倪 俊，靖恒燁，高玉婷，佘 容，楊曉燕,3,4*

(1.大理大學(xué) 天然抗氧化劑和抗氧化炎癥研究院，云南 大理 671003；2.大理大學(xué) 東喜瑪拉雅研究院，云南 大理 671003；3.中國三江并流區(qū)域生物多樣性協(xié)同創(chuàng)新中心，云南 大理 671003；4.大理大學(xué) 三江并流區(qū)域生物多樣性保護(hù)與利用云南省創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)，云南 大理 671003)

隨著人們生活水平的提高，抗氧化研究成為當(dāng)今的研究熱點(diǎn)。目前，已發(fā)現(xiàn)了大量抗氧化物質(zhì)，其中不乏一些效果優(yōu)良的抗氧化物質(zhì)，如水溶性的VC和脂溶性的VE，但隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)長期服用VC或VE會(huì)對人體產(chǎn)生副作用[1]。因此，在大健康時(shí)代，開發(fā)無毒、無害、易降解、對人體副作用更小、功效更持久的抗氧化物質(zhì)成為抗氧化研究領(lǐng)域的主流趨勢[2]。

魚腥草(HouttuyniacordataThunb.)，又名折耳根，屬三百草科(Saururaceae)蕺菜屬(Houttuynia)，廣泛分布于云南、四川和貴州等地[3]，是衛(wèi)生部確定的藥食同源植物之一[4]?，F(xiàn)代研究表明，魚腥草中的揮發(fā)油、多糖、多酚和黃酮等物質(zhì)均具有較強(qiáng)的抗氧化活性[5]。但是由于各地區(qū)生境不同，各地區(qū)的魚腥草在外觀、營養(yǎng)成分和含量上都會(huì)存在差異[6]。滇西北位于云南省西北部橫斷山區(qū)核心區(qū)域，是青藏高原至云貴高原的過渡地帶，擁有獨(dú)特的地形地貌和復(fù)雜的氣候條件[7]。為此，作者分別采用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇和水等溶劑對滇西北地區(qū)魚腥草的活性成分進(jìn)行提取，通過DPPH法、ABTS法、FRAP法對其抗氧化活性進(jìn)行綜合評價(jià)，并與其它地區(qū)魚腥草的抗氧化活性進(jìn)行比較，探究滇西北地區(qū)魚腥草作為天然抗氧化物質(zhì)的可能性和優(yōu)勢，也為抗氧化物質(zhì)產(chǎn)地的篩選提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料、試劑與儀器

新鮮滇西北地區(qū)魚腥草，購于大理古城菜市場。

石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、無水乙醇、DPPH、VC、ABTS、過二硫酸鉀、無水醋酸鈉、冰乙酸、HCl、FeSO4、TPTZ(三吡啶三嗪)等均為分析純。

722N型可見分光光度計(jì)，上海菁華科技儀器有限公司；RE-2000A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器，上海亞榮生化儀器廠；SCIENTZ-10N型冷凍干燥機(jī)、SB25-12DTD型超聲波清洗機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；HWS-26型電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；PX224ZH型電子天平，奧豪斯儀器有限公司；DZG-303A型超純水機(jī)，成都艾柯水處理設(shè)備有限公司；GZX-9070 MBE型數(shù)顯鼓風(fēng)干燥箱，上海博迅實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 魚腥草提取物的制備

將滇西北地區(qū)魚腥草洗凈，置于40 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥至恒重，粉碎，過60目篩，-20 ℃保存?zhèn)溆?。?zhǔn)確稱取 5份魚腥草粉末各50 g，置于500 mL錐形瓶中，按料液比1∶10(g∶mL)分別加入石油醚、乙酸乙酯、正丁醇、95%乙醇、蒸餾水，30 ℃、60 Hz超聲提取1 h，過濾，濾液減壓濃縮至干，用無水乙醇或反滲透純水溶解，再冷凍干燥至恒重。

1.3 魚腥草提取物的抗氧化活性評價(jià)

1.3.1 DPPH自由基清除能力的測定

DPPH自由基工作液的配制：精確稱取DPPH粉末1 g，用無水乙醇溶解后定容至1 L，得濃度為1 g·L-1的DPPH自由基儲(chǔ)備液，置于4 ℃冰箱冷藏，備用。吸取DPPH自由基儲(chǔ)備液2 mL，加入無水乙醇18 mL，配制100 mg·L-1的DPPH自由基工作液。

DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：用無水乙醇將DPPH自由基工作液稀釋成梯度濃度100 mg·L-1、80 mg·L-1、60 mg·L-1、40 mg·L-1、20 mg·L-1、10 mg·L-1、5 mg·L-1，測定517 nm處吸光度，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)；以DPPH自由基濃度為橫坐標(biāo)、517 nm處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

DPPH自由基清除率的測定[8]：取適量魚腥草提取物，用無水乙醇依次稀釋成濃度(g·L-1)分別為2、1.5、1、0.5、0.25、0.125、0.062 5的樣品溶液；分別將不同濃度的樣品溶液與100 mg·L-1DPPH自由基工作液按體積比1∶1混勻，37 ℃水浴0.5 h后，測定517 nm處吸光度，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)；以等濃度VC為陽性對照，同時(shí)設(shè)置樣品對照和空白對照。按式(1)計(jì)算DPPH自由基清除率：

(1)

式中：A1為樣品溶液+DPPH自由基工作液的吸光度；A2為樣品溶液+無水乙醇的吸光度；A0為無水乙醇+DPPH自由基工作液的吸光度。

1.3.2 ABTS自由基清除能力的測定

ABTS自由基工作液的配制：將7 mmol·L-1ABTS自由基溶液和4.9 mmol·L-1K2S2O8溶液按體積比1∶1混勻，避光反應(yīng)16 h，即為ABTS自由基母液，置于4 ℃冰箱冷藏，備用。取適量ABTS自由基母液，用無水乙醇稀釋至其在734 nm處的吸光度為0.70±0.02，即為ABTS自由基工作液。

ABTS自由基清除率的測定[9]：取適量魚腥草提取物，用無水乙醇依次稀釋成濃度(g·L-1)分別為1、0.75、0.5、0.25、0.125、0.062 5、0.031 25、0.015 625的樣品溶液；分別將不同濃度的樣品溶液與ABTS自由基工作液按體積比1∶1混勻，室溫下反應(yīng)6 min后，測定734 nm處吸光度，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)；以等濃度VC為陽性對照，同時(shí)設(shè)置樣品對照和空白對照。按式(2)計(jì)算ABTS自由基清除率：

(2)

式中：A1為樣品溶液+ABTS自由基工作液的吸光度；A2為樣品溶液+無水乙醇的吸光度；A0為無水乙醇+ABTS自由基工作液的吸光度。

1.3.3 總抗氧化能力的測定

FRAP工作液的配制：將0.3 mol·L-1醋酸緩沖液(pH值3.6)、10 mmol·L-1TPTZ溶液、20 mmol·L-1FeCl3溶液按體積比10∶1∶1混勻，即為FRAP工作液。

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：取0.1 mL 0.1～1.6 mmol·L-1的FeSO4標(biāo)準(zhǔn)溶液與2.4 mL FRAP工作液混勻，37 ℃水浴10 min后，測定593 nm處吸光度；以FeSO4濃度為橫坐標(biāo)、593 nm處吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

總抗氧化能力的測定[10]：取適量魚腥草提取物，用無水乙醇依次稀釋成濃度(g·L-1)分別為20、15、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312 5的樣品溶液。取0.1 mL不同濃度的的樣品溶液與2.4 mL FRAP工作液混勻，37 ℃水浴10 min后，測定593 nm處吸光度，每個(gè)濃度設(shè)置6個(gè)重復(fù)；同時(shí)設(shè)置空白對照。以FRAP值表征總抗氧化活性，以1 mmol·L-1FeSO4溶液為標(biāo)準(zhǔn)，當(dāng)樣品的總抗氧化活性達(dá)到同樣吸光度時(shí)為一個(gè)FRAP值。按式(3)計(jì)算FRAP值：

(3)

式中：A1為樣品管的吸光度；A2為空白對照管的吸光度；A0為1 mmol·L-1FeSO4溶液的吸光度。

1.4 數(shù)據(jù)分析

采用GraphPad Prism 7.00軟件和Excel軟件繪制魚腥草提取物濃度與抗氧化活性的關(guān)系曲線，并采用SPSS 20.0軟件計(jì)算各提取物和VC對DPPH和ABTS自由基的清除能力(IC50)，最后通過計(jì)算提取物與VC 的IC50比值得到提取物的比活性。

2 結(jié)果與討論

2.1 DPPH自由基清除能力

2.1.1 DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1)

由圖1可知，DPPH自由基濃度在5～100 mg·L-1范圍內(nèi)時(shí)，與吸光度線性關(guān)系較好，線性回歸方程為：y=0.0198x-0.0433，R2=0.998。

圖1 DPPH自由基標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.1.2 魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除能力(圖2)

由圖2可知，魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除率均隨提取物濃度的增加逐漸升高，但對DPPH自由基的清除能力各異。相比較而言，95%乙醇提取物對DPPH自由基的清除能力最強(qiáng)(IC50值為0.45 g·L-1，相對于VC的比活性為1.4%)。在相同條件下，各提取物對DPPH自由基清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?5%乙醇提取物>水提取物>正丁醇提取物>石油醚提取物>乙酸乙酯提取物。

圖2 魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除能力

通過對魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基的清除率進(jìn)行差異性分析(圖3)發(fā)現(xiàn)，95%乙醇提取物、石油醚提取物和乙酸乙酯提取物分別與其它4種提取物的IC50值均存在顯著性差異，水提取物與正丁醇提取物的IC50值差異不顯著，但與其它3種提取物的IC50值均存在顯著性差異。

圖3 魚腥草不同溶劑提取物對DPPH自由基清除率的差異性分析

2.2 ABTS自由基清除能力(圖4)

由圖4可知，魚腥草不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除率均隨提取物濃度的增加逐漸升高，呈劑量效應(yīng)關(guān)系，但對ABTS自由基的清除能力各異。95%乙醇提取物對ABTS自由基的清除能力最強(qiáng)(IC50值為0.025 6 g·L-1，相對于VC的比活性為28.6%)。在相同條件下，各提取物對ABTS自由基清除能力的強(qiáng)弱順序?yàn)椋?5%乙醇提取物>乙酸乙酯提取物>正丁醇提取物>石油醚提取物>水提取物。

圖4 魚腥草不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除能力

通過對魚腥草不同溶劑提取物對ABTS自由基的清除率進(jìn)行差異性分析(圖5)發(fā)現(xiàn)，石油醚提取物和水提取物分別與其它4種提取物的IC50值均存在顯著性差異，乙酸乙酯提取物與正丁醇提取物、95%乙醇提取物的IC50值差異不顯著，但乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、95%乙醇提取物與其它2種提取物的IC50值均存在顯著性差異。

圖5 魚腥草不同溶劑提取物對ABTS自由基清除率的差異性分析

2.3 總抗氧化能力

2.3.1 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖6)

圖6 FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線

由圖6可知，F(xiàn)eSO4溶液濃度在0.1～1.6 mmol·L-1范圍內(nèi)時(shí)，與吸光度線性關(guān)系較好，線性回歸方程為：y=0.6012x+0.0429，R2=0.9937。

2.3.2 魚腥草不同溶劑提取物的總抗氧化能力(圖7)

圖7 魚腥草不同溶劑提取物的總抗氧化能力

由圖7可知，魚腥草不同溶劑提取物的總抗氧化能力存在差異，整體均隨提取物濃度的增加逐漸升高。當(dāng)濃度為20 g·L-1時(shí)，95%乙醇提取物的總抗氧化能力最強(qiáng)，F(xiàn)RAP值達(dá)到了3.59。在濃度為20 g·L-1下，各提取物的總抗氧化能力強(qiáng)弱順序?yàn)椋?5%乙醇提取物>正丁醇提取物>水提取物>乙酸乙酯提取物>石油醚提取物。

通過對魚腥草不同溶劑提取物的總抗氧化能力進(jìn)行差異性分析(圖8)發(fā)現(xiàn)，乙酸乙酯提取物、石油醚提取物和水提取物分別與其它4種提取物的FRAP值均存在顯著性差異，95%乙醇提取物與正丁醇提取物的FRAP值差異不顯著，但與其它3種提取物的FRAP值均存在顯著性差異。

圖8 魚腥草不同溶劑提取物總抗氧化能力的差異性分析

2.4 討論

2.4.1 滇西北地區(qū)魚腥草與其它地區(qū)魚腥草的抗氧化活性比較

在中藥材活性成分的研究中，產(chǎn)地是其活性的關(guān)鍵影響因素之一。對相關(guān)研究報(bào)道進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，滇西北地區(qū)魚腥草95%乙醇提取物的抗氧化能力略低于鄂西北地區(qū)魚腥草的[11]，略強(qiáng)于湖南魚腥草的[12]；其水提取物的抗氧化能力低于廣西魚腥草的[13]，強(qiáng)于四川魚腥草的[14]；其石油醚提取物的抗氧化能力強(qiáng)于江西魚腥草的[15]。由此可見，地區(qū)差異會(huì)影響魚腥草的抗氧化活性成分，整體來說滇西北地區(qū)魚腥草的抗氧化活性較高，這可能是由于，滇西北地區(qū)的高海拔、強(qiáng)光照、低氧含量和晝夜溫差大等條件提高了該地區(qū)魚腥草的抗氧化活性。因此，云貴高原地區(qū)和青藏高原地區(qū)可能是天然抗氧化物質(zhì)篩選的理想產(chǎn)地。當(dāng)然，本研究結(jié)果僅是粗提物的評估結(jié)果，粗提物成分復(fù)雜，無法確定活性物質(zhì)，同時(shí)粗提物中可能存在影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的物質(zhì)。如需進(jìn)一步闡明不同地區(qū)魚腥草的抗氧化活性差異，還需對粗提物進(jìn)行分離純化，確定其發(fā)揮抗氧化效果的有效成分及其含量差異等。

2.4.2 提取溶劑對魚腥草抗氧化活性評價(jià)的影響

現(xiàn)階段對魚腥草抗氧化活性的研究多集中在魚腥草的石油醚提取物的揮發(fā)油成分[15]、乙醇提取物多酚成分[16]和水提取物多糖成分[17]。從本研究結(jié)果來看，魚腥草5種提取物均具有較強(qiáng)的抗氧化活性且存在差異，其中95%乙醇提取物的抗氧化活性最強(qiáng)。一方面可能是由于，魚腥草多酚含量高，而多酚易溶于乙醇[18]，導(dǎo)致其粗提物中多酚含量高；另一方面，也可能是由于多酚的抗氧化活性高于其它提取溶劑所得活性成分，如茶多酚的抗氧化能力是VE的10～20倍，是VC的100倍[19]。本研究中，乙酸乙酯提取物和正丁醇提取物也表現(xiàn)出了較強(qiáng)的抗氧化活性，而這2種提取物主要含黃酮和苷類化合物[20]，而糖苷類化合物和花青苷類化合物均具有抗癌、抗炎和抗氧化等功效[21]。

2.4.3 抗氧化活性評價(jià)指標(biāo)的選擇探究

從本研究結(jié)果來看，魚腥草同種提取物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力存在差異，如95%乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS自由基的IC50值分別為0.45 g·L-1和0.025 6 g·L-1。主要是因?yàn)椋珼PPH自由基的反應(yīng)機(jī)制是基于氫原子轉(zhuǎn)移機(jī)制，而ABTS自由基的反應(yīng)機(jī)制同時(shí)包括了氫原子轉(zhuǎn)移機(jī)制和單電子轉(zhuǎn)移機(jī)制[22]，因此，在相同濃度下，ABTS自由基活性高于DPPH自由基的[23]。另外，乙酸乙酯提取物對ABTS自由基的清除能力高于水提取物的，但乙酸乙酯提取物對DPPH自由基的清除能力卻低于水提取物的。這說明對于成分復(fù)雜樣品的抗氧化活性評價(jià)不應(yīng)基于單一的抗氧化模型，應(yīng)進(jìn)行幾種體外抗氧化實(shí)驗(yàn)來綜合評價(jià)樣品的抗氧化活性[24]。同時(shí)，DPPH、ABTS自由基都屬于氮自由基[25-26]且是非人體自由基[27]，若要對樣品進(jìn)行綜合、有效的評價(jià)，則需增加如羥基自由基、超氧陰離子自由基等人體自由基指標(biāo)。故建議對于樣品抗氧化能力的測定應(yīng)采用多種指標(biāo)綜合評價(jià)。

3 結(jié)論

采用DPPH法、ABTS法、FRAP法對滇西北地區(qū)魚腥草石油醚提取物、乙酸乙酯提取物、正丁醇提取物、95%乙醇提取物和水提取物的抗氧化活性進(jìn)行評價(jià)。結(jié)果表明，魚腥草5種提取物均具有一定的抗氧化活性，其中95%乙醇提取物對DPPH自由基和ABTS自由基的清除能力最強(qiáng)，IC50值分別為0.45 g·L-1、0.025 6 g·L-1，與VC的比活性分別為1.4%、28.6%；95%乙醇提取物的總抗氧化能力也最強(qiáng)，F(xiàn)RAP值為3.59。3種評價(jià)結(jié)果顯示滇西北地區(qū)魚腥草具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性，可作為天然抗氧化物質(zhì)開發(fā)的優(yōu)選對象。