSU的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on ITS and LSU genes

3 討論與結(jié)論

菌株的微觀形態(tài)是研究其菌絲體特性的基本方式之一，也是進(jìn)行菌種保藏、菌種優(yōu)化的必要條件[8]。本研究發(fā)現(xiàn)黃綠卷毛菇菌絲體粗細(xì)均勻，顯微鏡下可觀察到明顯的鎖狀聯(lián)合，菌絲體培養(yǎng)到17 d時(shí)，鎖狀聯(lián)合數(shù)量平均為1.625個(gè)，而鎖狀聯(lián)合是雙核菌絲的鑒定標(biāo)準(zhǔn)，是雙核菌絲細(xì)胞分裂的一種特殊形式，也是擔(dān)子菌的明顯特征之一[9]；菌絲體培養(yǎng)時(shí)間為17～37 d時(shí)，菌絲體寬度變化范圍為(6.31±1.58)～(17.03±3.61)μm，并伴有隔膜，這是擔(dān)子菌的典型顯微特征[10]。

本研究首次發(fā)現(xiàn)黃綠卷毛菇菌絲體長勢與鎖狀聯(lián)合數(shù)量呈負(fù)相關(guān)，鎖狀聯(lián)合數(shù)量越少，菌絲體生長速度越快。未觀察到鎖狀聯(lián)合的菌株HNHXF7、TJ及WRQ18平均日生長速率最快，平均干重最大。因此，鎖狀聯(lián)合數(shù)量是判斷黃綠卷毛菇菌株長勢的一個(gè)重要指標(biāo)，也是篩選長勢優(yōu)良菌株的重要參數(shù)。該結(jié)果與劉佳寧等[11]對黑木耳的研究結(jié)果有一定的相似性。

本研究僅從菌絲體外觀顯微結(jié)構(gòu)觀察鎖狀聯(lián)合的數(shù)量，沒有深入研究細(xì)胞內(nèi)部結(jié)果，今后可進(jìn)一步研究黃綠卷毛菇染色體核型等顯微特征。